Раскраска кляксы: Раскраска клякса | Детские раскраски, распечатать, скачать

Содержание

Раскраски для взрослых: постигни дзен в кляксе, приручи линию и подружись с дудлами

Творчество

Раскраски для взрослых: постигни дзен в кляксе, приручи линию и подружись с дудлами

16 июня 2016 6 839 просмотров


Юлия Скрипник

Сначала вы делаете воодушевленной страницу. А потом — себя самого и мир вокруг. Посмотрите сами на эти необычные раскраски для взрослых и творческие блокноты — и вы разделите наш восторг.

Одна про дудлы, про толпы невероятных дудлов. Вы слегка ошалеете от их безудержного веселья! Вторая — о поиске смысла и познании мира через кляксы. А третья и вовсе про творческий беспорядок — поможет расслабиться и обрести счастье в мелочах. И в заключении — творческий блокнот: он заставит вас удивиться собственной креативности.

Nulla dies sine linea!

Сборище дудлов

Если вам надоели геометрические узоры, котики и цветы — эта книга для вас. В новой раскраске Зиффлина и иллюстратора Лея Мелендреса еще больше замысловатых паттернов, сверхъестественных существ и уникальных миров. Дракон, рыцарь, йетти и сборище крейзанутых дудлов — подходящая компания для отличного вечера.

Каждый рисунок — целая вселенная со своей историей и героями.

И этой красоты — 50 страниц. Бумага плотная и выдержит любой инструмент: можно раскрашивать красками, фломастерами, гелевыми ручками, карандашами, маркерами. Каждая композиция детально прорисована. Подходит и взрослым, и детям. Хорошее настроение и драйв во время раскрашивания гарантированы. А законченные листы на стене в рамке будут вызывать улыбку.

Тот, кто пройдет про тропе дудлов, уже никогда не будет прежним ;). Источник — @miftvorchestvo.

Хирамеки

Каждая клякса — это вдохновение. Каждая линия — свободна. Откройте свое воображение. «Хирамеки» в переводе с японского означает «своеобразный стиль», «особый отпечаток», «место, где встречаются каракули и воображение». Проще говоря, это искусство превращения случайной кляксы во что-то удивительное.

Хирамеки заключает в себе два основных вида мыслительного процесса: поиск смысла и познание мира. В маленькой кляксе скрыта магия: ее суть становится явной, стоит лишь добавить черточки и точки так, как подсказывает фантазия.

Если верить тем, кто говорит, что счастье в мелочах, то эта книга должна долго развлекать ваши глаза, руки и голову. А еще почти на каждой странице есть сумаcшедшие забавные хокку.

Смотрите по сторонам туда-сюда: где он, а где она?
Пучок волос — раз, клок волос — два,
вот — шевелюра, а вот — борода.

Хирамеки разделены на 7 уровней — от простых до самых сложных. Вы сможете увидеть в кляксах лица, предметы, животных и даже пришельцев. Настоящее пиршество для вашей фантазии. На каждой странице — воодушевление и радость.

Посмотрите на эти кляксы и позвольте вашему воображению творить магию. Источник — @miftvorchestvo.

Творческий беспорядок

Творческий беспорядок — это уютно и очень красиво. Эта раскраска о любви к мелочам жизни поможет увидеть красоту в повседневных вещах, привести мысли в порядок и расслабиться. Иллюстрации насыщены мелкими деталями: книги, одежда, посуда, носки. Все как в жизни — интересно и красочно!

Разбирать запасы — занятие медитативное, то же самое можно сказать и о раскрашивании.

Это успокаивающее, расслабляющее занятие и для педантов, и для любителей бардака. Вас ждут очаровательные и забавные предметы, которые можно найти в любой квартире — кофейные чашки и солнечные очки, забытые туфли, парочка любовных писем.

Просто откройте «Творческий беспорядок» и добавьте цвета! — Фото@miftvorchestvo

Линия — это точка, которая пошла погулять

Необычный творческий блокнот для рисования, на создание которого вдохновил жизненный девиз художника-абстракциониста Пауля Клее — «Nulla dies sine linea» («Ни дня без линии»). В нем созданы все условия, чтобы удивиться собственной креативности.

А как бы вы изобразили красный, который радуется синему? Да-да, попробуйте проделать это прямо сейчас -)

Внутри — классные иллюстрации и полезные советы. На каждой странице вы найдете инструкции, которые можно трактовать по-разному, что дает максимальную свободу творчества. Художественные навыки не нужны. Чтобы начать — просто освободите ум и следуйте за интуицией.

Вот примеры заданий:

  • Представьте и нарисуйте, что фиолетовый удивился, увидев оранжевый
  • Дорисуйте к красному маку зеленую траву
  • Сделайте эту страницу воодушевленной
  • Изобразите кошку десятью, пятью, одной линией
  • Нарисуйте круги, совершающие марафонский забег
  • Как бы выглядел цветок-астронавт?
  • Нарисуйте свое любимое воспоминание.
Составьте список того, что вас вдохновляет. Нас, например, — этот блокнот -)

Для того чтобы получать удовольствие от рисования, совсем необязательно уметь рисовать. Научившись творить без боязни ошибиться, вы почувствуете себя свободным. Раскрашивайте, творите и радуйтесь лету!

‎App Store: Pixel Art: Раскраска по цифрам

Расслабьтесь и получите удовольствие, раскрашивая по номерам! Выбирайте из более чем 10 000 картинок или создавайте свои пиксельные изображения.

Особенности:

- Выбирайте из множества картинок на любой вкус: Мандалы, Узоры, Животные, Птицы, Цветы, Города, Еда и многие другие;
- Раскрашивайте новые картинки - наша коллекция обновляется каждую неделю;
- 3D-раскраска. Получите превосходные впечатления от раскрашивания 3D-изображений;
- Pixel Art камера. Делайте селфи или используйте любые фото для раскрашивания собственных пиксельных картинок!

- Используйте различные инструменты раскраски: Волшебную палочку, чтобы раскрасить несколько соседних ячеек с одним и тем же числом, или Цветную кляксу, чтобы раскрасить несколько соседних ячеек с любым числом;
- Делитесь вашим таймлапс-видео с друзьями по электронной почте и в социальных сетях одним касанием.
- Оцените понятный и удобный дизайн Pixel Art. Рисовать по номерам - это интересно и просто!

Раскрашивание еще никогда не было столь простым! Никаких хлопот с подбором цветов. Просто расслабьтесь и наслаждайтесь!

Pixel Art Премиум
Подписка Pixel Art Премиум позволяет разблокировать все функции, получить доступ к ежедневным обновлениям и убрать рекламу.

Оплата будет списана из аккаунта Apple ID при подтверждении покупки. Подписка продлевается автоматически, если автоматическое продление не отключено как минимум за 24 часа до конца текущего периода. Плата за продление списывается со счета за 24 часа до конца текущего периода. Вы можете управлять подписками. Автоматическое продление подписки можно отключить в настройках аккаунта Apple ID. Для получения дополнительной информации перейдите по ссылке https://support.apple.com/ru-ru/HT202039. Неиспользованная часть бесплатного пробного периода аннулируется после приобретения подписки.

Лицензионное соглашение: https://easybrain.com/terms.html
Политика конфиденциальности: https://easybrain.com/policy.html

Раскраска для взрослых – Деньги – Коммерсантъ

Наст Дж. Эффект визуализации (Idea Mapping: How to Access Your Hidden Brain Power, Learn Faster, Remember More and Achieve Success in Business).— М.: Эксмо, 2008.— 256 с.

Джейми Наст — профессиональный дрессировщик менеджеров. Забудьте, пишет автор, о линейной организации информации. Давайте законспектируем сложную мысль в схеме-картинке — это и емко, и логично, и наглядно. Типовая картинка по виду похожа на нейрон: это клякса с многочисленными лучиками, утончающимися по мере отдаления от центра. В середине кляксы располагается главная идея, на толстых участках веток — ее ключевые элементы, на тоненьких — дальнейшие подробности. Все это в идеале должно быть раскрашено, а потренироваться можно на самой книге — это предусмотрено автором. Читать схему предлагается от центра и далее по часовой стрелке.

Не совсем понимаю, почему этот отличный прикладной прием должен сделать из читателя успешного бизнесмена. Во всяком случае, все карты, иллюстрирующие движение к успеху, невообразимо мутны. Например, логическая линия "работа — стремления — лидерство — успех" не воспринимается иначе как мантра для самогипноза. А вот карты лекций и докладов, напротив, вполне внятны. Правда, подозреваю, что студенты уже давно и с успехом рисуют что-то подобное для осмысления громоздкой информации: сама рисовала цветную схему боевых действий гражданской войны.

Тем не менее госпожа Наст пытается внушить читателю, что ее метод можно успешно применить к чему угодно. Оно и понятно, ведь универсальные вещи лучше продаются: редкий клиент устоит перед возможностью купить крысоловку, которая элегантно раскладывается в яйцерезку. В некий момент (стр. 205) автор намекает, что карты и схемы помогут вам похудеть. А в последних главах советует дарить людям их персональные карты (биографию, изложенную в кляксах), составлять заранее рисованные планы телефонных звонков, а также при помощи карт определять свои цели. Последнее — вообще какой-то мистический ритуал. "По старой традиции,— объясняет автор,— некоторые люди определяют свои цели каждый год. Вероятно, стоит определять цели ежемесячно или еженедельно". Возможно, автор пытается включить в целевую аудиторию людей с фантастически амебообразным устройством психики, которые не в состоянии понять, зачем они, собственно, эту карту рисуют.

Но в целом, если отмести коммерческие перегибы (в том числе главу 7, посвященную рекламе некоего софта Mindjet, который как нельзя лучше подходит для рисования ментальных карт), книжка небессмысленная. Ее единственным системным изъяном выглядит то, что хваленый трехмерный и объемный метод изложен тем самым линейным способом, против использования которого предостерегает автор. "Люди запоминают 10% услышанного, 20% прочитанного и около 80% увиденного и сделанного",— сообщается в предисловии. Таким образом, на усвоение более 20% автор и не рассчитывает.

В общем, резюме такое. Не знаю, как менеджерам, а вот студентам-авральщикам я бы эту книжку порекомендовала. А для целей обучения деловому успеху она полезна примерно в той же мере, что и стакан морковного сока: точно не повредит.

Наталья Скорлыгина


Обжора клякса играть. Игра грязная клякса

Описание флеш игры

Клякса 2 - Веселая рисовалка

Blobink 2

Клякса 2

Игра «Клякса 2» увлекает с первых секунд после запуска простотой, новизной задумки и нескучным музыкальным сопровождением. Жизнерадостная клякса стремится превратить окружающий черно-белый мир в цветную картинку. Помимо повсеместного раскрашивания главному персонажу игры приходится выполнять миссии: спасать, помогать.

Играть в «Кляксу 2» можно одному и вдвоем. Игра на двоих предполагает разделение участков картинки и задач уровня. В интерактивную раскраску понравится играть детям с родителями и представителям творческих профессии. Простая забавная флешка убьет время и поможет запустить процесс генерации творческих идей, не зря же терапия рисованием так популярна сегодня.

Как играть

Представьте себя в роли волшебника с палочкой. Прикосновение магического инструмента делает безжизненные серы дома и машины разноцветными, равно как и касание кляксы.

Запустите игру, выберите режим — на время, для двоих, для одного — и отправляйтесь в чудесное путешествие в сказку-раскраску.

Управление

Управлять передвижением краски первому игроку предстоит при помощи клавиш-стрелок. Второй игрок будет управлять своей кляксой с буквенного крестика: A, S, D и W.

Найдите время на то, чтобы увидеть мир в цвете и принять участие в его раскрашивании — запускайте игру «Клякса 2».

Восхитительная и очень красочная игра «Клякса 2» поражает воображение и развивает фантазию. Приключения классически разделены на три части «от простого к сложному». Разделяют действия уровни с боссами. В этой флешке вы – трудолюбивая и жизнерадостная клякса, цель которой – раскрасить весь окружающий мир. Все, до чего маленький невзрачный персонаж прикасается, приобретает цвет. Нажав на фонтанчик, вы подарите оттенок фону, – на некоторых уровнях именно это место является завершающей точкой. Но сложно назвать эту игру просто раскраской – здесь есть препятствия, которые нужно обходить, например, воду. В более «продвинутых» уровнях нужно спасать друзей, лавировать между речными потоками, ориентироваться в полной темноте и обретать все новые сверхспособности. Эта замысловатая флешка – целый мир для тех, кто хочет поднять себе настроение.

Не можете пройти уровень в одиночку? Подключите друга и оцените возможность игры на двоих. Можно разделиться и окрашивать разные части картинки, а также выполнять независимые функции – один окрашивает, другой спасает друга Кляксы, например. А уровни с боссами превратятся для вас в настоящую гонку на выживание, которую сложно пройти с первого раза. Кстати, если один из вас ошибется (натолкнется на препятствие, попадется боссу или неудачно обойдет воду), то уровень завершится для обоих персонажей. Но не расстраивайтесь – жмите пробел и продолжайте играть с того же места, и, в дальнейшем, попытайтесь проходить приключения в команде.

То, что все не любят грязь, никогда не было секретом. Да, совсем-совсем не любят и старательно избавляются от любой грязи. А вы когда-нибудь задумывались, а как относится грязь к всеобщей нелюбви и стремлению к чистоте? Грязь старается всячески избежать столкновений с ревнителями чистоты и их помощниками – всеми этими губками, веничками, пылесосами. Вашим персонажем станет грязная капля. Ей стало известно, что запланирована Большая Уборка. А это значит, всей собравшейся грязи придет конец. Вот и пылесос – этот кошмар и первый враг грязи, уже показался! Этого монстра грязная капля боится больше всего. Спасите бедняжку, пока не стало поздно!
Вообще-то капля давно собиралась покинуть эти места ради путешествия в далекий Голливуд. Но для этого требуется помощник – вы.

Как играть?

Капля сможет стать кинозвездой, если сумеет ускользнуть. Но билет на автобус стоит денег и их придется срочно собирать. Вам придется метаться между разбросанным всюду мусором и цеплять каждую монетку. Торопитесь, пылесос уже совсем рядом! Да и на автобус капелька может просто не успеть. Двигайтесь быстро, точно перемещая персонаж в безопасные места. На каждом уровне вас ожидает новая локация, поэтому повторений не будет.

На нашем игровом сайте мы предлагаем широкий выбор бесплатных игр для всей семьи. От классических игр на ловкость типа Клондайк до сверхпопулярных гонок в стиле Uphill Rush. У нас есть всё. Бесплатные флеш игры являются самым быстро развивающимся сегментом веб-развлечений, и каждый день мы добавляем новые захватывающие игры .

Вы можете выбрать из десятков категорий бесплатных игр . Логические игры включают в себя классику в стиле Маджонг ; Бродилки проверят вашу реакцию и навыки навигации; Экшн игры помогут вам снять напряжение; Игры на ловкость типа Bubble Shooter помогут расслабиться; А мультиплеер игры проверят ваши навыки в соревнованиях со всем миром.

Мы сами разрабатываем новые бесплатные игры на нашем сайте, поэтому вы всегда можете быть уверены в их качестве. Игры для девочек, для мальчиков, для мам, пап, бабушек и дедушек – всё это вы найдете только на сайт. Это ваш центр бесплатных флеш онлайн игр !

В наши игры всегда можно играть бесплатно онлайн. Мы строго контролируем содержимое сайта, поэтому наши flash игры предназначены для всех. Приятной игры!

Сайт всегда предлагает широчайший выбор бесплатных игр онлайн. Совершенно новые игры появляются на сайте ежедневно!

сайт всегда предлагает широчайший выбор бесплатных игр онлайн. Совершенно новые игры появляются на сайте ежедневно!

РАСКРАСКА – КАРКАС ДЕТСКОГО РАЗВИТИЯ.

Раскрашивание относится к детским развивающим занятиям. Этот процесс играет огромную роль в формировании многочисленных навыков.
Часто мы воспринимаем раскраски как инструмент развития мелкой моторики, или вовсе как просто занятное времяпрепровождение. Однако раскраски способны на большее!

Считается, что главное предназначение раскраски – это тренировка детской руки. Несомненно, раскрашивание способствует развитию мелкой моторики, которая в свою очередь связана с нервной системой, зрением, вниманием, памятью и вообще развитием личности в целом. Одна из областей науки считает, что это связано с тем, что в головном мозге речевой и моторный центры находятся очень близко друг к другу, и, развивая один, вы автоматически активизируете другой. Это действительно так, но не все так просто. «Скажи мне, и я забуду. Покажи мне, и я запомню. Дай мне сделать самому, и это останется со мной навсегда», - гласит древняя китайская пословица. На кончиках пальцев расположены особые нервные окончания, передающие информацию об этом мире в мозг. Поэтому все, что человек делает собственными руками, активизирует сразу все центры, непосредственным образом влияя на организм и личность в целом. Вот почему, например, художественная арт-терапия так популярна сегодня.
Когда ребенок раскрашивает какой-то объект, он развивает свой ум – происходит накопление и закрепление знаний о форме и цвете. Также развивается наблюдательность и терпение. Ведь нужно потратить достаточно много сил, чтобы научиться контролировать нажим карандаша или фломастеры, чтобы не разорвать бумагу или не наставить клякс. Это занятие дисциплинирует ребенка, учит выполнять монотонную работу, концентрироваться и доводить начатое дело до конца, воспитывает усидчивость, аккуратность и самостоятельность.
Раскраски — это верный путь в мир изобразительного искусства и творчества. В процессе раскрашивания ребенок имеет возможность самостоятельно выбирать цвета, комбинировать их между собой. Это творческий процесс, который способствуют развитию фантазии ребенка и сам по себе является «волшебным» для любого малыша, ведь можно раскрасить картинку как положено, а можно придать ей совершенно фантастический вид.
По тому, какие цвета ребенок выбирает и как он их смешивает друг с другом, можно делать выводы о его психоэмоциональном состоянии.
Раскрашивание успокаивает нервную систему, позволяя снять излишнее напряжение и угомонить даже слишком активного ребенка. Это хороший способ переключить его внимание или избавиться от стрессовой ситуации.

Начинать этот увлекательный и полезный процесс можно даже в самом раннем возрасте, некоторые родители дают простые раскраски детям до 2-х лет. Первая раскраска ребенка должна иметь 2-3 знакомых для него объекта, желательно крупного размера. Раскрашивать такие вещи можно начинать руками, например, используя специальные пальчиковые краски.
Никогда не ждите, что с первых занятий малыш будет рисовать в рамках контура. Всегда проходит некоторое время, прежде чем ребенок понимает, что именно требуется и начинает стараться делать правильно. Важно обязательно хвалить свое чадо, и только иногда указывать ему на недостатки в его работе. Процесс раскрашивания, как и любой другой, предполагает совершенствование, как в сложности рисунка, так и в выборе инструментов. Ребенку постарше следует предложить карандаши или фломастеры – эти два инструмента наиболее полезны ему для будущего обучения письму. И вначале рекомендуется использовать тренажеры для письма, разработанные специально для того, чтобы ребенок изначально правильно держал пишущий инструмент. От правильности захвата зависит как будущий почерк, так и правильный сигнал от нервных окончаний. Если по каким-то причинам, нет возможности приобрести тренажер для письма, то специалисты рекомендуют использовать треугольные фломастеры или карандаши, особенно это касается ранних стадий. Учите ребенка делать выбор с самого начала, не заставляйте его раскрашивать то, чего он не хочет – очень важно поддерживать его умственное здоровье, давая ему возможность заниматься более интересным для себя делом.
Раскрашивание можно рассматривать и как прекрасный метод обучения. Используя раскраски можно изучать не только цвета и формы, но и цифры, буквы, учиться читать (если ваша раскраска сделана, например, по мотивам любимой сказки), познавать другие миры и рассказывать свои собственные истории. Поскольку большинству деток раскрашивание нравится, такое обучение будет эффективным.
Тем не менее, чтобы достичь положительных результатов при раскрашивании, необходимо грамотно подходить к этому вопросу. Здесь следует отметить одно из наиболее важных правил, которое заключается в подборе раскрасок из учета возраста ребенка. Современный рынок пестрит предложениями, и, к сожалению, не все раскраски пригодны для деток. Так, например, на ранних стадиях не стоит останавливаться на раскрасках по мотивам западных мультфильмов. Эта анимация создана взрослыми людьми и в большинстве своем для взрослых. Соответственно, если вы все же покупаете такой материал своим детям, то старайтесь давать его в более взрослом возрасте. Так же стоит относиться внимательнее к отличиям в культурном и этническом отношении. Детский мозг может не справится с различиями в том, что он видит в реальности и тем, что может быть представлено материалами другой культуры. Относитесь внимательно, объясняйте ребенку сюжеты, которые он раскрашивает, но не ограничивайте его в познании другого.

Аудиосказки для детей слушать онлайн, детские аудиосказки

Лунтик и его друзьяСарра Ансон2:30:4237890
КолобокРусская народная04:2934030
Волшебник Изумрудного городаАлександр Волков5:18:1531220
Цветик-семицветикВалентин Катаев19:2820280
Аленький цветочекАксаков Сергей Тимофеевич41:2719270
Карлсон, который живёт на крышеАстрид Линдгрен3:23:1218540
Всё ПростоквашиноУспенский Эдуард4:48:0318480
Золотой ключик, или Приключения БуратиноАлексей Николаевич Толстой56:0918370
Маша и медведьРусская народная06:1118130
Витя Малеев в школе и домаНиколай Носов5:16:0317960
Снежная королеваГанс Христиан Андерсен1:08:3215750
Умная собачка СоняАндрей Усачёв1:08:5015540
Белоснежка и семь гномовБратья Гримм10:2315240
Винни-Пух и все-все-всеАлан Александр Милн1:37:0514920
ДюймовочкаГанс Христиан Андерсен29:0514320
СмешарикиАлексей Лебедев7:46:5914190
Приключения Тома СойераМарк Твен8:17:3914030
Волк и семеро козлятБратья Гримм08:0513690
Карлик НосВильгельм Гауф46:3313650
Сказка о царе СалтанеАлександр Сергеевич Пушкин44:3613330
Карлсон, который живет на крыше, проказничает опятьАстрид Линдгрен4:10:4912920
Бременские музыкантыБратья Гримм07:5112830
Незнайка в Солнечном городеНиколай Носов8:46:5812650
Сказка о мёртвой царевне и семи богатыряхАлександр Сергеевич Пушкин28:0912490
ТеремокРусская народная04:3812150
РусалочкаГанс Христиан Андерсен1:04:2711910
Три поросенкаСергей Михалков18:2811250
АйболитКорней Иванович Чуковский08:2810970
Золушка или хрустальная туфелькаШарль Перро21:0010930
В стране невыученных уроковЛия Гераскина2:01:1610550
Приключения Эмиля из ЛённебергиАстрид Линдгрен7:32:1810480
Пеппи поселяется в вилле КурицаАстрид Линдгрен2:53:4210440
Три медведяРусская народная06:519750
Волк и козлятаРусская народная07:029730
Василиса ПрекраснаяРусская народная29:499690
Алиса в стране чудесЛьюис Кэрролл1:30:229610
Маленький принцАнтуан Де Сент-Экзюпери1:12:579520
Приключения Незнайки и его друзейНиколай Носов5:03:569150
Красная ШапочкаШарль Перро05:058930
Незнайка на ЛунеНиколай Носов14:09:598880
Иван-царевич и серый волкРусская народная17:158400
Сказка о рыбаке и рыбкеАлександр Сергеевич Пушкин12:168110
Карлсон, который живёт на крыше, опять прилетелАстрид Линдгрен3:45:238010
РапунцельБратья Гримм08:437820
Кошкин домСамуил Маршак35:167420
Кот в сапогахШарль Перро14:037100
Щелкунчик и мышиный корольАмадей Гофман55:377080
МойдодырКорней Иванович Чуковский05:347000
Папа, мама, бабушка, восемь детей и грузовикАнне-Катарина Вестли13:20:266950
Королевство кривых зеркалВиталий Губарев3:10:376790
Приключения Синдбада-МореходаАрабская сказка1:00:576500
Двенадцать месяцевСамуил Маршак24:346360
Тимур и его командаАркадий Гайдар2:37:066350
Царевна-лягушкаРусская народная18:006210
Курочка РябаРусская народная01:066200
ОгнивоГанс Христиан Андерсен17:035870
Домовёнок КузяТатьяна Александрова2:10:555760
Живая водаБратья Гримм21:335670
МорозкоРусская народная05:085330
Красавица и чудовищеДисней11:335250
Питер ПэнБарри Джеймс6:23:345240
Урфин Джюс и его деревянные солдатыАлександр Волков6:02:285240
Самая маленькая принцессаАнна Деус03:405000
СовёнокАнна Деус03:035000
Любопытный зайчонокАнна Деус08:205000
Мишкина кашаНиколай Носов15:064970
Сивка-буркаРусская народная16:104940
Король ЛевДисней14:114850
Чук и ГекАркадий Гайдар1:11:434760
Механический дед МорозСвен Нурдквист2:59:524630
Иван - крестьянский сын и Чудо-ЮдоРусская народная26:274610
Баба-ягаРусская народная10:184600
Белочка и ЗайкаАнна Деус02:184500
Дон КихотМигель де Сервантес3:39:334500
РепкаРусская народная02:204440
Мешок яблокСутеев Владимир Григорьевич12:234430
Летучий корабльРусская народная24:334420
Муха-ЦокотухаКорней Иванович Чуковский04:104410
Девочка на шареВиктор Драгунский16:524340
Дудочка и кувшинчикВалентин Катаев13:244320
Гадкий утенокГанс Христиан Андерсен25:184300
Холодное сердцеВильгельм Гауф56:004300
Мышонок ПикВиталий Бианки58:364260
Хома и СусликАльберт Иванов14:11:154210
Пеппи собирается в путьАстрид Линдгрен2:53:154180
Автомобильчик БипТамара Крюкова29:224130
Сказка о царе БерендееРусская народная44:404100
Гензель и ГретельБратья Гримм24:104070
Маленький МукВильгельм Гауф33:444040
Мэри ПоппинсПамела Трэверс3:08:494030
Пеппи в стране ВеселииАстрид Линдгрен2:34:054010
Кощей БессмертныйРусская народная23:593980
Паровозик ПыхТамара Крюкова32:193970
Гуси-лебедиРусская народная03:373900
Спящая красавицаШарль Перро24:563860
Приключения барона МюнхаузенаРудольф Эрих Распе1:32:223770
Али-Баба и сорок разбойниковАрабская сказка30:073750
Фея Динь-ДиньДисней08:563730
Приключения ЧиполлиноДжанни Родари1:00:173600
Сказка о золотом петушкеАлександр Сергеевич Пушкин11:403500
ТелефонКорней Иванович Чуковский03:563500
Федорино гореКорней Иванович Чуковский06:423430
Как муравьишка домой спешилВиталий Бианки14:263420
Дети капитана ГрантаЖюль Верн3:07:193360
НемоДисней20:283260
Волшебная лампа АладдинаАрабская сказка43:413240
Черная курица, или Подземные жителиАнтоний Погорельский1:40:203230
Сказка о попе и о работнике его БалдеАлександр Сергеевич Пушкин09:303190
Каша из топораРусская народная02:383170
Конёк-ГорбунокПётр Ершов2:10:203160
Кот ЛеопольдАркадий Хайт26:133150
Русалочка (Дисней)Дисней14:123120
Король ДроздобородБратья Гримм24:423050
Котёнок по имени ГавГригорий Остер40:033010
Чудесное путешествие Нильса с дикими гусямиСельма Лагерлеф1:59:552980
Рони, дочь разбойникаАстрид Линдгрен6:33:162920
Тук-тук-тукНиколай Носов12:372810
Сказка про котенка Уголька, беглого хомяка и ворону МатрёнуИрина Рогалёва22:262810
Аладдин (Дисней)Дисней14:062790
Ежик в туманеСергей Козлов6:33:272770
Жёлтый туманАлександр Волков7:23:432730
СоловейГанс Христиан Андерсен30:342730
ЧебурашкаУспенский Эдуард45:492720
Илья Муромец и Соловей разбойникРусская народная14:572690
Принцесса на горошинеГанс Христиан Андерсен02:572660
Золушка (Дисней)Дисней14:162660
РомашкаГанс Христиан Андерсен10:552650
ТараканищеКорней Иванович Чуковский05:592650
Волшебный магазинСутеев Владимир Григорьевич35:452570
Финист-ясный соколРусская народная19:192560
Золотой гусьБратья Гримм12:082550
По щучьему веленьюРусская народная16:492530
У Лукоморья дуб зеленыйАлександр Сергеевич Пушкин02:032520
Бобик в гостях у БарбосаНиколай Носов09:142490
БэмбиДисней15:302490
Три охотникаНиколай Носов10:362430
Мальчик с пальчикШарль Перро13:242420
Палочка-выручалочкаСутеев Владимир Григорьевич07:532400
Петушок золотой гребешокРусская народная04:482390
Петушок и бобовое зернышкоРусская народная02:422390
Сказки дядюшки РимусаДжоэль Чендлер Харрис1:52:292370
Про Бегемота, который боялся прививокСутеев Владимир Григорьевич03:572360
ФенькаАлексей Пантелеев16:252350
Волшебное яблочкоРусская народная24:562350
Сказка о глупом мышонкеСамуил Маршак04:572320
ВолшебницаШарль Перро05:522320
Бычок-смоляной бочокРусская народная07:212300
Про Веру и АнфисуУспенский Эдуард53:342300
Однажды Катя с МанечкойИрина Пивоварова6:57:342270
Кот и лисаРусская народная07:212250
Кошка, которая гуляла сама по себеРедьярд Киплинг33:252250
Принц и нищийМарк Твен9:11:342240
Серая ШейкаМамин-Сибиряк21:322230
Поди туда-не знаю куда, принеси то-не знаю чтоРусская народная46:072220
Каникулы в ПростоквашиноУспенский Эдуард19:462220
Стоптанные туфелькиБратья Гримм13:202200
Царевна НесмеянаРусская народная05:552200
ЗаплаткаНиколай Носов03:492180
Петя Иванов и волшебник Тик-ТакСутеев Владимир Григорьевич51:362170
О чём думает моя головаИрина Пивоварова5:21:472170
Джельсомино в Стране лжецовДжанни Родари3:35:232150
Тайна третьей планетыКир Булычёв54:582130
Винни-Пух (Дисней)Дисней18:272120
Дикие лебедиГанс Христиан Андерсен12:202120
Стойкий оловянный солдатикГанс Христиан Андерсен13:132120
Кладовая солнцаМихаил Пришвин1:49:082100
Дядя Федор, пес и котУспенский Эдуард1:13:312070
Приключения Пиноккио. История деревянной куклыКарло Коллоди4:09:062040
Рикки Тикки ТавиРедьярд Киплинг38:532000
Живая шляпаНиколай Носов03:382000
Белоснежка (Дисней)Дисней14:472000
Гном Гномыч и ИзюмкаАгнеш Балинт1:58:132000
Баба Яга и ягодыРусская народная02:551990
Три поросёнка (Дисней)Дисней08:351970
Кто сказал «МЯУ»?Сутеев Владимир Григорьевич06:161960
Зима в ПростоквашиноУспенский Эдуард1:01:211940
ФантазёрыНиколай Носов08:401940
Если бы я был взрослымВиктор Драгунский04:441920
Голубой щенокЮрий Энтин20:321920
Лягушка-путешественницаВсеволод Гаршин12:511910
БармалейКорней Иванович Чуковский07:041880
Тайное становится явнымВиктор Драгунский06:371880
ТачкиДисней13:101870
Крокодил Гена и его друзьяУспенский Эдуард1:44:451860
Горшочек кашиБратья Гримм02:271850
Куриный бульонВиктор Драгунский09:491840
Алиса в стране чудес (Дисней)Дисней16:331840
РататуйДисней19:271830
Краденое солнцеКорней Иванович Чуковский03:551820
Крошка Енот и тот, кто сидит в прудуЛилиан Мур11:011800
История игрушекДисней15:441790
Заяц и ёжБратья Гримм06:221780
101 далматинецДисней13:121770
Зайкина избушкаРусская народная06:021770
Маленькие человечкиБратья Гримм06:331770
Сестрица Алёнушка и братец ИванушкаРусская народная05:571750
Приключения Карандаша и СамоделкинаЮрий Дружков2:17:191750
Маша и ОйкаСофья Прокофьева1:11:481740
СерёжикЕлена Ракитина5:42:231730
РумпельштильцхенБратья Гримм10:471710
Смелый корабликТамара Крюкова32:551700
Калиф аистВильгельм Гауф26:491680
Друг детстваВиктор Драгунский07:251680
Заколдованная королевнаРусская народная20:041680
Лиса и волкРусская народная04:371670
Приключения БибигонаКорней Иванович Чуковский28:491650
ЗамазкаНиколай Носов05:441600
ЯблокоСутеев Владимир Григорьевич04:581580
О Военной тайне, о Мальчише-Кибальчише и его твёрдом словеАркадий Гайдар24:221570
Братья МауглиРедьярд Киплинг1:05:041570
Марья МоревнаРусская народная27:011570
Двадцать лет под кроватьюВиктор Драгунский10:001560
СнегурочкаРусская народная05:091550
Шесть лебедейБратья Гримм20:101550
Серебряное копытцеПавел Бажов22:261530
АвтомобильНиколай Носов04:541500
СуперсемейкаДисней15:181490
Две ящеркиПавел Бажов46:021490
Шёл по городу волшебникЮрий Томин6:42:351490
Разные колёсаСутеев Владимир Григорьевич03:391480
Цыплёнок ЦыпаДисней17:331480
Шурик у дедушкиНиколай Носов10:541480
Юные сурки идут по следуДисней14:231470
Муфта, Полботинка и Моховая БородаЭно Рауд12:48:471460
Госпожа МетелицаБратья Гримм09:001450
Вот какой рассеянныйСамуил Маршак03:281450
Ахи Страхи (Ничуть не страшно)Андрей Кириллов17:051450
Кот-рыболовСутеев Владимир Григорьевич07:531430
Три толстякаЮрий Олеша5:10:111420
Приключения Флика, или Жизнь жуковДисней13:261420
Приключения желтого чемоданчикаСофья Прокофьева3:40:211420
Вождь краснокожихО. Генри33:221420
Наказанная царевнаРусская народная16:181400
Чип и ДейлДисней11:011400
Приключения поросёнка ФунтикаВалерий Шульжик45:391400
КрокодилКорней Иванович Чуковский14:181400
Двенадцать братьевБратья Гримм17:221400
Алые парусаАлександр Грин3:22:471400
Зимовье зверейРусская народная08:081390
Лиса и гусиБратья Гримм02:311390
Под грибомСутеев Владимир Григорьевич03:321380
Федина задачаНиколай Носов05:581370
Хозяйка медной горыПавел Бажов27:181360
Паровозик из РомашковоГеннадий Цыферов12:201360
ПокахонтасДисней15:391350
ТерешечкаРусская народная07:101350
Крошечка-ХаврошечкаРусская народная07:371340
Мышонок и карандашСутеев Владимир Григорьевич03:241330
КляксаНиколай Носов05:411330
Сестра моя КсенияВиктор Драгунский08:231320
Новогодние каникулы Вани ОгородниковаАлексей и Анна Епифановы1:30:451320
Приключения Петрова и ВасечкинаВладимир Алеников2:29:121320
Гном-ТихогромБратья Гримм16:051310
Голубая чашкаАркадий Гайдар1:01:381300
Белый Бим Чёрное ухоГавриил Троепольский8:53:281300
ДетствоИван Суриков03:431300
Мой друг Васька РоговКонстантин Мелихан2:07:301290
Саша и МашаАнни Шмидт6:45:071290
Гусиное горлышкоВиктор Драгунский12:411290
Петя и Красная ШапочкаСутеев Владимир Григорьевич16:461280
Микки Маус, Дональд и ГуфиДисней18:251280
Братец медвежонокДисней20:501270
Баранкин, будь человекомВалерий Медведев4:16:451270
Как львенок и черепаха пели песенкуИнесса Ковалевская08:301270
Каменный цветокПавел Бажов1:04:441260
Одна капля убивает лошадьВиктор Драгунский05:461260
Сундук-самолётГанс Христиан Андерсен18:191240
ДамбоДисней14:091240
Арбузный переулокВиктор Драгунский10:371230
Атлантида (Затерянный мир)Дисней21:191230
Дед Мороз и серый волкСутеев Владимир Григорьевич18:101230
Одноглазка, двуглазка и треглазкаБратья Гримм18:421230
Пора спатьМамин-Сибиряк23:051220
Что я люблюВиктор Драгунский04:211220
МуланДисней15:031220
Малахитовая шкатулкаПавел Бажов1:10:071200
Соломинка, уголек и бобБратья Гримм03:361200
СашаНиколай Носов14:401200
Оле-ЛукойеГанс Христиан Андерсен29:451190
Что я виделБорис Житков8:47:271190
ГеркулесДисней14:321190
Теремок в стихахСамуил Маршак23:361190
Волшебное кольцоРусская народная42:141180
Добрыня Никитич и Змей ГорынычРусская народная18:391180
Пряничный домикБратья Гримм12:151180
Лиса и журавльРусская народная02:221170
Песочный человекАмадей Гофман1:51:021170
Лиса и дроздРусская народная06:551170
Про репкуНиколай Носов19:011160
Приключения капитана ВрунгеляАндрей Некрасов1:17:171160
Лис и пёсДисней13:361160
Первая охотаВиталий Бианки06:131150
Дядя МишаСутеев Владимир Григорьевич06:101150
Бабушка ВьюгаБратья Гримм11:071140
Великан ГрогКим Уиброу17:021140
Тетя Дяди ФедораУспенский Эдуард1:05:561140
Жили-были ЁжикиВениамин Смехов46:261140
Терем-теремокСутеев Владимир Григорьевич07:151130
Король-лягушонок, или Железный ГенрихБратья Гримм10:091130
Диво дивное, чудо чудноеРусская народная12:201120
Подарки феиШарль Перро08:561110
КарасикНиколай Носов12:281110
Маугли (Дисней)Дисней11:031110
Леди и БродягаДисней11:141110
Королевские детиБратья Гримм28:411100
Три котёнкаСутеев Владимир Григорьевич01:211100
Как игрушки пошли учиться, или Петя Кляксин на необитаемом островеАлександр Дитрих44:181100
Семья ЛарссеновЯн Улоф Экхольм1:08:161100
Белоснежка и АлоцветикБратья Гримм13:301100
Остров сокровищРоберт Стивенсон1:14:051071
Любимая девочка Дяди ФедораУспенский Эдуард1:07:291070
Синяя БородаШарль Перро12:091060
ЗатейникиНиколай Носов03:261060
Рассказы о животныхБорис Житков1:33:401040
О молодильных яблоках и живой водеРусская народная35:021040
Золотой горшокАмадей Гофман4:06:561030
КорабликСутеев Владимир Григорьевич02:171030
Капризная кошкаСутеев Владимир Григорьевич04:091020
Новое платье короляГанс Христиан Андерсен11:231020
Сверху вниз, наискосокВиктор Драгунский08:381020
Бой на Калиновом мостуРусская народная12:531010
Сказка об умном мышонкеСамуил Маршак06:051010
Алёша Попович и Тугарин ЗмеевичРусская народная19:071010
Робин ГудДисней09:401000
Жар-птица и Василиса-царевнаРусская народная10:251000
Старик из стеклянной горыБратья Гримм07:00990
Девушка-дикаркаБратья Гримм21:36990
Хитрый способВиктор Драгунский09:11990
Чей нос лучшеВиталий Бианки06:16990
Происшествие в стране Мульти-ПультиАркадий Хайт1:11:33980
Белые амадиныВиктор Драгунский17:07970
Заяц и черепахаДисней07:43970
Наш друг ПишичитайЕвгений Агранович20:08960
ЗамарашкаШарль Перро14:47960
Скорый гонецРусская народная20:56950
ПряткиНиколай Носов05:04950
Снежный домАлексей Николаевич Толстой22:55940
ТарзанДисней11:14930
ЖихаркаРусская народная04:47930
Гарантийные человечкиУспенский Эдуард1:19:37920
Смерть шпиона ГадюкинаВиктор Драгунский14:28920
Тигр! Тигр!Редьярд Киплинг51:39910
Пастушья дудочкаРусская народная07:52910
Как собака друга искалаРусская народная03:42910
Мороз ИвановичВладимир Одоевский18:55910
Лило и СтичДисней18:27910
Горбун из Нотр-ДамаДисней13:50900
Лисичка со скалочкойРусская народная03:29900
Сочневы камешкиПавел Бажов26:24890
Заколдованная букваВиктор Драгунский03:44890
Ровно 25 килоВиктор Драгунский06:09880
Горячий каменьАркадий Гайдар11:50880
Маленькая Баба-ЯгаОтфрид Пройслер45:02870
ПутаницаКорней Иванович Чуковский02:34850
Где это видано, где это слыханоВиктор Драгунский16:46850
Петух и краскиСутеев Владимир Григорьевич00:55850
Усатый-полосатыйСамуил Маршак05:26850
Дед Мороз и летоВасилий Ливанов21:33850
Коты-аристократыДисней13:31840
Дочь болотного царяГанс Христиан Андерсен46:02830
Профессор кислых щейВиктор Драгунский05:47830
Морской царь и Василиса ПремудраяРусская народная17:16830
СнеговикГанс Христиан Андерсен13:55820
Городок в табакеркеВладимир Одоевский18:11820
Храбрый портняжкаБратья Гримм15:46800
Коза дерезаРусская народная05:03800
Синий кинжалВиктор Драгунский05:52800
Независимый ГорбушкаВиктор Драгунский11:08790
Верные звериБратья Гримм11:13790
Братец из тыквы (Кукулик)Мария Дюричкова25:20780
Лиса и медведьРусская народная09:08780
Пожар во флигеле, или подвиг во льдахВиктор Драгунский11:41780
Чудесная рубашкаРусская народная13:09770
Окаменелое царствоРусская народная07:23770
Про храброго Зайца-длинные уши, косые глаза, короткий хвостМамин-Сибиряк06:45760
ЛеденецНиколай Носов04:00760
Гулливер в стране лилипутовДжонатан Свифт1:28:02760
Пиноккио (Дисней)Дисней13:50750
Тим Талер или Проданный СмехДжеймс Крюс1:54:56750
О Молочке, овсяной Кашке и сером котишке МуркеМамин-Сибиряк10:35740
Снегурушка и лисаРусская народная04:55730
Лиса и заяцРусская народная05:14730
Пузырь, соломинка и лапотьРусская народная00:48720
Хитрая наукаРусская народная14:16720
Царица пчелБратья Гримм07:11710
Мотогонки по отвесной стенеВиктор Драгунский08:14710
Главные реки АмерикиВиктор Драгунский08:57700
Елена ПремудраяРусская народная12:15700
Крылатый, мохнатый да масленыйРусская народная08:43700
Площадь картонных часовЛеонид Яхнин34:51700
Козлёнок, который считал до десятиАльф Прейсен08:31690
Королек и медведьБратья Гримм09:14690
Серебряное блюдечко и наливное яблочкоРусская народная15:17680
О том, как жила-была последняя МухаМамин-Сибиряк25:00680
НаходчивостьНиколай Носов04:56680
Хлеб и золотоАрабская сказка04:09680
Мы ищем кляксуСутеев Владимир Григорьевич07:53680
Тихая сказкаСамуил Маршак05:12680
ВеснойСутеев Владимир Григорьевич02:26670
Былина о Дунае, Добрыне и Владимире Красно СолнышкоРусская народная24:41670
Рике с хохолкомШарль Перро13:57670
Сражение у чистой речкиВиктор Драгунский07:37670
Цыплёнок и утёнокСутеев Владимир Григорьевич01:31670
Журавль и цапляРусская народная04:06660
Два Ивана - солдатских сынаРусская народная36:20660
Голубая змейкаПавел Бажов31:28650
Вовка в Тридевятом царствеВадим Коростылёв19:10640
Вершки и корешкиРусская народная01:56640
Дружба кошки и мышкиБратья Гримм07:48640
Райский садГанс Христиан Андерсен35:12630
ЕльГанс Христиан Андерсен25:27630
Умнее всехМамин-Сибиряк20:54620
Про КозявочкуМамин-Сибиряк09:20610
Деревянный орелРусская народная13:14610
Злой князьГанс Христиан Андерсен06:46610
Приказчиковы подошвыПавел Бажов19:32590
Как лиса училась летатьРусская народная01:23590
Как в джунгли пришёл страхРедьярд Киплинг52:11580
Лиса и тетеревРусская народная02:09580
Дорожный товарищГанс Христиан Андерсен40:01580
Хрустальный шарБратья Гримм09:11570
Ухти-ТухтиБеатрис Поттер20:54570
Ветер рассказывает о Вальдемаре До и его дочеряхГанс Христиан Андерсен30:55570
Охота питона КааРедьярд Киплинг1:18:39570
Самое дорогоеРусская народная06:03570
СвинопасГанс Христиан Андерсен11:26560
Тиха украинская ночьВиктор Драгунский10:34560
Это что за птица?Сутеев Владимир Григорьевич07:15560
Маленький Клаус и Большой КлаусГанс Христиан Андерсен27:52550
ПожарСамуил Маршак06:44550
Горный мастерПавел Бажов38:19550
Золотая антилопаЛев Атаманов35:02550
Мороз и заяцРусская народная02:50550
Лисичкин хлебМихаил Пришвин03:23550
Чудо-деревоКорней Иванович Чуковский01:21540
БабочкаСутеев Владимир Григорьевич02:24540
Гвоздик, Лампочка и Синий мячикЛейла Курашинова08:55540
Улитка и розаГанс Христиан Андерсен06:44530
Огневушка-поскакушкаПавел Бажов26:18530
Умная ГретельБратья Гримм08:44530
Иванушка-дурачокРусская народная08:09530
Цветы маленькой ИдыГанс Христиан Андерсен15:41530
Красный шарик в синем небеВиктор Драгунский06:31530
Ничего изменить нельзяВиктор Драгунский09:34520
Подземный человечекБратья Гримм16:56520
Большой морской змейГанс Христиан Андерсен27:43520
Гадкий утёнок (Дисней)Дисней14:24510
Кривая уточкаРусская народная02:49510
Столик, сам накройся, золотой осел и дубинка из мешкаБратья Гримм28:03510
Зеленчатые леопардыВиктор Драгунский07:39510
ГоршеняРусская народная10:41500
Ленивый ХайнцБратья Гримм07:50500
Мастер-ломастерСамуил Маршак03:07500
Серебряная монеткаГанс Христиан Андерсен13:32490
Счастливое семействоГанс Христиан Андерсен09:37480
Три счастливчикаБратья Гримм08:44480
Дочь и падчерицаРусская народная08:44470
Волшебная дудочкаРусская народная07:47470
Чего боялся ПетяСамуил Маршак01:45470
Двенадцать пассажировГанс Христиан Андерсен12:43460
Про Комара Комаровича-длинный нос и про мохнатого Мишу-короткий хвостМамин-Сибиряк11:58460
Он живой и светитсяВиктор Драгунский05:12460
Дикая собака Динго или повесть о первой любвиРувим Фраерман1:52:32450
Верное средствоАрабская сказка02:08450
Бутылочное горлышкоГанс Христиан Андерсен32:36450
Золотой топорРусская народная01:58440
Свинья-копилкаГанс Христиан Андерсен06:33440
Семь СимеоновРусская народная13:45430
Три змеиных листочкаБратья Гримм11:02430
Бычок - чёрный бочок, белые копытцаРусская народная06:22430
Лесная старухаБратья Гримм08:08430
Зайкин корабликСутеев Владимир Григорьевич04:47430
Лис и мышонокВиталий Бианки00:36430
Синюшкин колодецПавел Бажов36:12430
Девочка со спичкамиГанс Христиан Андерсен09:59420
Нашествие джунглейРедьярд Киплинг1:12:14420
Как лиса с овцой волка наказалиРусская народная02:06420
Петух и жерновцыРусская народная04:53420
СловоРусская народная07:00420
БолтуньяРусская народная05:12420
Сказка о четырёх глухихВладимир Одоевский10:04420
Жадный вельможаРусская народная05:54410
Топтыгин и лисаКорней Иванович Чуковский04:37410
Ванькины имениныМамин-Сибиряк19:34400
Айболит и воробейКорней Иванович Чуковский03:14400
Вася ВесёлкинМихаил Пришвин15:26400
ОсликБратья Гримм12:09400
Три пряхиБратья Гримм07:23400
Солдат и царицаРусская народная17:11400
Англичанин ПавляВиктор Драгунский04:49390
То, чего не былоВсеволод Гаршин10:51390
Раз, два — дружно!Сутеев Владимир Григорьевич06:58390
Мистер ТвистерСамуил Маршак12:56390
Синий лапотьМихаил Пришвин06:45380
Этажи лесаМихаил Пришвин05:08380
Волшебный холмГанс Христиан Андерсен13:47380
О жабе и розеВсеволод Гаршин18:15380
Веретено, ткацкий челнок и иголкаБратья Гримм09:15370
ВыскочкаМихаил Пришвин05:19370
Дымка и АнтонВиктор Драгунский03:34370
Святогор и Илья МуромецРусская народная11:27360
Про славного царя ГорохаМамин-Сибиряк46:17360
Расскажите мне про СингапурВиктор Драгунский13:14360
Эльф розового кустаГанс Христиан Андерсен13:07350
БутербродКорней Иванович Чуковский00:37350
Дочь-семилеткаРусская народная08:42350
ИзобретательМихаил Пришвин08:40350
Умная внучкаРусская народная13:54350
Хрустальная гораРусская народная05:56340
ОческиБратья Гримм01:54340
Капля водыГанс Христиан Андерсен04:23330
ПриемышМамин-Сибиряк20:31330
РадостьКорней Иванович Чуковский00:54330
Надо иметь чувство юмораВиктор Драгунский06:17330
Что бывалоБорис Житков1:01:49330
Повесть о том, как один мужик двух генералов прокормилСалтыков-Щедрин19:34330
У страха глаза великиРусская народная02:13330
Скверный мальчишкаГанс Христиан Андерсен04:24330
Охота за бабочкойМихаил Пришвин02:17320
ВеснаРедьярд Киплинг43:31320
Что сделала МураКорней Иванович Чуковский00:28320
Три братаБратья Гримм05:52320
Семь вороновБратья Гримм07:13320
ГрибыАлексей Николаевич Толстой05:25320
ЁжМихаил Пришвин06:10320
АистыГанс Христиан Андерсен10:22310
Кот ВаськаАлексей Николаевич Толстой01:46310
Нищий и счастьеАрабская сказка03:22310
БагажСамуил Маршак02:10310
Перо и чернильницаГанс Христиан Андерсен07:27310
Чудесные лапоточкиРусская народная06:50300
Два морозаРусская народная05:04300
Про Воробья Воробеича, Ерша Ершовича и весёлого трубочиста ЯшуМамин-Сибиряк17:19300
Королевский анкасРедьярд Киплинг55:15290
УгомонСамуил Маршак06:32290
Последняя жемчужинаГанс Христиан Андерсен05:28290
Пятеро из одного стручкаГанс Христиан Андерсен07:00290
ЕжАлексей Николаевич Толстой01:14280
Маша и мышкиАлексей Николаевич Толстой03:01280
Attalea princepsВсеволод Гаршин19:07280
ТеньГанс Христиан Андерсен37:53270
МенаРусская народная04:38270
Медведь на воеводствеСалтыков-Щедрин31:03270
Лиса и козелРусская народная01:55260
Моя родинаМихаил Пришвин03:26260
Сказка о рыбаке и его женеБратья Гримм31:13260
Старый уличный фонарьГанс Христиан Андерсен22:01250
Заяц-хвастаРусская народная01:37250
Детки в клеткеСамуил Маршак04:55250
ЛёнГанс Христиан Андерсен12:03250
Рыжие собакиРедьярд Киплинг1:12:02250
Бузинная матушкаГанс Христиан Андерсен22:00250
Ребята и утятаМихаил Пришвин03:10250
Про Воронушку-чёрную головушку и жёлтую птичку КанарейкуМамин-Сибиряк20:30240
СорокаАлексей Николаевич Толстой02:37240
Кто заговорит первыйРусская народная06:22230
Пастушка и трубочистГанс Христиан Андерсен15:18230
ЕлкаКорней Иванович Чуковский00:39230
БатракРусская народная10:47230
Старый домГанс Христиан Андерсен21:48230
АнгелГанс Христиан Андерсен05:32230
Штопальная иглаГанс Христиан Андерсен11:17230
Кое-чтоГанс Христиан Андерсен19:03220
Умный мужикРусская народная04:20220
Дикий помещикСалтыков-Щедрин19:38220
ГоршокАлексей Николаевич Толстой04:46210
Золотой лугМихаил Пришвин02:07210
КонягаСалтыков-Щедрин16:20210
Умей обождатьКонстантин Ушинский01:52200
Ежики смеютсяКорней Иванович Чуковский00:17190
ЧайникГанс Христиан Андерсен09:06190
Чего только не придумаютГанс Христиан Андерсен09:50190
КотМихаил Пришвин03:10180
Бегущая по волнамАлександр Грин1:42:12180
Сказка о том, кто ходил страху учитьсяБратья Гримм29:48180
Ганс ЧурбанГанс Христиан Андерсен09:07180
ГусакАлексей Николаевич Толстой04:17180
Сова и котАлексей Николаевич Толстой02:00180
Премудрый пескарьСалтыков-Щедрин15:21180
Про бабушку старушкуРусская народная03:10170
ГречихаГанс Христиан Андерсен04:12160
МуравейАлексей Николаевич Толстой03:03160
Истинная правдаГанс Христиан Андерсен06:17150
ПобратимыГанс Христиан Андерсен29:23150
ПрисказкаМамин-Сибиряк01:43150
ЗакалякаКорней Иванович Чуковский00:35150
Котауси и МаусиКорней Иванович Чуковский00:47140
ЧерепахаКорней Иванович Чуковский00:41140
Сказание о гордом АггееВсеволод Гаршин26:35140
Скрюченная песняКорней Иванович Чуковский00:42130
КозелАлексей Николаевич Толстой01:31130
Синяя птицаМорис Метерлинк1:26:33130
Куриный богАлексей Николаевич Толстой02:23120
МышкаАлексей Николаевич Толстой01:07110
ВерблюдАлексей Николаевич Толстой03:03110
ЖуркаМихаил Пришвин02:43110
ГаечкиМихаил Пришвин02:48100
ХромкаМихаил Пришвин03:34100
Приключения НуликаВладимир Лёвшин и Эмилия Александрова1:45:31100
99 зайцевПетер Асбьёрнсен32:37100
МуравьишкаИспанская народная23:03100
МудрецАлексей Николаевич Толстой02:34100
Карась-идеалистСалтыков-Щедрин27:50100
Похлёбка из камнейИтальянская народная13:09100
Большая докторская сказкаКарел Чапек48:32100
ГадюкаЮрий Сотник21:19100
ВоротничокГанс Христиан Андерсен05:5590
ПетушкиАлексей Николаевич Толстой02:0580
Рачья свадьбаАлексей Николаевич Толстой03:5980
ЗаяцАлексей Николаевич Толстой02:2080
КартинаАлексей Николаевич Толстой01:5460
Говорящий грачМихаил Пришвин02:0060
Лев ушёл из домаЮрий Яковлев48:1550
Пико - Хрустальное ГорлышкоНиколай Космин1:52:3450
Курочка-королеваИспанская народная22:3150
Умная МариФранцузская народная13:5950
Синяя свечкаБратья Гримм12:3850
Приключения ТяпаСуслов Вольт11:0550
Счастливый ГансБратья Гримм14:5340
ЧучелоВладимир Железников1:36:3135
Берёза и три соколаРусская народная02:4730
Сокровища капитана ФлинтаРоберт Стивенсон39:4430
Кот-хвастунВладимир Лёвшин27:4230
Где живут цифрыАндрей Усачёв47:1630
Большая девочкаЛидия Арманд02:4230
Маленький галисиецИспанская народная06:1625
Лесные тайныФранцузская народная19:2825
Настоящая невестаБратья Гримм19:1925
Мудрая кошкаШведская народная15:2225
Старый другРоман Темис06:1525
Глоток молокаМихаил Пришвин00:4520
В пряткиЛидия Арманд04:2720
Две лягушкиЯпонская народная06:3315
Тут-тук-тук, открой дверьЯпонская народная32:4510
Как Кортезе заплатил за обедИтальянская народная04:1510
Настоятель и служкаЯпонская народная05:0210
Как достать живую обезьянуЯпонская народная17:1910
Неустрашимый царевичБратья Гримм14:1010
Морской дьяволБорис Савельев39:0210
Массаро ПравдаИтальянская народная14:4210
Подарок домовогоШведская народная31:3810
Сны ГуалтьероИтальянская народная14:3510
Шалунишка с крылышкамиЛидия Арманд03:3010
ЛисаАлексей Николаевич Толстой01:2910
МеринАлексей Николаевич Толстой02:5910
ПорточкиАлексей Николаевич Толстой03:2610
СверчокФранцузская народная15:3710
Сын чародеяФранцузская народная10:295
Чудная снежинкаСоловьёв–Несмелов05:265
Храбрые дочери рыцаря и злой великанШведская народная15:315

Сказки для детей читать онлайн, лучшие произведения от детских авторов

Аленький цветочекАксаков Сергей Тимофеевич42:15130001
Снежная королеваГанс Христиан Андерсен58:45110000
Курочка РябаРусская народная00:2098002
Красная ШапочкаШарль Перро03:2097500
Цветик-семицветикВалентин Катаев11:0097001
ЗолушкаШарль Перро14:1096000
ДюймовочкаГанс Христиан Андерсен19:3095000
Маша и медведьРусская народная03:3095000
Белоснежка и семь гномовБратья Гримм14:5094001
Три поросенкаРусская народная03:4094000
Кот в сапогахШарль Перро06:2093000
ТеремокРусская народная02:2093000
АйболитКорней Иванович Чуковский04:3590001
Двенадцать месяцевСамуил Маршак11:1090001
Волк и семеро козлятБратья Гримм02:4090000
Василиса ПрекраснаяРусская народная14:2590000
РусалочкаГанс Христиан Андерсен42:2090000
Сказка о мёртвой царевне и семи богатыряхАлександр Сергеевич Пушкин12:5587000
МорозкоРусская народная07:1087000
Сказка о царе СалтанеАлександр Сергеевич Пушкин23:2586001
Золотой ключик, или Приключения БуратиноАлексей Николаевич Толстой2:02:4080000
Волшебник Изумрудного городаАлександр Волков3:24:1580000
Каша из топораРусская народная01:5073000
Карлик НосВильгельм Гауф50:0071000
Сказка о рыбаке и рыбкеАлександр Сергеевич Пушкин05:5070003
Гадкий утенокГанс Христиан Андерсен16:0570001
Маленький МукВильгельм Гауф28:1070000
Карлсон, который живёт на крышеАстрид Линдгрен2:20:1570000
Петушок и бобовое зернышкоРусская народная01:3070000
Витя Малеев в школе и домаНиколай Носов4:00:2070000
Бременские музыкантыБратья Гримм06:1568000
Иван-крестьянский сын и чудо-юдоРусская народная14:2067000
Маленький принцАнтуан Де Сент-Экзюпери1:15:4066000
РапунцельБратья Гримм06:5065000
КолобокРусская народная02:3564000
Спящая красавицаШарль Перро06:2563000
Горшочек кашиБратья Гримм01:4562000
Царевна-лягушкаРусская народная10:3061000
Принцесса на горошинеГанс Христиан Андерсен01:3560000
МойдодырКорней Иванович Чуковский02:5560000
Кошкин домСамуил Маршак20:2060000
РумпельштильцхенБратья Гримм06:2559000
Три медведяРусская народная03:0558000
Король ДроздобородБратья Гримм09:4056000
Сивка-буркаРусская народная07:0555000
Маленькие человечкиБратья Гримм03:1553000
Сказка о глупом мышонкеСамуил Маршак02:1553000
Гуси-лебедиРусская народная02:4552000
ОгнивоГанс Христиан Андерсен12:1550000
Гензель и ГретельБратья Гримм15:3550000
Рикки Тикки ТавиРедьярд Киплинг30:1050000
Алиса в стране чудесЛьюис Кэрролл2:08:0550000
Винни-Пух и все-все-всеАлан Александр Милн4:04:1550000
Приключения Синдбада-МореходаАрабская сказка35:5049000
Золотой гусьБратья Гримм08:3547000
Лиса и волкРусская народная02:5547000
Иван-царевич и серый волкРусская народная10:5546000
Госпожа МетелицаБратья Гримм05:4044000
Бабушка ВьюгаБратья Гримм05:3044000
Лиса и тетеревРусская народная01:0543000
Шесть лебедейБратья Гримм10:5041000
Дикие лебедиГанс Христиан Андерсен30:5040000
Калиф аистВильгельм Гауф24:2040000
ТелефонКорней Иванович Чуковский02:1540000
Бычок-смоляной бочокРусская народная04:0540000
Лягушка-путешественницаВсеволод Гаршин07:0540000
Стоптанные туфелькиБратья Гримм07:2538000
Баба Яга и ягодыРусская народная02:0037000
ЖихаркаРусская народная02:3036900
Сказка о попе и о работнике его БалдеАлександр Сергеевич Пушкин05:4035000
Мальчик-с-пальчикШарль Перро07:2035000
Соломинка, уголек и бобБратья Гримм02:1035000
Бой на Калиновом мостуРусская народная06:4034000
ЯблокоСутеев Владимир Григорьевич02:3033940
Как муравьишка домой спешилВиталий Бианки08:4033510
Сказка о золотом петушкеАлександр Сергеевич Пушкин05:2532000
Щелкунчик и мышиный корольАмадей Гофман1:55:0032000
Двенадцать братьевБратья Гримм10:3032000
Финист-ясный соколРусская народная11:4531000
Пеппи поселяется в вилле КурицаАстрид Линдгрен2:14:1030001
Федорино гореКорней Иванович Чуковский03:5530001
РомашкаГанс Христиан Андерсен07:0530000
Дудочка и кувшинчикВалентин Катаев08:2030000
Конёк-ГорбунокПётр Ершов58:2030000
Приключения ЧиполлиноДжанни Родари4:29:3030000
Тимур и его командаАркадий Гайдар1:47:4030000
РепкаРусская народная00:4528000
Мышонок ПикВиталий Бианки35:0027700
Белоснежка и АлоцветикБратья Гримм08:1526000
Первая охотаВиталий Бианки03:2525360
Мешок яблокСутеев Владимир Григорьевич04:5025100
Алые парусаАлександр Грин2:17:5525001
СнегурочкаРусская народная03:1525000
Кошка, которая гуляла сама по себеРедьярд Киплинг18:5525000
Чук и ГекАркадий Гайдар46:0025000
Царевна НесмеянаРусская народная04:0522000
Под грибомСутеев Владимир Григорьевич02:0021040
Стойкий оловянный солдатикГанс Христиан Андерсен07:3520001
Мэри ПоппинсПамела Трэверс2:30:4520001
Братья МауглиРедьярд Киплинг38:1020000
Пеппи собирается в путьАстрид Линдгрен2:16:0020000
Серая ШейкаМамин-Сибиряк14:5520000
Питер ПэнБарри Джеймс3:04:3520000
Палочка-выручалочкаСутеев Владимир Григорьевич04:4018550
ТараканищеКорней Иванович Чуковский03:3018000
Вершки и корешкиРусская народная01:0018000
Песочный человекАмадей Гофман1:14:2516000
Крошка Енот и тот, кто сидит в прудуЛилиан Мур06:5015630
Кто сказал «МЯУ»?Сутеев Владимир Григорьевич03:3515420
Чудо-деревоКорней Иванович Чуковский00:5015000
Дикая собака Динго или повесть о первой любвиРувим Фраерман3:19:5515000
Приключения барона МюнхаузенаРудольф Эрих Распе1:06:2515000
Черная курица, или Подземные жителиАнтоний Погорельский56:2015000
Зимовье зверейРусская народная03:2014000
Чей нос лучшеВиталий Бианки04:0513630
Живая водаБратья Гримм12:1513000
Золотой горшокАмадей Гофман2:46:0512000
Горячий каменьАркадий Гайдар07:0511000
СвинопасГанс Христиан Андерсен08:1510000
Пеппи в стране ВеселииАстрид Линдгрен2:02:4510000
Летучий корабльРусская народная14:5010000
Веретено, ткацкий челнок и иголкаБратья Гримм05:2510000
Приключения Тома СойераМарк Твен6:19:1010000
Муфта, Полботинка и Моховая БородаЭно Рауд10:14:5510000
Детки в клеткеСамуил Маршак05:259630
Девушка-дикаркаБратья Гримм10:409500
О Военной тайне, о Мальчише-Кибальчише и его твёрдом словеАркадий Гайдар11:359350
Дружба кошки и мышкиБратья Гримм04:559000
КорабликСутеев Владимир Григорьевич00:559000
Лиса и журавльРусская народная01:158500
Королевские детиБратья Гримм16:258500
Мороз ИвановичВладимир Одоевский12:358001
ТеньГанс Христиан Андерсен24:058000
Королек и медведьБратья Гримм04:508000
Приключения Пиноккио. История деревянной куклыКарло Коллоди3:26:558000
Король-лягушонок, или Железный ГенрихБратья Гримм07:257500
Оле-ЛукойеГанс Христиан Андерсен19:457000
Охота питона КааРедьярд Киплинг48:407000
Ленивый ХайнцБратья Гримм04:307000
Три котёнкаСутеев Владимир Григорьевич00:356900
КрокодилКорней Иванович Чуковский08:506800
Муха-ЦокотухаКорней Иванович Чуковский02:206500
Лесная старухаБратья Гримм04:206500
У Лукоморья дуб зеленыйАлександр Сергеевич Пушкин00:556001
СнеговикГанс Христиан Андерсен08:506000
Сестрица Алёнушка и братец ИванушкаРусская народная03:506000
Тигр! Тигр!Редьярд Киплинг32:556000
Одноглазка, двуглазка и треглазкаБратья Гримм11:206000
Дядя МишаСутеев Владимир Григорьевич04:456000
Петушок золотой гребешокРусская народная03:005800
Заяц-хвастаРусская народная01:025800
Зайкина избушкаРусская народная03:255600
Теремок в стихахСамуил Маршак11:505600
ОсликБратья Гримм06:305500
Марья МоревнаРусская народная15:305400
Баба-ягаРусская народная04:305200
Лисичка со скалочкойРусская народная02:405200
Новое платье короляГанс Христиан Андерсен07:305000
Как в джунгли пришёл страхРедьярд Киплинг31:155000
Диво дивное, чудо чудноеРусская народная07:205000
Холодное сердцеВильгельм Гауф1:29:505000
ОческиБратья Гримм01:055000
Айболит и воробейКорней Иванович Чуковский01:505000
Если бы я был взрослымВиктор Драгунский03:255000
Два морозаРусская народная04:054800
Разные колёсаСутеев Владимир Григорьевич02:404800
Подземный человечекБратья Гримм08:404500
По щучьему веленьюРусская народная08:154400
Самое дорогоеРусская народная02:254200
Что я люблюВиктор Драгунский02:454200
Цыпленок и утенокСутеев Владимир Григорьевич01:054150
Кощей БессмертныйРусская народная10:304100
Сказка о царе БерендееРусская народная23:204100
ЛёнГанс Христиан Андерсен07:554000
Семь вороновБратья Гримм04:504000
Волшебная лампа АладдинаАрабская сказка50:304000
Серебряное копытцеПавел Бажов12:454000
Чудесная рубашкаРусская народная09:003800
Сверху вниз, наискосокВиктор Драгунский05:053800
Журавль и цапляРусская народная01:303600
Главные реки АмерикиВиктор Драгунский05:003600
Нашествие джунглейРедьярд Киплинг52:003500
Сказка о рыбаке и его женеБратья Гримм14:503500
Капризная кошкаСутеев Владимир Григорьевич01:453460
Королевский анкасРедьярд Киплинг35:203400
Мороз и заяцРусская народная01:103400
Ровно 25 килоВиктор Драгунский08:153400
Мышонок и карандашСутеев Владимир Григорьевич01:503400
Поди туда-не знаю куда, принеси то-не знаю чтоРусская народная27:053200
Профессор кислых щейВиктор Драгунский04:303200
Старик из стеклянной горыБратья Гримм04:053001
Attalea princepsВсеволод Гаршин13:553001
Рыжие собакиРедьярд Киплинг48:053000
Волшебное яблочкоРусская народная14:103000
Пастушка и трубочистГанс Христиан Андерсен08:353000
БутербродКорней Иванович Чуковский00:253000
Красный шарик в синем небеВиктор Драгунский05:203000
Голубая чашкаАркадий Гайдар39:303000
Малахитовая шкатулкаПавел Бажов41:403000
Семь СимеоновРусская народная07:552800
Зеленчатые леопардыВиктор Драгунский05:352800
Котауси и МаусиКорней Иванович Чуковский00:302700
У страха глаза великиРусская народная01:302700
Хитрая наукаРусская народная08:152600
Крылатый, мохнатый да масленыйРусская народная04:072600
ВолшебницаШарль Перро05:502600
ВеснаРедьярд Киплинг39:552500
Столик, сам накройся, золотой осел и дубинка из мешкаБратья Гримм20:452500
Пастушья дудочкаРусская народная06:202400
Штопальная иглаГанс Христиан Андерсен06:252350
Подарки феиШарль Перро05:502300
Петух и краскиСутеев Владимир Григорьевич00:352300
Баранкин, будь человекомВалерий Медведев3:10:352300
Мистер ТвистерСамуил Маршак09:052300
Волшебный магазинСутеев Владимир Григорьевич22:502260
Снегурушка и лисаРусская народная02:202200
Мотогонки по отвесной стенеВиктор Драгунский06:152200
Кот-рыболовСутеев Владимир Григорьевич04:352150
ПутаницаКорней Иванович Чуковский01:402050
Чудесное путешествие Нильса с дикими гусямиСельма Лагерлеф4:17:002001
Городок в табакеркеВладимир Одоевский12:502001
Капля водыГанс Христиан Андерсен03:002000
Три братаБратья Гримм04:252000
Ежики смеютсяКорней Иванович Чуковский00:102000
Гусиное горлышкоВиктор Драгунский07:252000
Как собака друга искалаРусская народная01:452000
О жабе и розеВсеволод Гаршин12:302000
Три толстякаЮрий Олеша3:24:152000
Принц и нищийМарк Твен6:16:002000
Хозяйка Медной горыПавел Бажов17:152000
Каменный цветокПавел Бажов38:052000
Это что за птица?Сутеев Владимир Григорьевич02:551940
Пожар во флигеле, или подвиг во льдахВиктор Драгунский08:201800
О молодильных яблоках и живой водеРусская народная22:151800
Заяц и ёжБратья Гримм04:201780
Тихая сказкаСамуил Маршак01:301700
Коза дерезаРусская народная03:001600
Смерть шпиона ГадюкинаВиктор Драгунский11:301600
Пряничный домикБратья Гримм08:201500
ЗакалякаКорней Иванович Чуковский00:251500
ЕжАлексей Николаевич Толстой00:401500
Три змеиных листочкаБратья Гримм07:251500
Кот ВаськаАлексей Николаевич Толстой01:001400
Ничего изменить нельзяВиктор Драгунский05:401400
Лиса и медведьРусская народная05:201400
ТерешечкаРусская народная04:301350
СорокаАлексей Николаевич Толстой01:251300
ЕльГанс Христиан Андерсен15:451250
Ослиная шкураШарль Перро15:401200
Ванькины имениныМамин-Сибиряк12:101200
ГрибыАлексей Николаевич Толстой02:401200
Сражение у чистой речкиВиктор Драгунский05:351200
Али-Баба и сорок разбойниковАрабская сказка33:501200
ЧайникГанс Христиан Андерсен03:001200
Лиса и дроздРусская народная03:551170
МедведкоМамин-Сибиряк08:451100
МуравейАлексей Николаевич Толстой01:351100
Эльф розового кустаГанс Христиан Андерсен08:501000
Как лиса училась летатьРусская народная00:501000
О Молочке, овсяной Кашке и сером котишке МуркеМамин-Сибиряк06:201000
ЕлкаКорней Иванович Чуковский00:301000
Сова и котАлексей Николаевич Толстой00:551000
Домовёнок КузяТатьяна Александрова2:09:301000
Рассказы о животныхБорис Житков1:24:301000
Кладовая солнцаМихаил Пришвин1:12:201000
Сказание о гордом АггееВсеволод Гаршин17:051000
Тиха украинская ночьВиктор Драгунский06:351000
Джельсомино в Стране лжецовДжанни Родари3:07:001000
Три пряхиБратья Гримм04:451000
Сказки дядюшки РимусаДжоэль Чендлер Харрис1:32:301000
Иванушка-дурачокРусская народная04:55950
Хрустальная гораРусская народная04:20900
Илья Муромец и Соловей разбойникРусская народная10:06900
О том, как жила-была последняя МухаМамин-Сибиряк15:20900
Маша и мышкиАлексей Николаевич Толстой01:40900
Петя Иванов и волшебник Тик-ТакСутеев Владимир Григорьевич31:20900
Голубая змейкаПавел Бажов21:00900
Терем-теремокСутеев Владимир Григорьевич03:35890
Раз, два — дружно!Сутеев Владимир Григорьевич03:35880
Золотой топорРусская народная01:10850
Козлёнок, который считал до десятиАльф Прейсен05:00850
Мы ищем кляксуСутеев Владимир Григорьевич04:25840
Дочь Болотного ЦаряГанс Христиан Андерсен1:10:20820
Чего боялся ПетяСамуил Маршак01:15820
Синяя БородаШарль Перро06:40800
Пора спатьМамин-Сибиряк13:25800
ЗаяцАлексей Николаевич Толстой01:15800
Морской царь и Василиса ПремудраяРусская народная13:25800
Хитрый способВиктор Драгунский06:00800
Про Бегемота, который боялся прививокСутеев Владимир Григорьевич02:05800
Огневушка-поскакушкаПавел Бажов17:10800
Добрыня Никитич и Змей ГорынычРусская народная08:44800
Крошечка-ХаврошечкаРусская народная04:05750
Бутылочное горлышкоГанс Христиан Андерсен20:20720
ПриемышМамин-Сибиряк16:15701
Дочь и падчерицаРусская народная02:55700
Рике с хохолкомШарль Перро12:35700
ВерблюдАлексей Николаевич Толстой01:30700
Алёша Попович и Тугарин ЗмеевичРусская народная06:34700
Лиса и заяцРусская народная02:50700
Петя и Красная ШапочкаСутеев Владимир Григорьевич09:50670
Лиса и козелРусская народная00:55650
ХромкаМихаил Пришвин02:15650
ГоршеняРусская народная06:40600
ПрисказкаМамин-Сибиряк00:50600
МышкаАлексей Николаевич Толстой00:45600
Дикий помещикСалтыков-Щедрин14:05600
Синий кинжалВиктор Драгунский03:55600
СадкоРусская народная12:35600
Последняя жемчужинаГанс Христиан Андерсен05:00575
Серебряное блюдечко и наливное яблочкоРусская народная06:00550
Пляши, куколка, пляши!Ганс Христиан Андерсен01:50540
То, чего не былоВсеволод Гаршин08:00501
Серебряная монеткаГанс Христиан Андерсен07:50500
Про Воробья Воробеича, Ерша Ершовича и весёлого трубочиста ЯшуМамин-Сибиряк10:20500
Три счастливчикаБратья Гримм05:05500
ЛисаАлексей Николаевич Толстой00:55500
АвтомобильНиколай Носов03:25500
Что бывалоБорис Житков54:00500
Жар-птица и Василиса-царевнаРусская народная07:00500
Вольга и Микула СеляниновичРусская народная06:05500
Два Ивана-солдатских сынаРусская народная19:40450
БабочкаСутеев Владимир Григорьевич00:50430
Пятеро из одного стручкаГанс Христиан Андерсен06:00425
Ставр ГодиновичРусская народная12:10420
АнгелГанс Христиан Андерсен04:35420
Живая шляпаНиколай Носов02:20401
ВоротничокГанс Христиан Андерсен04:20400
Умная ГретельБратья Гримм05:05400
Про Воронушку-чёрную головушку и жёлтую птичку КанарейкуМамин-Сибиряк12:30400
РадостьКорней Иванович Чуковский00:35400
КартинаАлексей Николаевич Толстой01:00400
Бычок - чёрный бочок, белые копытцаРусская народная03:35400
ГаечкиМихаил Пришвин02:00400
Синюшкин колодецПавел Бажов23:00400
Горный мастерПавел Бажов22:35400
Илья Муромец и Калин-царьРусская народная20:30400
Солдат и царицаРусская народная12:20400
ЗамазкаНиколай Носов03:35380
ЗаплаткаНиколай Носов02:25360
Приключения БибигонаКорней Иванович Чуковский17:25350
Умнее всехМамин-Сибиряк12:35350
Дочь-семилеткаРусская народная04:40350
Старый уличный фонарьГанс Христиан Андерсен12:25350
Чего только не придумаютГанс Христиан Андерсен05:40350
Иван Гостиный сынРусская народная04:50350
Умная внучкаРусская народная10:20350
ЗатейникиНиколай Носов01:55340
КарасикНиколай Носов08:35320
Ганс ЧурбанГанс Христиан Андерсен06:20300
Храбрый портняжкаБратья Гримм09:45300
Кто заговорит первыйРусская народная03:55300
Про КозявочкуМамин-Сибиряк05:15300
Скрюченная песняКорней Иванович Чуковский00:30300
ГоршокАлексей Николаевич Толстой02:45300
ФантазёрыНиколай Носов05:50300
Святогор и Илья МуромецРусская народная07:35300
Мишкина кашаНиколай Носов10:40281
КляксаНиколай Носов04:10270
ЛеденецНиколай Носов02:00260
СашаНиколай Носов09:10250
Про бабушку старушкуРусская народная01:25250
Маленький Клаус и Большой КлаусГанс Христиан Андерсен21:15250
Федина задачаНиколай Носов04:15240
Шурик у дедушкиНиколай Носов07:35230
НаходчивостьНиколай Носов03:20220
Про репкуНиколай Носов11:20210
Волшебное кольцоРусская народная22:45201
Истинная правдаГанс Христиан Андерсен03:55200
Про Комара Комаровича-длинный нос и про мохнатого Мишу-короткий хвостМамин-Сибиряк06:50200
МудрецАлексей Николаевич Толстой01:25200
ПряткиНиколай Носов03:35200
Топтыгин и лисаКорней Иванович Чуковский02:20200
Что я виделБорис Житков5:17:25200
Медведь на воеводствеСалтыков-Щедрин20:35200
Хрустальный шарБратья Гримм05:40200
Белые амадиныВиктор Драгунский10:45200
Вавила и скоморохиРусская народная06:10200
Снежный домАлексей Николаевич Толстой06:00200
Умей обождатьКонстантин Ушинский01:52200
Три охотникаНиколай Носов07:20190
Умный мужикРусская народная02:30190
МенаРусская народная03:30180
Тук-тук-тукНиколай Носов08:50180
Премудрый пескарьСалтыков-Щедрин10:50180
Есть же разницаГанс Христиан Андерсен06:45180
Сказка о том, кто ходил страху учитьсяБратья Гримм20:00180
СловоРусская народная04:30170
БабушкаГанс Христиан Андерсен03:30170
Елена ПремудраяРусская народная09:10160
Ветер рассказывает о Вальдемаре До и его дочеряхГанс Христиан Андерсен20:25155
Как лиса с овцой волка наказалиРусская народная01:20150
Про храброго Зайца-длинные уши, косые глаза, короткий хвостМамин-Сибиряк03:45150
Большой морской змейГанс Христиан Андерсен17:25150
Волшебная дудочкаРусская народная04:10140
Петух и жерновцыРусская народная02:45130
Этажи лесаМихаил Пришвин03:20130
Хлеб и золотоАрабская сказка02:15120
Добрыня и АлёшаРусская народная07:00120
Жадный вельможаРусская народная03:55110
Зайкин корабликСутеев Владимир Григорьевич02:05110
Счастливое семействоГанс Христиан Андерсен06:10100
КвиквернРедьярд Киплинг47:25100
ЗамарашкаШарль Перро11:25100
Царица пчелБратья Гримм04:05100
Про славного царя ГорохаМамин-Сибиряк49:10100
КозелАлексей Николаевич Толстой00:40100
ЧерепахаКорней Иванович Чуковский00:20100
БолтуньяРусская народная02:10100
Вася ВесёлкинМихаил Пришвин10:20100
Куриный бульонВиктор Драгунский06:55100
ПетушкиАлексей Николаевич Толстой01:1591
АистыГанс Христиан Андерсен08:5090
Наказанная царевнаРусская народная12:0090
ВыскочкаМихаил Пришвин03:3590
Волшебный холмГанс Христиан Андерсен12:4585
Карась-идеалистСалтыков-Щедрин20:1081
Белый котикРедьярд Киплинг36:5080
Рачья свадьбаАлексей Николаевич Толстой02:1580
Бузинная матушкаГанс Христиан Андерсен14:2080
Заколдованная королевнаРусская народная11:3580
Глоток молокаМихаил Пришвин00:2580
Кое-чтоГанс Христиан Андерсен12:0580
Маленький ТумаиРедьярд Киплинг37:5070
ГречихаГанс Христиан Андерсен02:5570
Куриный богАлексей Николаевич Толстой01:1570
БатракРусская народная06:3570
Говорящий грачМихаил Пришвин01:1070
Сказка об умном мышонкеСамуил Маршак03:0570
Слуги её величестваРедьярд Киплинг30:4560
Скорый гонецРусская народная10:4060
ГусакАлексей Николаевич Толстой02:1060
Девочка со спичкамиГанс Христиан Андерсен04:4060
Сказка о морковкеГанс Христиан Андерсен01:5055
Дорожный товарищГанс Христиан Андерсен34:1055
Чудо Пурун БхагатаРедьярд Киплинг30:0050
Что сделала МураКорней Иванович Чуковский00:2050
ПобратимыГанс Христиан Андерсен17:2550
МеринАлексей Николаевич Толстой01:3050
Окаменелое царствоРусская народная04:4550
ИзобретательМихаил Пришвин05:1050
Две ящеркиПавел Бажов28:5550
Синяя свечкаБратья Гримм08:1550
МогильщикиРедьярд Киплинг43:1540
Райский садГанс Христиан Андерсен26:4040
ПорточкиАлексей Николаевич Толстой01:4040
Деревянный орелРусская народная08:4040
КотМихаил Пришвин02:0540
Повесть о том, как один мужик двух генералов прокормилСалтыков-Щедрин13:3040
Счастливый ГансБратья Гримм10:0540
Свинья-копилкаГанс Христиан Андерсен04:1030
Охота за бабочкойМихаил Пришвин01:4030
Нищий и счастьеАрабская сказка02:0030
Перо и чернильницаГанс Христиан Андерсен04:0530
Берёза и три соколаРусская народная01:5030
Настоящая невестаБратья Гримм13:1525
Скверный мальчишкаГанс Христиан Андерсен03:2520
Верное средствоАрабская сказка01:0520
Синий лапотьМихаил Пришвин04:2020
КонягаСалтыков-Щедрин11:1520
Кривая уточкаРусская народная01:1015
СоловейГанс Христиан Андерсен17:3010
Цветы маленькой ИдыГанс Христиан Андерсен13:3010
Сундук-самолётГанс Христиан Андерсен10:3010
Сказка о четырёх глухихВладимир Одоевский07:4010
Старый домГанс Христиан Андерсен15:0510
Улитка и розаГанс Христиан Андерсен03:5010
ВеснойСутеев Владимир Григорьевич00:5010
Двенадцать пассажировГанс Христиан Андерсен07:4510
Злой князьГанс Христиан Андерсен04:3510
Неустрашимый царевичБратья Гримм09:1510
Сочневы камешкиПавел Бажов17:055
Приказчиковы подошвыПавел Бажов12:255
Независимый ГорбушкаВиктор Драгунский10:150

методов обнаружения | ЛСР | Bio-Rad

ru-ruLUSQ6KKG4Методы обнаруженияМетоды обнаружения / webroot / web / html / lsr / solutions / technologies / western_blotting

В этом разделе представлен обзор различных методов обнаружения, используемых для визуализации белки после иммунодетекции. Теория, лежащая в основе нескольких широко используемых вестерн-блоттингов методы обнаружения, такие как колориметрические, хемилюминесцентные и флуоресцентные методы, и другие менее распространенные методы, такие как хемофлуоресценция, авторадиография и иммунозолото. методы маркировки выделены ниже.

Связанные темы : Антитело Отбор и разбавление , Удаление и Reprobing Membranes и Western Промокание .

Обнаружение белков

Связанные с мембраной белки обычно обнаруживаются с помощью вторичных антител, которые помечены радиоизотопами или коллоидным золотом или конъюгированы с флуоресцентными молекулы (флуорофоры) или фермент, такой как щелочная фосфатаза (AP) или хрен пероксидаза (HRP).В ранних системах блоттинга использовались реагенты с меткой 125 , аналогичные к тем, которые используются в радиоиммуноанализах. Эти системы обеспечивают чувствительные результаты, но особые проблемы обращения с реагентами 125 I и их утилизации не позволяют продолжали использовать эту технику. С тех пор ряд ферментных систем и детекторов реагенты эволюционировали.

Механизм обнаружения химического состава. В каждом методе детекции вестерн-блоттинга, детектируемый сигнал генерируется после связывания антитело, специфичное для интересующего белка. При колориметрическом обнаружении ( A ) сигнал - цветной осадок. При хемилюминесценции ( B ) сама реакция излучает свет.При обнаружении флуоресценции ( C ) антитело помечен флуорофором.

В наиболее распространенных методах обнаружения используются вторичные антитела, конъюгированные с AP или HRP. В этих методах при добавлении ферментного субстрата образуется окрашенный осадок. наносится на блот (колориметрическое определение), хемилюминесцентный или флуоресцентный продукт формируется, и световой сигнал фиксируется на пленке или с помощью цифрового изображения систему (см. рисунок выше).Вторичные антитела, конъюгированные с флуорофорами, набирают популярность и может быть непосредственно визуализирована и захвачена с помощью совместимого тепловизора без необходимость дополнительного жидкого субстрата (см. Флуоресценция Обнаружение ).

Колориметрическое обнаружение

Колориметрические системы HRP
Системы HRP имеют преимущество перед другие системы обнаружения в том, что как ферментный конъюгат, так и колориметрическое обнаружение субстраты экономичны.Наиболее распространенными субстратами для колориметрической пероксидазы пероксидазы являются 4-хлор-1-нафтол. (4CN) (Hawkes et al. 1982) и 3,3'-диаминобензидин (DAB) (Tsang et al. 1985) (см. рисунок ниже). Некоторые ограничения колориметрических систем обнаружения HRP уменьшены. чувствительность по сравнению с колориметрическими системами обнаружения AP, исчезновение пятен при воздействие света, ингибирование активности HRP азидом и неспецифическое цветное осаждение.

Ферменты, такие как AP и HRP, превращают несколько субстратов в окрашенный осадок. (см. таблицу ниже). Поскольку осадок накапливается на пятне, появляется цветной сигнал, который легко увидеть на пятне. Ферментативный реакция может быть отслежена и остановлена ​​при достижении желаемого сигнала над фоном. Колориметрическое обнаружение проще в использовании, чем методы обнаружения на основе пленки, которые требуют метод проб и ошибок при определении подходящего времени воздействия и использование дорогостоящих материалов такие как рентгеновская пленка и химикаты для фотолаборатории.Колориметрическое обнаружение считается метод средней чувствительности по сравнению с радиоактивным или хемилюминесцентным детектированием.

Параметры колориметрического обнаружения с помощью HRP

Параметры колориметрического обнаружения с помощью HRP. DAB и 4CN - это обычно используемые хромогенные субстраты для HRP. В присутствии H 2 O 2 , HRP катализирует окисление субстрата до продукта, который виден на блоте. Слева реакция с DAB; правильно, реакция с 4CN.

Колориметрические системы AP

В колориметрических системах AP используется растворимый 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP). и нитросиний тетразолий (NBT) в качестве субстратов для получения стабильного продукта реакции которые не исчезнут (см. рисунок ниже).AP может быть легко деактивирован воздействием кислые растворы. Множественное зондирование одной и той же мембраны альтернативным антителом датчики могут быть выполнены с использованием подложек разного цвета, например, синего цвета. и красный (Блейк и др. 1984, Тернер 1983, Куриен и Скофилд 2003).

Колориметрическая проявка AP

Колориметрическая проявка AP. В колориметрической система AP катализирует субстраты BCIP и NBT с образованием окрашенного осадка. визуализация белка на вестерн-блоте. Сначала дефосфорилирование BCIP с помощью AP происходит, давая промежуточное соединение бромхлориндоксила. Затем индоксил окисляется. с помощью NBT для получения индигоидного красителя (пурпурный осадок).НБТ также снижается на индоксил, раскрывающий тетразольное кольцо с образованием нерастворимого диформазана (синий осадок). Комбинация индигоидного красителя BCIP и нерастворимого формазана NBT образует осадок пурпурно-синего цвета.

Колориметрические и хемилюминесцентные кляксы

Колориметрические и хемилюминесцентные блоты. Разведение слитого белка GST иммунодетектировали с использованием моноклональных антител, специфичных к GST, за которым следует A , вторичное антитело, конъюгированное с AP, и BCIP / NBT. субстрат для колориметрического обнаружения или B вторичный конъюгированный с HRP антитела и Immun-Star & trade; WesternC и торговля; хемилюминесцентный субстрат для хемилюминесценции обнаружение.

Колориметрические системы обнаружения

Обнаружение Метод Подложка Обнаружение Чувствительность Сигнал Цвет Продукт Параметры Преимущества
Обнаружение и подложка
Иммуноблоттинг Наборы для анализа Наборы Сухой Порошок
Колориметрический HRP 4CN 500 стр. Фиолетовый X X X Быстрое проявление цвета, низкая стоимость, низкая фоновая активность ферментов
Колориметрический HRP DAB 500 стр. Коричневый & nbsp; & nbsp; X Нерастворимый продукт, легко образующий хелат с четырехокиси осмия.Чувствительность может быть усилен добавлением металлов
Колориметрический HRP Opti-4CN & trade; 100 стр. Фиолетовый X & nbsp; & nbsp; Высокая чувствительность, немеркнущий цвет, низкий фон
Колориметрический HRP Opti-4CN с усилением 5 стр. Фиолетовый X & nbsp; & nbsp; Наилучшая доступная чувствительность & mdash; равный хемилюминесценции; Комплект предоставляет все необходимые компоненты
Колориметрическая точка доступа BCIP / NBT 100 стр. Фиолетовый X X X Высокая чувствительность

Предварительно смешанный индивидуальный колориметрический субстрат
Предварительно смешанный наборы ферментных субстратов и реактивы для проявления, в том числе порошковые 4CN и DAB красители реагенты проявки, также доступны.Готовые наборы удобны и надежны, и они снижают воздействие опасных реагентов, используемых для окрашивания белков. кляксы.

Иммуноблот & reg; Наборы для анализа
Иммун-Блот наборы для анализа содержат реагенты, необходимые для стандартной колориметрии HRP / 4CN или AP. обнаружение на вестерн-блоттинге с дополнительным удобством предварительно смешанных буферов и ферментов подложки.Кроме того, эти наборы содержат вторичные антитела, конъюгированные с HRP или AP. Все компоненты набора проходят индивидуальную проверку качества при применении блоттинга. В каждый комплект входит инструкция по эксплуатации с тщательно протестированным протоколом и руководство по поиску и устранению неисправностей, которое упрощает иммунологическое выявление.

Opti-4CN & trade; и усиленный Opti-4CN субстрат и комплекты обнаружения
Колориметрическое обнаружение HRP с 4CN уже предлагает очень низкий фон и обнаружение чувствительность около
500 пг антигена. Opti-4CN от Bio-Rad kit увеличивает эту чувствительность обнаружения до 100 пг. Opti-4CN доступен как предварительно смешанный набор субстратов или в сочетании с антителом, конъюгированным с HRP, при обнаружении комплект.

усиленный Субстрат Opti-4CN и наборы для обнаружения основаны на запатентованной HRP-активируемой амплификации. реагенты от Bio-Rad.Эти наборы позволяют колориметрическое обнаружение до 5 пг, сопоставление или даже превышающая чувствительность, достигаемую радиометрической и некоторой хемилюминесценцией системы, но без затрат или времени на разработку блотов в темной комнате.

Обнаружение хемилюминесценции

Хемилюминесценция возникает, когда химический субстрат катализируется ферментом, например как AP или HRP, и производит свет как побочный продукт [см. рисунки выше].Световой сигнал могут быть захвачены на рентгеновской пленке или с помощью устройства формирования изображения с зарядовой связью (ПЗС), такого как Система ChemiDoc XRS + и ChemiDoc MP System . Эта технология легко адаптируется к существующим процедурам вестерн-блоттинга, поскольку хемилюминесценция использует конъюгированные с ферментом антитела для активации светового сигнала.Методы блокировки и промывки знакомы.

Преимущества хемилюминесцентного вестерн-блоттинга по сравнению с другими методами - скорость и чувствительность (см. таблицу ниже). Этот метод идеален для ПЗС-изображений, для которых типичное время экспозиции блотов составляет от 5 секунд до 5 минут, в зависимости от от чувствительности субстрата. Это большое улучшение по сравнению с 125 I системы, которым может потребоваться до 48 часов для экспонирования пленки.Обнаружение протеина вниз к суммам фемтограмм возможно с этими системами. Это более чувствительно, чем большинство колориметрические системы и сопоставимы с радиоизотопным детектированием. Чувствительность обнаружения зависит от аффинности белка, первичного антитела, вторичного антитела и Субстрат HRP и может варьироваться от образца к образцу.

Системы обнаружения хемилюминесценции

Метод обнаружения Подложка Чувствительность обнаружения Параметры продукта Преимущества Недостатки
Хемилюминесцентный HRP
Immun-Star HRP Люминол 1 & ndash; 3 стр. Конъюгаты Короткая (30 секунд) выдержка Азид подавляет активность ферментов
& nbsp; & nbsp; субстрат HRP Продолжительность сигнала 6 & ndash; 8 часов & nbsp;
& nbsp; & nbsp; Наборы для иммуноблоттинга Совместим с ПВДФ и нитроцеллюлозой
Рабочий раствор стабилен в течение 24 часов при комнатной температуре
Immun-Star WesternC Люминол Фемтограмма Конъюгаты Продолжительность сигнала до
24 часов
Азид подавляет активность ферментов
Оптимизирован для устройств формирования изображений ПЗС
Высокая чувствительность
Хемилюминесцентный AP
AP Immun-Star CDP- звездочка 10 стр. Конъюгаты От 30 секунд до 5 минут Эндогенная фосфатаза активность может привести к ложным срабатываниям
Подложка AP Продолжительность сигнала до
24 часов
Наборы для иммуноблоттинга Блот можно активировать повторно

Безопасность - еще одно преимущество хемилюминесцентного обнаружения.У него нет проблемы безопасности, связанные с обнаружением изотопов, такие как воздействие на персонал радиация, высокие затраты и экологические проблемы.

Иммун-Стар и трейд; Наборы для хемилюминесценции
Наборы Immun-Star включают субстрат CDP-Star (активируется AP) или люминол (активируется HRP) и производят сильный сигнал как на нитроцеллюлозе, так и на ПВДФ.Световой сигнал генерируется с наборами Immun-Star не только обеспечивает быстрое воздействие, но и длится столько же, сколько и 24 часа ( Immun-Star & trade; WesternC и торговля; Набор для хемилюминесценции и Immun-Star & trade; AP Kits ) после первоначальной активации блота.Эти кляксы можно реагировать с помощью свежий субстрат, даже через несколько недель после исчезновения сигнала. Их также можно раздеть и переодевались несколько раз.

Набор для хемилюминесценции Immun-Star WesternC разработан для использования с Точность Плюс протеин и торговля; WesternC и торговля; стандарты и системы визуализации ПЗС.Это предлагает чувствительность на уровне фемтограммы и совместимость с любыми антителами, конъюгированными с HRP (см. Рисунок ниже). Обеспечивается высокая интенсивность сигнала, оптимизированная для визуализации на ПЗС-матрице.

Обнаружение антигена и стандартов Precision Plus Protein WesternC

Обнаружение антигена и точность Стандарты Plus Protein WesternC с использованием хемилюминесцентного детектора Immun-Star WesternC комплект .Белки и 5 мкл белковых стандартов (дорожка 1) и серия разведений из E. coli клеточный лизат (дорожки 2 & ndash; 6) подвергали электрофорезу на 4 & ndash; 20% Критерий и торговля; гель и перенесен на нитроцеллюлозную мембрану. Блот зондировали с антителом, специфичным для слитых белков GST, за которым следует вторичный конъюгированный с HRP антитело и конъюгат StrepTactin-HRP.После 5-минутной инкубации в Immun-Star Решение для обнаружения WesternC, блот визуализировали на тепловизоре ChemiDoc XRS + в течение 5 секунд.

Обнаружение флуоресценции

При обнаружении флуоресценции первичное или вторичное антитело, меченное флуорофором. используется при иммунодетекции.Источник света возбуждает флуорофор и излучаемый флуоресцентный сигнал фиксируется камерой для получения окончательного изображения. Во флуоресценции фотон высокой энергии (hv ex ) возбуждает флуорофор, заставляя его уйти основное состояние (S 0 ) и перейти в состояние с более высокой энергией (S ' 1 ). Часть этой энергии рассеивается, позволяя флуорофору войти в расслабленное возбужденное состояние. состояние (S 1 ).Излучается фотон света (hv ex ), возвращающий флуорофор в основное состояние. Испускаемый фотон имеет более низкую энергию (большую длину волны) из-за рассеивания энергии в возбужденном состоянии.

Обнаружение флуоресценции

При использовании детектирования флуоресценции учитывайте следующие оптические характеристики. флуорофоров для оптимизации сигнала:

  • Квантовый выход - эффективность испускания фотонов после поглощения. фотона.Процессы, которые возвращают флуорофор в основное состояние, но не в результате испускания флуоресцентного фотона снижается квантовый выход. Флуорофоры с более высокими квантовыми выходами, как правило, ярче
  • Коэффициент экстинкции - показатель того, насколько хорошо флуорофор поглощает свет определенной длины волны. Поскольку поглощение зависит от длины пути и концентрации (закон Бера) коэффициент экстинкции обычно выражается в см -1 M -1 .& nbsp; Как и в случае с квантовым выходом, флуорофоры с более высокими коэффициентами экстинкции являются обычно ярче
  • Стоксов сдвиг - разница в максимальном возбуждении и длины волн излучения флуорофора. Поскольку некоторая энергия рассеивается, пока флуорофор находится в возбужденном состоянии, испускаемые фотоны имеют меньшую энергию (большую длину волны), чем свет, используемый для возбуждения.Большие стоксовы сдвиги минимизируют перекрытие между возбуждением и длины волн излучения, увеличивающие детектируемый сигнал
  • Спектры возбуждения и испускания & mdash; спектры возбуждения графики интенсивности флуоресценции флуорофора в диапазоне возбуждения длины волн; Спектры излучения показывают длины волн излучения флуоресцирующей молекулы.Выберите флуорофоры, которые могут возбуждаться источником света в тепловизоре и которые имеют спектры излучения, которые могут быть зафиксированы прибором. При выполнении мультиплексного Вестерны, выбирайте флуорофоры с минимально перекрывающимися спектрами, чтобы избежать канала перекрестные помехи

Спектры возбуждения и излучения

Несколько флуорофоров, охватывающих широкий диапазон длин волн возбуждения и излучения. теперь доступны, в том числе на основе органических красителей (например, цианина и флуоресцеин), нанокристаллы полупроводникового материала и естественно флуоресцентные белки (например, фикобилипротеины, такие как фикоэритрин и аллофикоцианин).

Обнаружение флуоресценции (см. рисунок ниже) имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методы:

  • Мультиплексирование - использование нескольких и разноцветных флуорофоры для одновременного обнаружения нескольких белков-мишеней на одном блоте. При обнаружении нескольких белков с помощью флуоресцентного мультиплексного вестерн-блоттинга убедитесь, что флуоресцентные сигналы, генерируемые для каждого белка, можно дифференцировать.Использовать первичный антитела от разных видов хозяев (например, мыши и кролика) и вторичные антитела, которые перекрестно абсорбируются против других видов, чтобы избежать перекрестной реактивности. Используйте флуорофоры, конъюгированные со вторичными антителами с различными спектрами, чтобы они можно оптически отличать друг от друга, чтобы избежать перекрестной флуоресценции.
  • Динамический диапазон - в 10 раз больший динамический диапазон по сравнению с хемилюминесценцией. обнаружение и, следовательно, лучшая линейность в пределах обнаружения
  • Стабильность & mdash; многие флуоресцентные молекулы стабильны в течение длительный период времени, позволяющий сохранять кляксы для последующего повторного отображения & ndash; часто через несколько недель или месяцев & ndash; без значительной потери сигнала.Наибольшая флуоресценция методы также совместимы с протоколами снятия изоляции и повторного зондирования при условии, что Блоты не должны высыхать между последовательными раундами обнаружения вестерн-блоттинга.

& nbsp;

Мультиплексное обнаружение флуоресценции

Обнаружение мультиплексной флуоресценции серии двукратных разведений двух белков, GST (красный) и ингибитора трипсина сои (зеленый). Начальная концентрация составляла 500 нг каждого белка. Точность Плюс Белок и торговля; WesternC и торговля; стандарты использовались в качестве маркеров.

Другие методы обнаружения

Биолюминесценция
Биолюминесценция - это естественное излучение света. многими организмами.Биолюминесцентные системы различаются по структуре и функциям ферменты и кофакторы, участвующие в процессе, а также механизм генерации света реакции. Биолюминесценция также используется как метод обнаружения белков и нуклеиновых кислот. кислоты на мембране.

Обнаружение биолюминесценции включает инкубацию мембраны (со связанным антиген-антитело-фермент комплекс) в биолюминогенном субстрате и одновременное измерение излучаемого света (см. рисунок ниже).Субстрат, участвующий в этом обнаружении система представляет собой производное на основе люциферина. Детектирование света осуществляется с помощью подсчета фотонов. камера и промокшие белки визуализируются в виде ярких пятен. Эта техника похожа на хемилюминесценцию по своей чувствительности и скорости обнаружения, но широко не используются, и некоторые биолюминогенные субстраты коммерчески доступны. ПВДФ является предпочтительной мембраной для обнаружения биолюминесценции, поскольку нитроцеллюлозные мембраны могут содержать вещества, подавляющие активность люциферазы.

Хемифлуоресценция
Хемифлуоресценция - это ферментативное превращение подложки к флуоресцентному продукту (см. рисунок ниже). Флуорогенные соединения (нефлуоресцентные или слабо флуоресцентные вещества, которые могут быть преобразованы в флуоресцентные продукты) доступны для использования с широким спектром ферментов, включая AP и HRP.Фермент отщепляет фосфатную группу от флуорогенного субстрата. чтобы получить высоко флуоресцентный продукт. Флуоресценцию можно обнаружить с помощью флуоресценции. имидж-сканер, такой как PharosFX System или ChemiDoc Система МП . Хемифлуоресценция обеспечивает стабильный флуоресцентный продукт реакции, поэтому пятна можно сканировать позже. Этот метод также совместим со стандартными процедуры зачистки и повторного зондирования.

Авторадиография
Гамма-излучающий радиоизотоп 125 I может использоваться для маркировки лизинов в иммуноглобулинах для радиометрического обнаружения антигенов (см. рисунок ниже). Прямое иммунологическое обнаружение (с использованием меченые вторичные антитела) всего 1 мкг точечного иммуноглобулина с высокой удельной активностью 125 I. зонды.Помеченные радиоактивным изотопом пятна могут быть обнаружены используя рентгеновскую пленку, метод, известный как авторадиография. Из-за связанных опасностей с радиоактивно меченными конъюгатами популярность авторадиографии снижается в пользу колориметрических и хемилюминесцентных методов.

Маркировка иммунным золотом
В методах обнаружения иммунного золота используются меченные золотом вторичные антитела для обнаружения антигена.Поскольку этот метод имеет относительно низкая чувствительность и непостоянный сигнал, методы усиления серебра аналогичны к описанным для окрашивания общего белка коллоидного золота были разработаны как средство усиления сигнала (см. рисунок ниже). При использовании серебра фон создается на блот и чувствительность увеличиваются в 10 раз, что эквивалентно колориметрическому обнаружению AP и в несколько раз более чувствительна, чем авторадиография.

Механизм обнаружения химии

Механизм обнаружения химического состава. При обнаружении биолюминесценции ( A ) сама ферментативная реакция испускает свет, в то время как в хемофлуоресценции ( B ) продукт реакции флуоресцентный.При авторадиографии ( C ) само вторичное антитело несет радиоактивную метку, а в маркировке иммунозолота ( D ) вторичные антитела помечены золотом, а сигнал усиливается осаждением серебра.

Ссылки

Байер Э.А. и Вильчек М. (1980). Использование авидин-биотинового комплекса в качестве инструмента в молекулярная биология.Методы Biochem Anal 26, 1 & ndash; 45.

Блейк М.С. и др. (1984). Быстрый и чувствительный метод обнаружения конъюгированной щелочной фосфатазой анти-антитела на Вестерн-блоттинге. Anal Biochem 136, 175 & ndash; 179.

Чайет Л. и Вольф Ф. Дж. (1964). Свойства стрептавидина, биотин-связывающего белка производится Streptomyces. Arch Biochem Biophys 106, 1 & ndash; 5.

Гесдон Дж. Л. и др.(1979). Использование авидин-биотинового взаимодействия в иммуноферментных техники. J Histochem Cytochem 27, 1131 & ndash; 1139.

Хоукс Р. и др. (1982). Анализ точечного иммунного связывания для моноклональных и других антител. Anal Biochem 119, 142 & ndash; 147.

Хсу С.М. и др. (1981). Использование комплекса авидин-биотин-пероксидаза (ABC) в иммунопероксидазе методы: сравнение процедур ABC и немеченых антител (PAP).J Histochem Cytochem 29, 577 & ndash; 580.

Куриен Б.Т. и Скофилд Р.Х. (2003 г.). Белковый блоттинг: обзор. J Immunol методы 274, 1 & ndash; 15.

Цанг В.К. и др. (1985). Иммуноэлектротрансферный блот с ферментом (EITB). В ферментно-опосредованном Иммуноанализ. T.T. Ngo и H.M. Ленхофф, ред. (Нью-Йорк: Plenum Press), стр. 389 & ndash; 414.

Протоколы
Число Описание Параметры
6216 Состав буфера для обнаружения Нажмите, чтобы загрузить
6218 Удаление пятен & amp; Репробирование Нажмите, чтобы загрузить
6219 Иммунодетекция Нажмите, чтобы загрузить
5881 Расширенный мультиплексный флуоресцентный вестерн-блоттинг, ред. A5881 / webroot / web / pdf / lsr / Lithuania / Bulletin_5881.pdfLiteraturePDFApplication_Notes / webroot / web / images / general / icons / icon_pdf.gifNo5881, детектирование белков на основе флуоресценции, обнаружение белков на основе флуоресценции на кляксах, система визуализации Molecular Imager VersaDoc MP, системы визуализации, техническое примечание, бюллетень 5881, Rockland Immunochemicals, одновременное зондирование, иммуноблот, иммуноблоттинг, Программное обеспечение для одномерного анализа Quantity One, флуорофор, флуорофор, возбуждение, 170-9600, 1709600, 170-8640, 1708640, 170-8650, 1708650 2895 Руководство по блоттингу белков, версия C2895 / webroot / web / pdf / lsr / Literate / Bulletin_2895.pdfLiteraturePDFOther / webroot / web / images / general / icons / icon_pdf.gifРуководство по белковому блоттингуNoProtein Blotting Guide, Ver C2895 Bulletin 2895, пероксидаза хрена (HRP), комплекс фермент-антитело, щелочная фосфатаза (AP), таблетки нитросинего тетразолия (NBT), BCIP, вторичный датчик антител, амидочерный, стрептавидин-биотин, анионный краситель, пятно для блоттинга общего белка, нитроцеллюлоза, подложка нитроцеллюлоза или поливинилидендифторид (ПВДФ) или низкофлюоресцентные мембраны ПВДФ LF, антитело, иммуноглобулин (IgG), антиген, анализ, авидин, биотин, фон, неспецифический шум, буфер Бьеррума Шафера-Нильсена, блокирующий реагент, вестерн-блоттинг, BLOTTO, хемилюминесценция, коллоидное золото, реагент для проявления цвета, колориметрическое обнаружение, хемилюминесцентное обнаружение, конъюгат фермент-антитело, краситель кумасси синий, диаминобензидин (DAB), дот-блот, буфер Данна, электрофоретический блоттинг, поролоновые подушечки, фильтровальная бумага, желатин, высокоинтенсивный перенос, иммуноанализ, иммуноблоттинг, иммунодетекция, лиганд, мембрана, сэндвичи с мембраной / фильтровальной бумагой, микрофильтрация, блоттинг, мультиплексирование, мультиэкран аппарат, нативный PAGE, электрофорез в полиакриламидном геле, NHS-биотин, неферментативный зонд, неферментативный зонд, обезжиренное сухое молоко, неспецифическое связывание, фикобилипротеин, источник питания, первичные антитела, предварительно окрашенные стандарты, маркеры молекулярной массы или лестницы, протеин A, протеин G, быстрый полусухой блоттинг, SDS-PAGE, додецилсульфат натрия, додецилсульфат натрия, отношение сигнал / шум, отношение сигнал / шум, Без пятен технология, ПЗС-сканер, устройство с зарядовой связью, StrepTactin, последовательность Strep-tag, субстрат, змеевик суперохлаждения, промокание бака, буфер Towbin, Tween 20 3179 Флуоресцентные наночастицы для вестерн-блоттинга, Ред. A3179 / webroot / web / pdf / lsr /rature / Bulletin_3179.pdfLiteraturePDFBrochures_and_Specifications / webroot / web / images / general / icons / icon_pdf.gif Нет флуоресцентных наночастиц для вестерн-блоттинга, Rev A3179detection, иммунный, мультиплексный, qd, 1708640, антитела, точка, LIT3179, мультиплексирование, чувствительность, 170-8640, 1709450, иммунная звезда, флуоресценция, иммунная звезда, иммунная звезда, маркированная, мультиплекс, наночастица, pharos fx, q, 1708650, дот-блоты, сравнение, конъюгаты, молекулярный имидж-сканер, система pharosfx, qd-метка, квантовая точка, наоборот, 170-8650, блот, конъюгат, дот-блот, qdot, 170-9450, блоты, визуализация, этикетка, наночастицы, наночастицы, q-точка сопряжена, версадок 4000 5809 Получение изображений хемилюминесцентных вестерн-блотов: сравнение цифровых изображений и рентгеновских лучей Фильм, Rev A 5809 / webroot / web / pdf / lsr / Lithuania / Bulletin_5809.pdfLiteraturePDFApplication_Notes / webroot / web / images / general / icons / icon_pdf.gifNo Изображение хемилюминесцентных вестерн-блотов: сравнение цифровых изображений и рентгеновских снимков Фильм, Rev A 5809 Блокирующие устройства, камеры с зарядовой связью, динамический диапазон, LIT5809, Molecular Imager Система ChemiDoc XRS, интенсивность полосы, формирователи изображения, комплект Immun-Star WesternC, бюллетень 5809, Программное обеспечение для одномерного анализа Quantity One, обнаружение сигнала, техническая информация, хемилюминесценция, Системы VersaDoc MP 4000 и 5000, камера CCD, цифровой захват люминесцентных сигналов, Калиброванный денситометр GS-800, однократная экспозиция, визуализация блоттинга 5723 Увеличьте пропускную способность вестерн-блоттинга с помощью мультиплексной флуоресцентной детекции, Ред. B5723 / webroot / web / pdf / lsr /rature / Bulletin_5723.pdfLiteraturePDFApplication_Notes / webroot / web / images / general / icons / icon_pdf.gif Нет Увеличьте пропускную способность вестерн-блоттинга с помощью мультиплексной флуоресцентной детекции Rev B5723bulletin 2895, Criterion, Molecular Imager VersaDoc MP systems, руководство, на основе флуоресценции визуализация, несколько мишеней, стандарты Precision Plus Protein, флуоресценция, PharosFX система, RGB, Блоттинг, устройство с зарядовой связью, светодиод, гели ReadyGel, CCD, устранение неисправностей, WesternC стандартный, инструкция по применению, LIT5723, мембрана с низким уровнем флуоресценции, программное обеспечение Quantity One, красный зеленый и синее возбуждение Life Science Research / Продукция / Электрофорез и блоттинг / Электрофорез белков и блоттинг / вестерн-блоттинг / реагенты и наборы для иммунодетекции / иммуноблоттинг AP Chemistry Колориметрические наборы -> MT :: 3061b982-7f30-412c-b69d-179103a7e86c ## Life Science Research / Products / Electrophoresis и блоттинг / электрофорез и блоттинг белков / вестерн-блоттинг / иммунодетекция Реагенты и наборы / Колориметрические наборы Opti-4CN для иммуноблоттинга -> MT :: 274c03cb-afc8-4ff0-92d5-3838ef70d9db ## Life Science Research / Products / Электрофорез и блоттинг / электрофорез и блоттинг белков / вестерн-блоттинг / иммунодетекция Реагенты и наборы / Наборы для хемилюминесценции Immun-Star HRP -> MT :: e08909eb-3369-42ec-a585-df18

68f ## Исследования в области естественных наук / Продукция / Электрофорез и блоттинг / электрофорез и блоттинг белков / вестерн-блоттинг / иммунодетекция Реагенты и наборы / Наборы для хемилюминесценции Immun-Star AP -> MT :: e08909eb-3369-42ec-a585-df18

68f ## Эдди CD Методы обнаружения 12.09.11 10:34 AM 12.09.21 10:36 AMAE, AI, AL, AM, AR, AT, AU, AZ, BA, BD, BE, BF, BG, BH, BN, BO , BR, BW, CA, CH, CL, CM, CN, CO, CR, CY, CZ, DE, DK, DO, DZ, EC, EE, EG, EH, ER, ES, ET, FI, FM, FO , FR, GA, GE, GF, GH, GP, GR, GT, GU, HK, HN, HR, HT, HU, ID, IE, IL, IN, IS, IT, JM, JO, JP, KE, KH , KR, KW, KZ, LB, LI, LK, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, ML, MO, MQ, MS, MT, MU, MX, MY, NG, NI, NL, NO , NP, NZ, OM, PA, PE, PF, PG, PH, PK, PL, PR, PS, PT, PW, PY, QA, RO, RS, RU, SA, SB, SE, SG, SI, SK , SN, ST, SV, TG, TH, TN, TO, TR, TT, TW, TZ, UA, UG, UK, US, UY, UZ, VA, VE, VU, XK, YE, ZA, VNenLSR / LSR / Технологии / Western_BlottingN0 Life Science Research / Решения / Технологии / Двумерный электрофорез -> MTS :: LUSQG6LPT ## Life Science Research / Solutions / Technologies / Белковый электрофорез -> MTS :: LUSOVO47B ## Исследования в области биологии / Решения / Приложения / Разделение белков и Анализ / Быстрое разделение Перенос и анализ -> МТС :: LUSOUMFCN ## Исследования в области наук о жизни / Решения / Технологии / Двумерный электрофорез -> MTS :: LUSQG6LPT ## Life Science Research / Solutions / Technologies / Белковый электрофорез -> MTS :: LUSOVO47B ## Исследования в области биологии / Решения / Приложения / Разделение белков и Анализ / Быстрое разделение Перенос и анализ -> МТС :: LUSOUMFCN ## 0 Введение в Immunodetection / ru-ru / applications-technologies / detection-methods? ID = LUSQ4HE8Z

В этом разделе представлен обзор различных методов обнаружения, используемых для визуализации белков после иммунодетекции.Теория, лежащая в основе нескольких широко используемых методов обнаружения вестерн-блоттинга, таких как колориметрические, хемилюминесцентные и флуоресцентные методы, а также других менее распространенных методов, таких как хемифлуоресценция, авторадиография и методы мечения иммунным золотом, освещена ниже.

Связанные темы : Отбор и разведение антител, удаление и повторное зондирование мембран и вестерн-блоттинг.

Содержание страницы

Мембранно-связанные белки обычно обнаруживаются с помощью вторичных антител, меченных радиоизотопами или коллоидным золотом, или конъюгированных с флуоресцентными молекулами (флуорофорами) или ферментом, таким как щелочная фосфатаза (AP) или пероксидаза хрена (HRP).В ранних системах блоттинга использовались реагенты, меченные 125 I, аналогичные тем, которые используются в радиоиммуноанализах. Эти системы обеспечивают чувствительные результаты, но особые проблемы обращения с реагентами 125 I и их утилизации препятствуют дальнейшему использованию этого метода. С тех пор был разработан ряд ферментных систем и реагентов для обнаружения.

Механизм обнаружения химии. В каждом методе вестерн-блоттинга детектируемый сигнал генерируется после связывания антитела, специфичного для интересующего белка.При колориметрическом обнаружении ( A ) сигнал представляет собой окрашенный осадок. При хемилюминесценции ( B ) сама реакция излучает свет. При обнаружении флуоресценции ( C ) антитело метят флуорофором.

Наиболее распространенные методы обнаружения используют вторичные антитела, конъюгированные с AP или HRP. В этих методах, когда добавляется ферментный субстрат, либо окрашенный осадок осаждается на блоте (колориметрическое обнаружение), либо образуется хемилюминесцентный или флуоресцентный продукт, и световой сигнал фиксируется на пленке или с помощью системы цифрового изображения (см. Рисунок выше. ).Вторичные антитела, конъюгированные с флуорофорами, набирают популярность и могут быть непосредственно визуализированы и захвачены совместимым имидж-сканером без необходимости в дополнительном жидком субстрате (см. Обнаружение флуоресценции).

Колориметрические системы HRP
Системы HRP имеют преимущество перед другими системами обнаружения в том, что как ферментный конъюгат, так и субстраты для колориметрического обнаружения являются экономичными. Наиболее распространенными субстратами для колориметрической HRP являются 4-хлор-1-нафтол (4CN) (Hawkes et al.1982) и 3,3'-диаминобензидин (DAB) (Tsang et al. 1985) (см. Рисунок ниже). Некоторыми ограничениями колориметрических систем обнаружения HRP являются пониженная чувствительность по сравнению с колориметрическими системами обнаружения AP, исчезновение пятен под воздействием света, ингибирование активности HRP азидом и неспецифическое окрашивание.

Ферменты, такие как AP и HRP, превращают несколько субстратов в окрашенный осадок (см. Таблицу ниже). По мере того, как осадок накапливается на пятне, появляется цветной сигнал, который легко виден глазом на пятне.Ферментативную реакцию можно отслеживать и останавливать, когда желаемый сигнал превышает фон. Колориметрическое обнаружение проще в использовании, чем методы обнаружения на основе пленки, которые требуют проб и ошибок при определении подходящего времени экспонирования и используют дорогостоящие материалы, такие как рентгеновская пленка и химические вещества для фотолаборатории. Колориметрическое обнаружение считается методом средней чувствительности по сравнению с радиоактивным или хемилюминесцентным обнаружением.

Колориметрические возможности обнаружения с помощью HRP. DAB и 4CN - обычно используемые хромогенные субстраты для HRP. В присутствии H 2 O 2 HRP катализирует окисление субстрата до продукта, который виден на блоте. Слева реакция с DAB; справа, реакция с 4CN.

Колориметрические системы AP

Колориметрические системы AP используют растворимый 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP) и нитросиний тетразолий (NBT) в качестве субстратов для получения стабильного продукта реакции, который не тускнеет (см. Рисунок ниже).АП можно легко инактивировать воздействием кислых растворов. Множественное зондирование одной и той же мембраны с помощью альтернативных зондов антител можно проводить с использованием субстратов, которые производят разные цвета, такие как синий и красный (Blake et al. 1984, Turner 1983, Kurien and Scofield 2003).

Колориметрическая проявка AP. В колориметрической системе АР катализирует субстраты BCIP и NBT с образованием окрашенного осадка, визуализирующего белок на вестерн-блоттинге. Сначала происходит дефосфорилирование BCIP с помощью AP с образованием промежуточного бромхлориндоксила.Затем индоксил окисляется NBT с образованием индигоидного красителя (пурпурный осадок). NBT также восстанавливается индоксилом, раскрывая тетразольное кольцо с образованием нерастворимого диформазана (синий осадок). Комбинация индигоидного красителя BCIP и нерастворимого формазана NBT образует осадок пурпурно-синего цвета.

Колориметрические и хемилюминесцентные блоты. Разведение слитого белка GST было иммунодетектировано с использованием моноклонального антитела, специфичного к GST, за которым следовало A , АР-конъюгированное вторичное антитело и субстрат BCIP / NBT для колориметрического обнаружения, или B , вторичное антитело, конъюгированное с HRP, и Хемилюминесцентный субстрат Immun-Star ™ WesternC ™ для хемилюминесцентного обнаружения.

Колориметрические системы обнаружения

Обнаружение и подложка
Наборы для иммуноблоттинга Комплекты Сухой порошок
Колориметрический HRP 4CN 500 стр. фиолетовый х х х Быстрое проявление цвета, низкая стоимость, низкая фоновая активность ферментов
Колориметрический HRP DAB 500 стр. Коричневый х Нерастворимый продукт, легко образует хелат с четырехокиси осмия.Чувствительность можно дополнительно повысить, добавив металлы
Колориметрический HRP Opti-4CN ™ 100 стр. фиолетовый х Высокая чувствительность, немеркнущие цвета, низкий фон
Колориметрический HRP Opti-4CN с усилителем 5 стр. фиолетовый х Наилучшая доступная чувствительность - соответствует хемилюминовой способности; комплект содержит все необходимые компоненты
Колориметрическая AP BCIP / NBT 100 стр. фиолетовый х х х Высокая чувствительность

Предварительно смешанный и индивидуальный колориметрический субстрат
Также доступны наборы предварительно смешанных ферментных субстратов и реактивы для проявления, включая порошковые реагенты для проявления цвета 4CN и DAB.Предварительно приготовленные наборы удобны и надежны, и они снижают воздействие опасных реагентов, используемых при окрашивании белковых блотов.

Immun-Blot ® Наборы для анализа
Наборы для анализа Immun-Blot предоставляют реагенты, необходимые для стандартного колориметрического определения HRP / 4CN или AP на вестерн-блотах, с дополнительным удобством предварительно смешанных буферов и ферментных субстратов. Кроме того, эти наборы содержат вторичные антитела, конъюгированные с HRP или AP. Все компоненты набора проходят индивидуальную проверку качества при применении блоттинга.В каждый комплект входит инструкция по эксплуатации с тщательно протестированным протоколом и руководством по поиску и устранению неисправностей, упрощающее иммунологическое выявление.

Opti-4CN ™ и усиленный Opti-4CN субстрат и комплекты для обнаружения
Колориметрическое обнаружение HRP с 4CN уже предлагает очень низкий фон и чувствительность обнаружения около
500 пг антигена. Комплект Opti-4CN от Bio-Rad повышает эту чувствительность обнаружения до 100 пг. Opti-4CN доступен в виде предварительно смешанного набора субстратов или в сочетании с антителом, конъюгированным с HRP, в наборе для обнаружения.

Амплифицированный субстрат Opti-4CN и наборы для обнаружения основаны на патентованных реактивах для амплификации, активируемых HRP, от Bio-Rad. Эти наборы позволяют колориметрическое обнаружение до 5 пг, что соответствует или даже превышает чувствительность, достигаемую с помощью радиометрических и некоторых хемилюминесцентных систем, но без затрат или времени, связанных с проявлением блотов в темной комнате.

Хемилюминесценция возникает, когда химический субстрат катализируется ферментом, таким как AP или HRP, и производит свет в качестве побочного продукта [см. Рисунки выше].Световой сигнал может быть записан на рентгеновскую пленку или с помощью устройства формирования изображения с зарядовой связью (CCD), такого как ChemiDoc XRS + System и ChemiDoc MP System. Эта технология легко адаптируется к существующим процедурам вестерн-блоттинга, поскольку хемилюминесценция использует конъюгированные с ферментом антитела для активации светового сигнала. Методы блокировки и промывки - знакомые процедуры.

Преимуществами хемилюминесцентного вестерн-блоттинга перед другими методами являются скорость и чувствительность (см. Таблицу ниже). Этот метод идеально подходит для получения изображений на ПЗС-матрице, время воздействия которых обычно составляет от 5 секунд до 5 минут, в зависимости от чувствительности подложки.Это большое улучшение по сравнению с системами 125 I, для экспонирования которых может потребоваться до 48 часов. С помощью этих систем возможно определение количества белка до фемтограмм. Это более чувствительно, чем большинство колориметрических систем, и сравнимо с радиоизотопным обнаружением. Чувствительность обнаружения зависит от аффинности белка, первичного антитела, вторичного антитела и субстрата HRP и может варьироваться от одного образца к другому.

Системы обнаружения хемилюминесценции

Метод обнаружения Подложка Чувствительность обнаружения Опции продукта Преимущества Недостатки
Хемилюминесцентный HRP
Иммун-Стар HRP Люминол 1–3 стр. Конъюгаты Короткая (30 сек) выдержка Азид подавляет активность ферментов
Субстрат HRP Продолжительность сигнала 6–8 часов
Наборы для иммуноблоттинга Совместим с ПВДФ и нитроцеллюлозой
Рабочий раствор, стабильный в течение 24 часов при комнатной температуре
Иммун-Стар WesternC Люминол Фемтограмма Конъюгаты Продолжительность сигнала до
24 часа
Азид подавляет активность ферментов
Оптимизирован для ПЗС-изображений
Высокая чувствительность
Хемилюминесцентный AP
Иммун-Стар AP CDP- Звезда 10 стр. Конъюгаты Экспозиция от 30 секунд до 5 минут Активность эндогенной фосфатазы может приводить к ложноположительным результатам
AP подложка Продолжительность сигнала до
24 часа
Наборы для иммуноблоттинга Блот можно реактивировать

Безопасность - еще одно преимущество хемилюминесцентного обнаружения.У него нет проблем безопасности, связанных с обнаружением изотопов, таких как облучение персонала радиацией, высокие затраты и экологические проблемы.

Наборы для хемилюминесценции Immun-Star ™
Наборы Immun-Star включают либо субстрат CDP-Star (активированный AP), либо люминол (активируемый HRP) и производят сильный сигнал как на нитроцеллюлозе, так и на PVDF. Световой сигнал, генерируемый наборами Immun-Star, не только обеспечивает быстрое воздействие, но и длится до 24 часов (наборы Immun-Star ™ WesternC ™ Chemiluminescence Kit и Immun-Star ™ AP) после начальной активации блоттинга.Эти блоты могут реагировать со свежим субстратом даже через несколько недель после исчезновения сигнала. Их также можно снимать и переодевать несколько раз.

Набор для хемилюминесценции Immun-Star WesternC разработан для использования со стандартами Precision Plus Protein ™ WesternC ™ и системами визуализации CCD. Он обеспечивает чувствительность на уровне фемтограмм и совместимость с любыми антителами, конъюгированными с HRP (см. Рисунок ниже). Обеспечивается высокая интенсивность сигнала, оптимизированная для визуализации ПЗС.

Обнаружение антигена и стандартов Precision Plus Protein WesternC с использованием набора для хемилюминесцентного обнаружения Immun-Star WesternC .Белки и 5 мкл белковых стандартов (дорожка 1) и серии разведений лизата клеток E. coli (дорожки 2–6) подвергали электрофорезу на 4–20% геле Criterion ™ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Блот анализировали антителом, специфичным для слитых белков GST, а затем вторичным антителом, конъюгированным с HRP, и конъюгатом StrepTactin-HRP. После 5-минутной инкубации в растворе для обнаружения Immun-Star WesternC блот визуализировали на имидж-сканере ChemiDoc XRS + в течение 5 секунд.

При обнаружении флуоресценции во время иммунодетекции используется первичное или вторичное антитело, меченное флуорофором.Источник света возбуждает флуорофор, и излучаемый флуоресцентный сигнал фиксируется камерой для получения окончательного изображения. При флуоресценции фотон высокой энергии (hv ex ) возбуждает флуорофор, заставляя его покинуть основное состояние (S 0 ) и перейти в состояние с более высокой энергией (S ' 1 ). Часть этой энергии рассеивается, позволяя флуорофору перейти в расслабленное возбужденное состояние (S 1 ). Излучается фотон света (hv ex ), возвращающий флуорофор в основное состояние.Испускаемый фотон имеет более низкую энергию (большую длину волны) из-за рассеивания энергии в возбужденном состоянии.

При использовании детектирования флуоресценции учитывайте следующие оптические характеристики флуорофоров для оптимизации сигнала:

  • Квантовый выход - эффективность испускания фотона после поглощения фотона. Процессы, которые возвращают флуорофор в основное состояние, но не приводят к испусканию флуоресцентного фотона, снижают квантовый выход.Флуорофоры с более высоким квантовым выходом обычно ярче
  • Коэффициент экстинкции - показатель того, насколько хорошо флуорофор поглощает свет определенной длины волны. Поскольку поглощение зависит от длины пути и концентрации (закон Бера), коэффициент экстинкции обычно выражается в см -1 M -1 . Как и в случае квантового выхода, флуорофоры с более высоким коэффициентом экстинкции обычно ярче
  • Стоксов сдвиг - разность максимальных длин волн возбуждения и излучения флуорофора.Поскольку некоторая энергия рассеивается, когда флуорофор находится в возбужденном состоянии, испускаемые фотоны имеют меньшую энергию (большую длину волны), чем свет, используемый для возбуждения. Большие стоксовы сдвиги минимизируют перекрытие между длинами волн возбуждения и излучения, увеличивая обнаруживаемый сигнал
  • Спектры возбуждения и излучения - Спектры возбуждения представляют собой графики интенсивности флуоресценции флуорофора в диапазоне длин волн возбуждения; Спектры излучения показывают длины волн излучения флуоресцирующей молекулы.Выберите флуорофоры, которые могут возбуждаться источником света в тепловизоре и которые имеют спектры излучения, которые может регистрировать прибор. При выполнении мультиплексных вестернов выбирайте флуорофоры с минимально перекрывающимися спектрами, чтобы избежать перекрестных помех каналов

В настоящее время доступно несколько флуорофоров, охватывающих широкий диапазон длин волн возбуждения и излучения, в том числе некоторые на основе органических красителей (например, цианина и флуоресцеина), нанокристаллов полупроводникового материала и естественно флуоресцентных белков (например, фикобилипротеинов, таких как фикоэритрин и аллофикоцианин. ).

Обнаружение флуоресценции (см. Рисунок ниже) имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами:

  • Мультиплексирование - использование нескольких флуорофоров разного цвета для одновременного обнаружения нескольких целевых белков на одном блоте. При обнаружении нескольких белков в мультиплексном флуоресцентном вестерн-блоте убедитесь, что флуоресцентные сигналы, генерируемые для каждого белка, можно дифференцировать. Используйте первичные антитела от разных видов хозяев (например, мыши и кролика) и вторичные антитела, которые перекрестно абсорбируются против других видов, чтобы избежать перекрестной реактивности.Используйте флуорофоры, конъюгированные со вторичными антителами с различными спектрами, чтобы их можно было оптически отличить друг от друга, чтобы избежать перекрестной флуоресценции
  • Динамический диапазон - В 10 раз больший динамический диапазон по сравнению с обнаружением хемилюминесценции и, следовательно, лучшая линейность в пределах обнаружения
  • Стабильность - Многие флуоресцентные молекулы стабильны в течение длительного периода времени, что позволяет сохранять блоты для последующего повторного отображения - часто через несколько недель или месяцев - без значительной потери сигнала.Большинство методов флуоресценции также совместимы с протоколами стриппинга и повторного зондирования при условии, что блоты не высыхают между последовательными раундами детектирования вестерн-блоттингом

Мультиплексное флуоресцентное обнаружение серии двукратных разведений двух белков, GST (красный) и ингибитора трипсина сои (зеленый). Начальная концентрация составляла 500 нг каждого белка. Стандарты Precision Plus Protein ™ WesternC ™ использовали в качестве маркеров.

Биолюминесценция
Биолюминесценция - это естественное излучение света многими организмами.Системы биолюминесценции различаются по структуре и функциям ферментов и кофакторов, участвующих в процессе, а также по механизму реакций генерации света. Биолюминесценция также используется как метод обнаружения белков и нуклеиновых кислот на мембране.

Обнаружение биолюминесценции включает инкубацию мембраны (со связанным комплексом антиген-антитело-фермент) в биолюминогенном субстрате и одновременное измерение излучаемого света (см. Рисунок ниже). Субстрат, задействованный в этой системе обнаружения, представляет собой производное люциферина.Детектирование света выполняется с помощью камеры для подсчета фотонов, и промокшие белки визуализируются в виде ярких пятен. Этот метод похож на хемилюминесценцию по своей чувствительности и скорости обнаружения, но он широко не используется, и на рынке имеется мало биолюминогенных субстратов. PVDF является предпочтительной мембраной для обнаружения биолюминесценции, поскольку мембраны из нитроцеллюлозы могут содержать вещества, ингибирующие активность люциферазы.

Хемифлуоресценция
Хемифлуоресценция - это ферментативное превращение субстрата во флуоресцентный продукт (см. Рисунок ниже).Флуорогенные соединения (нефлуоресцентные или слабо флуоресцентные вещества, которые могут превращаться в флуоресцентные продукты) доступны для использования с широким спектром ферментов, включая AP и HRP. Фермент отщепляет фосфатную группу от флуорогенного субстрата с получением продукта с высокой флуоресценцией. Флуоресценцию можно обнаружить с помощью флюоресцентного имидж-сканера, такого как PharosFX System или ChemiDoc MP System. Хемифлуоресценция обеспечивает стабильный флуоресцентный продукт реакции, поэтому блоты можно сканировать позже.Этот метод также совместим со стандартными процедурами снятия изоляции и повторного зондирования.

Авторадиография
Гамма-излучающий радиоизотоп 125 I можно использовать для мечения лизинов в иммуноглобулинах для радиометрического обнаружения антигенов (см. Рисунок ниже). Прямое иммунологическое обнаружение (с использованием меченых вторичных антител) всего 1 мкг точечного иммуноглобулина возможно с высокой специфической активностью 125 I. Помеченные радиоактивным изотопом пятна могут быть обнаружены с помощью рентгеновской пленки, метода, известного как авторадиография.Из-за опасностей, связанных с радиоактивно меченными конъюгатами, популярность авторадиографии снижается в пользу колориметрических и хемилюминесцентных методов.

Immunogold Labeling
В методах обнаружения иммунного золота для обнаружения антигена используются вторичные антитела, меченные золотом. Поскольку этот метод имеет относительно низкую чувствительность и сигнал непостоянен, методы усиления серебра, аналогичные описанным для окрашивания общего белка коллоидного золота, были разработаны в качестве средства усиления сигнала (см. Рисунок ниже).При использовании серебра на блоте создается фон, и чувствительность увеличивается в 10 раз, что эквивалентно колориметрическому обнаружению AP и в несколько раз более чувствительно, чем авторадиография.

Механизм обнаружения химии. При детектировании биолюминесценции ( A ) сама ферментная реакция излучает свет, тогда как при хемифлуоресценции ( B ) продукт реакции флуоресцирует. В авторадиографии ( C ) вторичное антитело само несет радиоактивную метку, а при маркировке иммунным золотом ( D ) вторичное антитело метится золотом, а сигнал усиливается осаждением серебра.

Байер Э.А. и Вильчек М. (1980). Использование авидин-биотинового комплекса как инструмента в молекулярной биологии. Методы Biochem Anal 26, 1–45.

Blake MS et al. (1984). Быстрый и чувствительный метод обнаружения антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой, на Вестерн-блоттинге. Анальная биохимия 136, 175–179.

Chaiet L и Wolf FJ (1964). Свойства стрептавидина, биотин-связывающего белка, продуцируемого Streptomyces. Arch Biochem Biophys 106, 1–5.

Guesdon J-L et al.(1979). Использование авидин-биотинового взаимодействия в иммуноферментных методах. J. Histochem Cytochem 27, 1131–1139.

Hawkes R et al. (1982). Анализ точечного иммунного связывания для моноклональных и других антител. Анальная биохимия, 119, 142–147.

Hsu SM et al. (1981). Использование комплекса авидин-биотин-пероксидаза (ABC) в методах иммунопероксидазы: сравнение процедур ABC и немеченых антител (PAP). J. Histochem Cytochem 29, 577–580.

Куриен Б.Т. и Скофилд Р.Х. (2003).Белковый блоттинг: обзор. J Immunol Methods 274, 1–15.

Цанг В.К. и др. (1985). Иммуноэлектротрансферный блот с ферментом (EITB). В иммуноферментном иммуноанализе. T.T. Ngo и H.M. Ленхофф, ред. (Нью-Йорк: Plenum Press), стр. 389–414.

Номер Описание Скачать
5881 Улучшенный мультиплексный флуоресцентный вестерн-блоттинг, ред. A Нажмите, чтобы загрузить
2895 Руководство по белковому блоттингу, версия C Нажмите, чтобы загрузить
3179 Флуоресцентные наночастицы для вестерн-блоттинга, Rev A Нажмите, чтобы загрузить
5809 Визуализация хемилюминесцентных вестерн-блотов: сравнение цифровых изображений и рентгеновской пленки, Rev A Нажмите, чтобы загрузить
5723 Увеличьте пропускную способность вестерн-блоттинга с помощью мультиплексной флуоресцентной детекции, Rev B Нажмите, чтобы загрузить

Свиток

Перенос и окрашивание белков вестерн-блоттингом

Визуализация белков в гелях

Визуализация белков на этой стадии полезна для определения того, мигрировали ли белки равномерно и равномерно.Используйте краситель для меди, если вы планируете переносить разделенные белки на мембрану, поскольку окрашивание кумасси необратимо. Используйте краситель Кумасси на гелях после переноса только для проверки эффективности переноса, или если вы не планируете переносить и просто хотите наблюдать результаты разделения SDS-PAGE.

Краситель Кумасси

Как только выключить питание, разделенные полосы белка начнут диффундировать (они легко растворяются в водном растворе).Чтобы предотвратить диффузию белков, обработайте гель 40% дистиллированной водой, 10% уксусной кислотой и 50% раствором метанола, в результате чего почти все белки осаждаются (становятся нерастворимыми).

Для визуализации фиксированных белков поместите гель в ту же смесь воды / уксусной кислоты / метанола, но с добавлением 0,25% по весу кумасси бриллиантового синего R-250. Инкубируйте от 4 ч до ночи при комнатной температуре на шейкере. Перенесите гель (сохраните смесь красителей, ее можно использовать многократно) в смесь 67.5% дистиллированной воды, 7,5% уксусной кислоты и 25% метанола поместите на шейкер и замените свежей промывочной смесью до тех пор, пока не будет удален избыток красителя.

Пятно не связывается с акриламидом и вымывается (остается прозрачный гель). Однако он остается прочно связанным с белками в геле, и они приобретают темно-синий цвет.

Медное пятно

Кратковременно промойте только что подвергнутые электрофорезу гели в дистиллированной воде (максимум 30 секунд), а затем перенесите в раствор 0.3 M CuCl 2 в течение 5–15 мин. Кратковременно промойте гели в деионизированной воде и рассмотрите их на фоне темного поля. Белки появляются в виде прозрачных зон на полупрозрачном синем фоне. Гели можно полностью удалить путем повторной промывки в 0,1–0,25 М Трис / 0,25 М ЭДТА, pH 8,0. Переместите гель в чашку с буфером для переноса, прежде чем продолжить перенос в соответствии с инструкциями производителя устройства для переноса.



Перенос

Подробные инструкции по процессу переноса можно найти на веб-сайтах производителей переносных устройств, и они будут различаться в зависимости от системы.Однако принцип во всех случаях один и тот же. Подобно тому, как белки с электрическим зарядом (обеспечиваемым связанным с ними SDS) могут проходить через гель в электрическом поле, так и белки могут переноситься в электрическом поле из геля на прочную основу, мембрану, которая «промокает» белки от геля. Ранние методы основывались на диффузии; блоттинг в электрическом поле теперь является стандартом.

Перенос может производиться мокрой или полусухой системой. Влажный перенос менее подвержен сбоям из-за высыхания мембраны и особенно рекомендуется для больших белков.Для обоих видов переноса мембрану помещают рядом с гелем. Они зажаты между абсорбирующими материалами, а сэндвич зажат между твердыми опорами для поддержания плотного контакта между гелем и мембраной.

При влажном переносе гель и мембрана зажаты между губкой и бумагой (губка> бумага> гель> мембрана> бумага> губка), и все они плотно прижимаются друг к другу, чтобы гарантировать, что между гелем и мембраной не образуются пузырьки воздуха. Сэндвич погружают в буфер для переноса, к которому прикладывается электрическое поле.Отрицательно заряженные белки перемещаются к положительно заряженному электроду, но связываются мембраной, не позволяя им продолжать движение.

Стандартный буфер для влажного переноса такой же, как 1x Трис-глициновый буфер, используемый в качестве буфера для прогрева геля, но без SDS и с добавлением метанола до конечной концентрации 20%. Для белков крупнее 100 кДа рекомендуется включать SDS в конечной концентрации 0,1%.

При полусухом переносе сэндвич, состоящий из бумаги> геля> мембраны> бумаги, смоченной буфером для переноса, помещается непосредственно между положительным и отрицательным электродами (катодом и анодом соответственно).Что касается влажного переноса, важно, чтобы мембрана находилась ближе всего к положительному электроду, а гель - к отрицательному.

Доля Триса и глицина в буфере для переноса не обязательно такая же, как при влажном переносе; обратитесь к протоколу производителя устройства. Стандартный рецепт: 48 мМ Трис, 39 мМ глицин, 0,04% SDS, 20% метанол.

Доступны два типа мембран: нитроцеллюлоза и ПВДФ (положительно заряженный нейлон). Выбор остается личным, и оба работают очень хорошо.Мембраны из ПВДФ требуют тщательной предварительной обработки: отрежьте мембрану до нужного размера, затем погрузите ее в метанол на 1-2 мин. Инкубируйте мембрану в ледяном буфере для переноса в течение 5 мин. Неспособность уравновесить мембрану в ледяном буфере для переноса вызовет усадку при переносе и искаженную картину переноса.

Перенос больших и малых белков

Баланс SDS и метанола в буфере для переноса, размер белка и процент геля могут влиять на эффективность переноса.Следующие модификации будут способствовать эффективному переносу:

Крупные белки (> 100 кДа)

  • Для крупных белков перенос из геля может быть очень медленным, так же как они медленно перемещаются в геле во время разделения. При блоттинге большого количества белка обязательно анализируйте образцы в геле с низкой концентрацией, 8% или меньше. Они будут очень хрупкими, поэтому обращайтесь с ними осторожно.
  • Крупные белки склонны осаждаться в геле, затрудняя перенос. Добавление SDS до конечной концентрации 0.1% в буфере передачи будет препятствовать этому. Метанол имеет тенденцию удалять SDS из белков, поэтому снижение процентного содержания метанола до 10% или менее также защитит от осаждения.
  • Снижение процентного содержания метанола в буфере для переноса также способствует набуханию геля, что облегчает перенос крупных белков.
  • Метанол необходим только при использовании нитроцеллюлозы. При использовании ПВДФ метанол можно полностью удалить из буфера для переноса, и он необходим только для активации ПВДФ перед сборкой сэндвича из геля / мембраны.
  • Выберите влажный перенос в течение ночи при 4 ° C вместо полусухого переноса.

Малые белки (<100 кДа)

  • SDS препятствует связыванию всех белков с мембранами с мембранами, но малым белкам больше, чем большим. Если интересующий вас белок мал, исключите SDS из буфера для переноса.
  • Поддерживайте концентрацию метанола на уровне 20%.

Следующая ссылка обсуждает гель и буферную систему, которая позволяет переносить белки размером до 500 кДа:

Bolt MW and Mahoney PA (1997).Высокоэффективный блоттинг белков различного размера после электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Anal Biochem , 247, 185–92.

Другие наконечники для переноса:

  • Не прикасайтесь к мембране пальцами; вместо этого используйте пинцет. Масла и белки на пальцах будут препятствовать эффективному переносу и создавать грязные пятна.
  • После размещения геля и мембраны между бумагой пузырьки воздуха между гелем и мембраной можно удалить, раскатав их валиком, пипеткой или пробиркой на 15 мл, или собрав бутерброд в чашке с буфером для переноса, чтобы предотвратить образование пузыри в первую очередь.
  • Убедитесь, что бумага и мембрана обрезаны до того же размера, что и гель. Большие выступы могут препятствовать прохождению тока через мембрану при полусухом переносе.
  • Куриные антитела имеют тенденцию связывать PVDF и другие мембраны на основе нейлона, что приводит к высокому фону. Переход на нитроцеллюлозную мембрану должен помочь уменьшить фоновое окрашивание.


Визуализация белков в мембране с помощью Ponceau Red

Для проверки успешности переноса промойте мембрану в TBST.Развести бульон Ponceau Red 1: 100. Ложа состоит из 2% Ponceau S в 30% трихлоруксусной кислоте и 30% сульфосалициловой кислоте.

Инкубируйте на мешалке в течение 5 минут, затем тщательно промойте водой до тех пор, пока вода не станет прозрачной и полосы белка не станут четко очерченными. Мембрану можно полностью удалить путем многократной промывки в TBST или воде. При использовании мембраны PVDF повторно активируйте мембрану метанолом, затем снова промойте TBST.

ТБС 10x

Для 1 л;
24.23 г Trizma HCl
80,06 г NaCl
Растворить в 800 мл дистиллированной воды
pH до 7,6 с HCl
Долить до 1 л

TBST

Для 1 л;
100 мл TBS 10x
900 мл дистиллированной воды
1 мл Твин 20

Твин 20 очень вязкий и прилипает к кончику ваших мерных пипеток. Убедитесь, что вы добавили нужное количество моющего средства в буфер Трис. Дозировать 10% раствор легче, чем неразбавленный Твин 20.



Блокирование мембраны

Блокирование мембраны предотвращает неспецифическое фоновое связывание первичных и / или вторичных антител с мембраной (которая обладает высокой способностью связываться. белки и, следовательно, антитела).

Традиционно используются два блокирующих раствора: обезжиренное молоко или BSA (фракция V по Кону). Молоко дешевле, но не рекомендуется для изучения фосфопротеинов; молоко содержит казеин, который является фосфопротеином, вызывая высокий фон, потому что фосфоспецифические антитела обнаруживают казеин, присутствующий в молоке.

Некоторые антитела по неизвестным причинам дают более сильный сигнал на мембранах, заблокированных БСА, в отличие от молока. Ознакомьтесь с примечаниями по применению в техническом описании, если есть конкретные инструкции о том, как заблокировать мембрану.

Чтобы приготовить 5% раствор молока или BSA, взвесьте 5 г на 100 мл TBS с буфером Tween 20 (TBST). Хорошо перемешайте и профильтруйте. Отсутствие фильтрации может привести к появлению пятен, где крошечные темные зерна будут загрязнять пятно во время проявления.

Инкубируйте 1 час при 4 ° C при перемешивании. После инкубации промыть в течение 5 с в TBST.



Инкубация с первичным антителом

Буфер для инкубации

Разведите антитело в TBST в предложенном разведении.Если в таблице данных нет рекомендованного разбавления, попробуйте диапазон разбавлений (1: 100–1: 3000) и оптимизируйте разбавление в соответствии с результатами. Слишком большое количество антител приведет к образованию неспецифических полос.

В некоторых лабораториях принято инкубировать в блокирующем буфере, в то время как в других лабораториях инкубируют антитела в TBST без блокирующего агента. Результаты варьируются от антитела к антителу, и вы можете обнаружить, что имеет значение либо использование неблокирующего агента в буфере антител, либо тот же агент, что и блокирующий буфер.

Если высокий фон не является проблемой, некоторые антитела производят гораздо более сильный сигнал, если их разводить в буфере с низкими концентрациями (0,5–0,25%) молока или BSA, или вообще без них.

Время инкубации

Время может варьироваться от нескольких часов до ночи (редко более 18 часов) и зависит от аффинности связывания антитела с белком и количества белка. Мы рекомендуем более разбавленные антитела и более длительное время инкубации, чтобы гарантировать специфическое связывание.

Температура инкубации

Предпочтительно холодная. При инкубации в блокирующем буфере в течение ночи обязательно инкубируйте при 4 ° C, иначе произойдет загрязнение и, следовательно, разрушение белка (особенно фосфогрупп).

Рекомендуется перемешивание антитела для обеспечения адекватного гомогенного покрытия мембраны и предотвращения неравномерного связывания.



Инкубация со вторичным антителом

Промойте мембрану несколько раз в TBST при перемешивании, 5 минут или более на промывку, чтобы удалить остаточное первичное антитело.

Буфер для инкубации и разведение

Разведите антитело в TBST в предлагаемом разведении. Если в таблице данных нет рекомендованного разведения, попробуйте диапазон разведений (1: 1000–1: 2,0000) и оптимизируйте разведение в соответствии с результатами. Слишком большое количество антител приведет к образованию неспецифических полос. Вы можете инкубировать вторичное антитело в блокирующем буфере, но снижение фона может происходить за счет более слабого специфического сигнала, предположительно потому, что блокирующий белок препятствует связыванию антитела с целевым белком.

Время и температура инкубации

1–2 часа при комнатной температуре при перемешивании.

Какой конъюгат?

Мы рекомендуем вторичные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP). Вторичные антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой (ЩФ), менее чувствительны и не рекомендуются.



Методы проявления

Наборы для обнаружения

Для антител, конъюгированных с HRP, в качестве субстратов традиционно используются наборы повышенной хемилюминесценции (ECL).Мы предлагаем субстраты из HRP с различными пределами обнаружения.

Рентгеновские пленки

Автоматические проявители рентгеновских пленок широко используются и просты в использовании. Помните, что переэкспонированная пленка не подходит для анализа, так как невозможно определить относительное количество белка. Передержанные пленки показывают полностью черные полосы без контраста и / или многочисленные неспецифические полосы.

Цифровые изображения

Новое поколение проявителей пленки - это устройства с камерой внутри корпуса, устраняющие необходимость в темной комнате.Камера обнаруживает хемилюминесценцию, исходящую от мембраны, преобразовывая сигнал в цифровое изображение для быстрого анализа с помощью программного обеспечения, поставляемого с детектором.

В настоящее время в продаже имеется ряд машин. В авангарде следующего поколения находятся системы, в которых не используются антитела, конъюгированные с HRP (т. Е. Хемилюминесценция). Например, анализаторы STORM обнаруживают флуоресценцию вторичных антител, конъюгированных с флуорохромом. Система инфракрасного изображения Odyssey обнаруживает инфракрасную флуоресценцию.

Пятнистая линия Энди Уорхола - Музей Энди Уорхола

Об искусстве

Рисунок Уорхола Французский образ - одна из многих иллюстраций обуви, которые он создал с помощью линейного рисунка, известного как техника пятнистых линий. Уорхол впервые экспериментировал с пятнистой линией, когда еще учился в колледже Технологического института Карнеги (ныне Университет Карнеги-Меллона). Он продолжал разрабатывать эту технику в своей коммерческой работе в Нью-Йорке на протяжении 1950-х годов.Размытая линия позволила Уорхолу создать множество иллюстраций на одну и ту же тему. Этот тип производства позволил ему предложить клиентам несколько идей, чтобы повысить шансы на то, что один из его рисунков будет выбран для окончательной рекламы.

Blotted line объединяет рисунок с базовой гравюрой. Уорхол начал с того, что скопировал карандашный рисунок на лист невпитывающей бумаги, например кальке. Затем он прикрепил этот лист бумаги ко второму листу более впитывающей бумаги, склеив их края вместе с одной стороны.Перьевой ручкой Уорхол закрасил небольшой участок нарисованных линий. Затем он перенес чернила на второй лист, сложив его вдоль петли и слегка прижав или «промокнув» две бумаги вместе. Результатом стали пунктирные, ломаные и тонкие линии, характерные для иллюстраций Уорхола. Уорхол часто раскрашивал свои промокшие штриховые рисунки акварельными красками или накладывал сусальное золото.

Точки обзора

Еще одна причина, по которой ему так понравилась [техника промокательной линии] [была], что, имея мастер-рисунок, с помощью которого вы делали свою кляксу, вы могли продолжать промокать, перерисовывать и промокать каждый раз и делать дубликаты изображений.

Ассистент Уорхола по коммерческому искусству Натан Глюк в Patrick S. Smith,

Искусство и фильмы Энди Уорхола , 1986

Совершенно верно, что он мог рисовать что угодно и очень и очень быстро. И поэтому мы его много использовали.

Художественный руководитель Тина С. Фредерикс в Патрике С. Смите,
Уорхол: Беседы о художнике , 1988

Мы с Энди начали беспрецедентную по тем временам кампанию. Каждое воскресенье в New York Times мы публиковали полные страницы, полстраницы.И это было ярким событием для И. Миллера и для Энди. Это расширило его аудиторию до такой степени, что никакая передовая статья журнала не могла бы этого сделать. В море крошечных изображений, которые были на страницах «Таймс», эти смелые фантастические блокбастеры были необычайно эффективны. Рекламы возродили и возродили бренд I. Miller, и из безвкусного, затхлого, затхлого, пыльного, вдовствующего заведения он превратился в стильный торговый центр для дебютанток.

Арт-директор Джеральдин Штутц, аудиогид выставки, созданный Antenna audio
в сотрудничестве с Музеем Энди Уорхола и Художественной галереей Онтарио

Заключение

Попросите учащихся повесить свои рисунки рядом с исходным материалом.На отдельном листе бумаги попросите учащихся указать, что они решили включить и приукрасить, и что они решили исключить из исходного источника в своих окончательных иллюстрациях. Используя шкалу оценок от 1 до 5 (пять - высшая оценка), попросите учащихся оценить привлекательность иллюстраций их продуктов. Студенты должны написать одно или два предложения, объясняющих их оценку. Обсудите с классом, какие рисунки удаются, а какие нет и почему.

добавочный номер

Если есть время, сделайте серию рисунков из одного и того же исходного изображения с изменениями цвета, декора и воздействия.

Радуга раскраски - Пакет действий

Поделиться - это забота!

У нас есть для вас несколько прекрасных бесплатных печатных изданий; раскраски радуги и некоторые другие листы деятельности на основе радуги. Карли Райт создала их, используя ключевые темы своей книги «Радужные кляксы». Еще одно эксклюзивное занятие для KiddyCharts, которое поможет играть и учиться вместе с детьми.

Это спонсируемый пост, содержащий партнерские ссылки Amazon

У нас есть несколько различных занятий для вас, пока вы читаете книгу - всего шесть разных листов для вас в пакете заданий:

  • Два поиска по словам,
  • Три радужные раскраски, чтобы вы могли практиковаться в рисовании всеми цветами радуги, и, наконец,
  • Страница действий, взятая непосредственно из книги, где вы можете выбрать свое любимое Радужное пятно, чтобы рисовать и раскрашивать!

Не забудьте взглянуть на песню The Rainbow Blots, пока изучаете эти листы?

Как всегда - мы поделимся с вами мероприятиями, прежде чем предложим загрузку, чтобы вы могли точно знать, что вы получаете заранее.

Радуга раскраски: Представляем радужные кляксы

Наша первая страница - это небольшое введение в персонажей «Радужных пятен»; Почему бы вашим детям не раскрасить их все, как в книге, или не проявить немного творчества с цветами радуги?

Развлекайтесь с радужными кляксами

На этой радужной раскраске показаны радужные кляксы, которые немного развлекаются с некоторыми вещами, окрашенными в цвет радуги. Можете ли вы, дети, заметить их и немного рассказать вам о них? Может быть, они тоже могут раскрасить их правильными цветами и сопоставить их с персонажем Радужных пятен?

Раскраска над радугой

Это последняя из имеющихся у нас для вас радужных раскрасок. На ней изображена радуга, чтобы ваши дети могли попрактиковаться в понимании цветов радуги по-настоящему.

Радуга Кляксы Wordsearch 1

Первый из наших поисков слов на радужную тематику, который поможет закрепить понимание цветов радуги у детей.

Радуга Кляксы Wordsearch 2

Это второй лист, который у нас есть для книги, чтобы улучшить понимание и понимание цветов радуги. Мы надеемся, что они оба понравятся вам, дети.

Создайте своего собственного персонажа Rainbow Blots

Нашим последним заданием из книги является задание «Сделай свой собственный». Детям предлагается сделать свое собственное радужное пятно и поделиться им в листе задания.Почему бы не побудить их дать волю своему воображению и цвету?

Мы действительно надеемся, что вам понравятся эти занятия, которые мы собрали для вас в книге «Радужные кляксы» - если вы хотите узнать об этом немного больше. Вот автор, Карли, читает это вслух своей дочери:

<< Чтобы загрузить этот пакет занятий - нажмите на круглое изображение ниже >>

Спасибо, что пришли к нам, и обязательно посмотрите книгу Карли «Радужные кляксы», которая помогает научить детей цветам радуги в правильном порядке, новым, веселым и увлекательным способом.

В книге представлена ​​новая песня о цветах радуги, которая поможет детям легко и с радостью разучить радугу.

Если вы ищете другие интересные занятия для детей, не забудьте подписаться на нашу рассылку новостей….

У нас также есть некоторые другие цветные задания на сайте, на которые стоит обратить внимание.

Как всегда, существует множество других замечательных идей для создания радуги и развлечения с цветами, так почему бы не взглянуть на некоторые из них?

Нам нравятся все эти идеи и эта задача - и мы надеемся, что вы тоже.До встречи на сайте скоро,

 Елена
 

Приколите на потом!

линий и цветов - Блог о живописи, рисовании, набросках, иллюстрации, комиксах и другом изобразительном искусстве


Miss May Miles , Hubert von Herkomer

Я не видел оригинала этой картины, но мой опыт сравнения художественных изображений в сети с их оригиналами - в случае картин, которые я, , видел лично, - создает у меня впечатление, что какой-то благонамеренный, но заблуждающийся человек попутно увеличил насыщенность цвета, вероятно, думая, что это сделает изображение более привлекательным.Я взял на себя смелость скорректировать цвет изображения до того, что, как мне кажется, было бы более естественным намерением художника.

Этот портрет баварского / британского художника конца XIX века Хуберта фон Херкомера кажется мне наглядным примером направления взгляда на одну область картины.

Более темные оттенки по краям картины создают эффект виньетки; в котором яркие / ценные формы ее лица, рук и кистей выделяются из областей стены позади нее с низкой насыщенностью / низкой цветностью, создавая поразительный эффект.Это подчеркивается темной формой ее платья, у которой почти нулевой цветовой тон и нулевое значение.

Лицо женщины близко к горизонтальному центру композиции; остальной части ее фигуры нет. Она смотрит прямо на зрителя взглядом, который можно рассматривать либо как привлекательный, либо как конфронтационный, возможно и то, и другое. Ее руки направлены внутрь в направлении шеи и лица, как и подлокотник стула и большая складка на покрывале.

Темный цвет ее платья и темные волосы, подчеркнутые еще более затемненным проходом в стене позади нее, образуют своего рода темный ореол вокруг ее лица.Цветы над ее правой рукой перекликаются с более мелкими аналогами в ее волосах, еще больше усиливая эффект обрамления.

Узоры обоев и складки обложки кружатся вокруг нее, как будто попали в гравитационное поле.

Среди всего этого точечные блики в ее зрачках сияют, как далекие маяки. Цвет ее глаз кажется зеленоватым, что еще больше подчеркивает румяный оттенок ее кожи.

Как может зритель, стоящий перед этой картиной, не сразу и неотразимо привлечь внимание к лицу женщины, а точнее, к ее глазам?

Вестерн-блоттинг (иммуноблот): гель-электрофорез на белки

Вестерн-блоттинг (также называемый иммуноблоттингом) - это метод, используемый для анализа отдельных белков в смеси белков (например, иммуноблоттинг).г. клеточный лизат). При вестерн-блоттинге (иммуноблоттинге) смесь белков применяется для гель-электрофореза в матрице-носителе (SDS-PAGE, нативный PAGE, изоэлектрическое фокусирование, 2D-гель-электрофорез и т. Д.) Для сортировки белков по размеру , заряду , или другие различия в отдельных белковых полосах. Затем разделенные белковые полосы переносятся на мембрану-носитель (например, нитроцеллюлозу, нейлон или ПВДФ). Этот процесс называется блоттингом . Белки прикрепляются к мембране по той же схеме, что и были разделены из-за взаимодействия зарядов.Затем белки на этом иммуноблоте становятся доступными для связывания антител с целью обнаружения.

Антитела используются для обнаружения белков-мишеней при вестерн-блоттинге (иммуноблоттинг). Антитела конъюгированы с флуоресцентными или радиоактивными метками или ферментами , которые дают последующую реакцию с нанесенным реагентом, приводящую к окрашиванию или излучению света, что позволяет обнаруживать.

Термин вестерн-блоттинг основан на игре слов.Саузерн-блоттинг, который представляет собой метод обнаружения конкретных последовательностей ДНК, назван в честь Эда Саузерна, который первым описал эту процедуру. Вестерн-блот (иммуноблот), а также нозерн-блот (для обнаружения РНК) играют на значении этого названия.

Различные типы гель-электрофореза белков

Можно выбрать один из различных типов гель-электрофореза белков в зависимости от критериев, по которым белки должны быть разделены. Некоторые часто используемые электрофоретические методы: SDS-PAGE, native-PAGE и изоэлектрическое фокусирование.

СТРАНИЦА SDS:

Это денатурирующий метод, поскольку он обрабатывает белки анионным детергентом SDS (додцилсульфатом натрия). Этот процесс разрушает вторичную и третичную структуру. Кроме того, SDS связывает белки и, таким образом, покрывает их химические заряды, что приводит к образованию одинаково отрицательно заряженных белков. Следовательно, следующее разделение происходит исключительно по размеру полипептидных цепей в полиакриламидном геле.

Рекомендуемый буфер SDS-PAGE и комплекты

Продукт

Заявка

Кат.№

Кол-во

Цена

Приложение SDS

Кат.№ ABIN925558

Кол-во 100 мл

Цена 355,63 €

Приложение SDS

Кат.№ ABIN925557

Кол-во 1 л

Цена 375,13 €

Приложение SDS

Кат.№ ABIN925562

Кол-во 1 л

Цена 339,13 €

Приложение DB, WB

Кат.№ ABIN1574309

Кол-во 1 упаковка

Цена 327,78 €

Приложение SDS

Кат.№ ABIN1113031

Кол-во 5 мл

Цена 378,63 €

Заявка

Кат.№ ABIN5706407

Кол-во 1 л

Цена 492,13 €

Приложение WB

Кат.№ ABIN6720448

Кол-во 1 комплект

Цена 375,63 €

Приложение WB

Кат.№ ABIN412579

Кол-во 50 мл

Цена 329,19 €

Приложение DB, WB

Кат.№ ABIN769944

Кол-во 1 упаковка

Цена 228,63 €

Приложение WB

Кат.№ ABIN2669832

Кол-во 50 мл

Цена 368,08 €

СТРАНИЦА:

Нативные, развернутые и неденатурированные белки можно разделить с помощью этого метода.Этот метод позволяет отделить белки, недоступные для других методов. Одним из примеров может быть разделение модифицированных и немодифицированных белков одного и того же типа (например, фосфорилированное или нефосфорилированное состояние белка). Нативный PAGE можно также использовать для подтверждения биологически релевантных конформаций, таких как ди-, три- или тетрамерные формы белков (в отличие от SDS-PAGE, который разделяет индивидуальные и денатурированные пептидные цепи). Этот метод также может обнаруживать различные комплексы разных белков.

Разделение с использованием нативного PAGE зависит от ряда параметров, таких как заряд , размер и трехмерная структура белка. Подходящий буфер необходим для поддержания трехмерной укладки белка. Применимость буфера зависит от изоэлектрической точки и зарядов белка.

Изоэлектрическая фокусировка:

Этот метод основан на том факте, что белок имеет определенный заряд при определенных значениях pH. В зависимости от pH кислотные и основные функциональные группы способствуют увеличению или уменьшению общего заряда белка.Изоэлектрическая точка определяется как точка, в которой общий заряд молекулы равен нулю, потому что в молекуле имеется равное количество отрицательных и положительных зарядов.

Специальные градиентные гели необходимы для изоэлектрической фокусировки, так как pH изменяется от кислого до основного по градиенту внутри геля. Благодаря электрическому заряду, связанному с гелем, белок перемещается в точку в геле, где заряд геля равен заряду белка, а общий заряд равен нулю, т.е.е. изоэлектрическая точка. Следовательно, этот метод используется для разделения белков по их зарядам, а также для определения изоэлектрической точки целевого белка. Разделение происходит из-за заряда белка или количества основных и кислотных групп, содержащихся в белке.

Вышеупомянутые методы гель-электрофореза белков также можно комбинировать для разделения белков. Выбор методов зависит от конкретных требований эксперимента.

Блоттинг

После разделения смеси белков полипептидные полосы переносятся на мембранный носитель.Для этого к гелю прикрепляется мембрана, и этот так называемый сэндвич переносится в камеру для электрофореза. Возможно, что часть SDS вымывается, и белок снова частично перестраивается, то есть восстанавливает свою 2D- и 3D-структуру. Однако приложенный электрический заряд заставляет белки перемещаться из геля вертикально в направлении, в котором они двигались в геле, на мембрану. Таким образом, полосы белка связываются с мембраной. «Промокшие» полосы теперь доступны для дальнейшей обработки (например,г. для обнаружения специфических белков со специфическими антителами).

Иммунодетекция

Идентификация специфических антител возможна после разделения и блоттинга белков. Специфические антитела (моно- или поликлональные) связываются со «своей» полосой белков. Неспецифически связывающиеся антитела удаляют промыванием буферами, содержащими детергент. Кроме того, неспецифические связывающие карманы могут быть заблокированы перед добавлением специфических антител.

Обычно сначала применяются первичные антитела, которые затем распознаются вторичным антителом.Вторичное антитело конъюгировано с красителем, радиоактивностью или ферментом для обнаружения. Для этой цели также используются конъюгированные с биотином антитела.

Рекомендуемые блокирующие буферы и буферы для лизиса для вестерн-блоттинга

Продукт

Заявка

Кат.№

Кол-во

Цена

Приложение CLy, IP, RIA, WB

Кат.№ ABIN925563

Кол-во 50 мл

Цена 358,63 €

Приложение WB

Кат.№ ABIN5706395

Кол-во 50 мл

Цена 315,13 €

Приложение IP, WB

Кат.№ ABIN5706373

Кол-во 15 мл

Цена 477,13 €

Заявка BR, Lbl, WB

Кат.№ ABIN925618

Кол-во 500 мл

Цена 274,32 €

Иногда может быть выгодным использование поликлональных первичных антител, поскольку такие антитела распознают несколько эпитопов, в отличие от моноклональных антител, которые имеют ограниченную аффинность связывания.После иммунодетекции можно удалить антитело с мембраны для дальнейшего анализа с другими антителами (например, для обнаружения других специфических антител из исследуемой смеси белков).

Затем проводят анализ вестерн-блоттинга с использованием различных систем визуализации (например, люминесценции, цветовой реакции, авторадиографии).

Идентификация интересующего белка с помощью вестерн-блоттинга зависит, среди прочего, от его молекулярной массы.С этой целью электрофоретически разделенные белки в образце сравнивают со стандартом молекулярной массы известного состава.

Рекомендуемые маркеры и контроли для вестерн-блоттинга

Продукт

Заявка

Кат.№

Кол-во

Цена

Приложение SDS, WB

Кат.№ ABIN2868254

Кол-во 500 мкл

Цена 345,46 €

Приложение SDS, WB

Кат.№ ABIN2868250

Кол-во 500 мкл

Цена 359,43 €

Приложение SDS, WB

Кат.№ ABIN2868252

Кол-во 500 мкл

Цена 352,44 €

Приложение SDS, WB

Кат.№ ABIN2868518

Кол-во 500 мкл

Цена 345,46 €

Приложение SDS, WB

Кат.№ ABIN2868520

Кол-во 500 мкл

Цена 345,46 €

Приложение FACS, IsoC, IHC, ELISA, WB

Кат.№ ABIN376844

Кол-во 1 мг

Цена 255,95 €

Приложение SDS, WB

Кат.№ ABIN925595

Кол-во 200 мкл

Цена 324,13 €

Приложение ELISA, IHC, WB

Кат.№ ABIN5633221

Кол-во 5 мг

Цена 491,76 €

Приложение ELISA, IHC, WB

Кат.№ ABIN5633227

Кол-во 10 мг

Цена 393,89 €

Приложение IsoC, ELISA, WB

Кат.№ ABIN964336

Кол-во 2 мг

Цена 525,13 €

Приложение IsoC, ELISA, WB

Кат.№ ABIN964381

Кол-во 1 мг

Цена 544,26 €

Приложение IsoC, ELISA, WB

Кат.№ ABIN5633245

Кол-во 10 мг

Цена 448,26 €

Почему вестерн-блоттинг (иммуноблоттинг)?

Метод вестерн-блоттинга (иммуноблоттинг) имеет различные преимущества по сравнению с другими иммуносорбентными анализами (ISA), такими как, например, ELISA.

Вестерн-блоттинг (иммуноблоттинг) расширяет идею ELISA, позволяя разделить белковые смеси по размеру, заряду и / или конформации. Описанный метод стриппинга позволяет обнаруживать несколько мишеней, в отличие от ELISA, где может быть обнаружен только один белок. Поскольку гель-электофорез белков разделяет белки на полосы, можно определить размер целевого белка / полипептида. Также возможно (полу) количественно определить интересующий белок, запустив внутренний количественный стандарт параллельно с образцами в геле.Аналогичным образом можно сравнить содержание белка в образцах («образец A содержит больше белка, чем образец B»).

Недостатком вестерн-блоттинга (иммуноблоттинга) является то, что он требует много времени (по сравнению с ИФА) и требует большого опыта экспериментатора. Кроме того, это требует оптимизации экспериментальных условий (т. Е. Выделения белка, буферов, типа разделения, концентрации геля и т. Д.).

Существует множество различных типов и методов вестерн-блоттинга (иммуноблоттинга).Следовательно, он охватывает самые разные темы и приложения.

Кляксы для детей и малышей

Искусство рисования кляксами настолько просто, насколько это возможно, и самое замечательное то, что вся семья может принять участие.

Если вы можете промокнуть краску и сложить лист бумаги, у вас есть все, что нужно, чтобы сделать это произведение искусства, и возможности безграничны с точки зрения выбора краски и цвета бумаги.

Искусство, которое можно повесить в любом месте дома!

Если вы украсите свой дом произведениями искусства своего ребенка, он почувствует себя еще более его частью.Секрет успеха в том, чтобы проявить смелость и действовать! Дети смелы. Они повсюду вешают свои работы, и мы тоже должны!

Все, что вам нужно для этого занятия, - это прочная художественная бумага, краска и пластиковые ложки! Просто включите свое воображение и получайте удовольствие!

Что вам понадобится:

  • Строительная бумага
  • Краска
  • Ложки пластиковые

Шаг 1. Возьмите припасы

  • Достаньте художественную бумагу, краску и пластиковые ложки.
  • Подготовьте покрасочную станцию. Залейте краску отдельного цвета в каждый лоток для краски. Положите старую газету и приготовьте влажную ткань для легкой уборки!
  • Сложите бумагу пополам.

Шаг 2. Добавьте краску

  • Попросите ребенка развернуть бумагу и разложить ее.
  • Помогите им взять совок краски и нанести каплю на правую сторону листа.
  • Возьмите ложку краски другого цвета и нанесите ее рядом с краской первого цвета.Повторите то же самое с 3-м цветом.
  • Ничего страшного, если цвета накладываются друг на друга, но постарайтесь держать это подальше от края бумаги, чтобы он не брызгал сбоку!

Шаг 3. Нажмите и разгладьте

  • После того, как вы закончите рисовать на бумаге, сложите бумагу и помогите ребенку прижать ее руками.
  • Попросите их двигать руками вперед и назад, разглаживая бумагу.

admin

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *