повреждений ДНК, вызванных факторами окружающей среды и нормальными метаболическими процессами внутри клетки, происходит со скоростью от 1000 до 1000000 молекулярных повреждений на клетку в день.Хотя это составляет только 0,000165% примерно 6 миллиардов оснований человеческого генома (3 миллиарда пар оснований), если их не исправить, могут возникнуть мутации в критических генах (таких как гены-супрессоры опухолей), что может препятствовать способности клетки выполнять свою функцию и значительно увеличивать вероятность образования опухоли и болезненных состояний, таких как рак.

Подавляющее большинство повреждений ДНК затрагивает первичную структуру двойной спирали; то есть сами основания химически модифицированы.Эти модификации могут, в свою очередь, нарушить регулярную спиральную структуру молекул за счет введения ненативных химических связей или объемных аддуктов, которые не вписываются в стандартную двойную спираль. В отличие от белков и РНК, ДНК обычно не имеет третичной структуры, и поэтому на этом уровне не происходит повреждений или нарушений. ДНК, однако, суперспиральна и намотана вокруг «упаковывающих» белков, называемых гистонами (у эукариот), и обе надстройки уязвимы для эффектов повреждения ДНК ^.

Существует несколько типов повреждений ДНК, которые могут возникать либо из-за нормальных клеточных процессов, либо из-за воздействия на клетки повреждающих ДНК агентов окружающей среды.Основания ДНК могут быть повреждены: (1) окислительными процессами, (2) алкилированием оснований, (3) потерей оснований, вызванной гидролизом оснований, (4) образованием объемного аддукта, (5) сшиванием ДНК и (6) ДНК. разрывы нитей, в том числе одно- и двухцепочечные разрывы. Обзор этих типов повреждений описан ниже.

Активные формы кислорода (АФК) могут вызывать значительный клеточный стресс и повреждение, включая окислительное повреждение ДНК. Гидроксильные радикалы ( ^• OH) являются одними из наиболее реактивных и электрофильных из АФК и могут образовываться ультрафиолетовым и ионизирующим излучением или другими радикалами, возникающими в результате ферментативных реакций. ^• OH может вызывать образование 8-оксо-7,8-дигидрогуанина (8-oxoG) из остатков гуанина среди других продуктов окисления (рис. 12.4). Гуанин является наиболее легко окисляемым из оснований нуклеиновых кислот, поскольку он имеет самый низкий потенциал ионизации среди оснований ДНК. 8-oxo-dG является одним из наиболее распространенных повреждений ДНК и считается биомаркером окислительного стресса. Было подсчитано, что до 100000 повреждений 8-oxo-dG может происходить ежедневно в ДНК на клетку. Восстановительный потенциал 8-oxo-dG еще ниже (0.74 В по сравнению с NHE), чем у гуанозина (1,29 В по сравнению с NHE). Следовательно, он может подвергаться дальнейшему окислению с образованием множества вторичных продуктов окисления.

Рисунок 12.4 Активные формы кислорода и повреждение ДНК. В условиях окислительного стресса 8-oxoG является результатом активных форм кислорода (АФК), модифицирующих гуанин.

Рисунок из: Poetsch, A.R. (2020) Comp & Struct Biotech J. 18: 207-219.

Как упоминалось ранее, повышенные уровни 8-оксо-dG в ткани могут служить биомаркером окислительного стресса.Более того, повышенные уровни 8-оксо-dG часто связаны с канцерогенезом и другими болезненными состояниями (рис. 12.5). Во время репликации ДНК, содержащей 8-oxo-dG, аденин чаще всего включается поперек поражения. После репликации 8-oxo-dG вырезается в процессе репарации, и на его место включается тимин. Таким образом, мутации 8-oxo-dG обычно приводят к трансверсии G в T.

Рис. 12.5 Окислительный стресс и здоровье человека. Повреждение ДНК, вызванное окислительным стрессом, было связано со многими болезненными состояниями человека.

Рисунок предоставлен: Галано, А., Тан, Д.-X., И Рейтер, Р.Дж. (2018) Молекулы 23 (3) 530

Алкилирующие агенты широко распространены в окружающей среде и также производятся эндогенно как побочные продукты клеточного метаболизма. Они вносят повреждения в основания ДНК или РНК, которые могут быть цитотоксическими, мутагенными или нейтральными по отношению к клетке.На рис. 12.6 показаны основные реактивные участки оснований ДНК, которые подвержены алкилированию. Цитотоксические поражения блокируют репликацию, прерывают транскрипцию или сигнализируют об активации апоптоза, тогда как мутагенные повреждения кодируют неправильно и вызывают мутации во вновь синтезированной ДНК. Наиболее распространенным типом алкилирования является метилатон с основными продуктами, включая N7-метилгуанин (7meG), N3- метиладенин (3meA) и O6-метилгуанин (O6meG). Метилирование в меньших количествах также происходит на других основаниях ДНК и включает образование N1-метиладенина (1meA), N3-метилцитозина (3meC), O4-метилтимина (O4meT) и метилфосфотриэфиров (MPT).

Рисунок 12.6. Основные сайты алкилирования ДНК. На диаграмме показаны пары оснований ДНК Ватсона-Крика с основными участками повреждения, модифицированными небольшими алкилирующими агентами (метилом и этилом). (A) Сайты модификации оснований алкилирующими агентами SN1 и SN2. Оранжевым цветом обозначены основные участки повреждения, а зеленым — небольшие участки повреждения. (B) Образование фосфотриэфира, на которое указывает присутствие метильных групп наряду с изомерами Rp и Sp.

Рисунок из: Ahmad, A., Нет, С. и О’Коннер, Т. (2015) Глава 4 Прямое обратное восстановление в клетках млекопитающих

Алкилирующие агенты могут вызывать повреждение всех экзоциклических атомов азота и кислорода в ДНК и РНК, а также кольцевых атомов азота (рис. 12.6A). Однако процентное содержание каждого модифицированного основного сайта зависит от алкилирующего агента, положения в ДНК или РНК и от того, являются ли нуклеиновые кислоты одноцепочечными или двухцепочечными. Интересно, что O-алкилирование более мутагенное и вредное, чем N-алкилирование, которое может быть более цитотоксичным, но не таким мутагенным.

Как мы рассмотрим в главе 13, метилирование ДНК также служит важным механизмом, регулирующим экспрессию генов.

AP-сайт ( апуриновый / апиримидиновый сайт ) , также известный как абазовый сайт , представляет собой место в ДНК (также в РНК, но гораздо менее вероятно), в котором нет ни пурина, ни пиримидина. основание, либо спонтанно, либо из-за повреждения ДНК (Рисунок 12.7). Было подсчитано, что при физиологических условиях в клетке ежедневно может образовываться 10000 апуриновых сайтов и 500 апиримидиновых.

Рисунок 12.7 Абазовые участки. Апуриновые и апиримидимные (AP) сайты возникают из-за нестабильного гидролиза.

Рисунок из Mayhew

AP сайтов могут быть образованы спонтанной депуринизацией, но также могут возникать как промежуточные звенья в эксцизионной репарации оснований, процессе репарации, описанном в разделе 12.5. Если не исправить, AP-сайты могут привести к мутации во время полуконсервативной репликации. Они могут вызывать остановку репликационной вилки и часто обходятся путем синтеза транслезии , что более подробно обсуждается в разделе 12.8. В E. coli аденин предпочтительно встраивается напротив AP-сайтов, что известно как «правило А». Ситуация более сложная у высших эукариот, где предпочтение отдается различным нуклеотидам в зависимости от организма и условий окружающей среды.

Некоторые химические вещества являются биологически активными и образуют ковалентные связи с биологическими молекулами, такими как ДНК и белки, создавая большие громоздкие аддукты или придатки, ответвляющиеся от основной молекулы. Мы будем использовать мутаген / канцероген, бензо [ a ] пирен, в качестве примера для этого процесса.

Бензо [ a ] пирен представляет собой полициклический ароматический углеводород, который образуется при неполном сгорании органических веществ при температурах от 300 ° C (572 ° F) до 600 ° C (1112 ° F).Вездесущее соединение можно найти в каменноугольной смоле, табачном дыме и многих пищевых продуктах, особенно в мясе, приготовленном на гриле. Бензо [ a ] пирен на самом деле является проканцерогеном , который должен быть биологически активирован метаболизмом, прежде чем он образует реактивный метаболит (рис. 12.8). Обычно, когда организм подвергается воздействию чужеродных молекул, он запускает метаболический процесс. это делает молекулу более гидрофильной и ее легче удалить как отходы. К сожалению, в случае бензо [ a ] пирена образующийся метаболит представляет собой высокореактивный эпоксид, который образует объемный аддукт преимущественно с остатками гуанина в ДНК.Если его не исправить, во время репликации ДНК аденин обычно помещается напротив повреждения в дочерней молекуле. Последующая репарация аддукта приведет к замене поврежденного основания гуанина тимином, вызывая трансверсионную мутацию G -> T.

Рис. 12.8 Активация бензо [ a ] пирена и образование аддукта. (A) Бензо [ a ] пирен биологически активируется до дигидродиального эпоксида во время нормальных метаболических процессов.(B) Сигаретный дым является источником бензо [ a ] пирена. (C) Активированный (+) бензо [ a ] пирен-7,8-дигидродиол-9,10-эпоксид может образовывать аддукт ДНК с остатками гуанина. (D) Аддукт бензо [ a ] пирена образует объемное повреждение, которое искажает основу ДНК.

Фигуры от: (A) Элеска, (B) Элизабет Агилера (C), биохимик DI93, и (D) Zephryis

Сшивание ДНК происходит, когда различные экзогенные или эндогенные агенты реагируют с двумя нуклеотидами ДНК, образуя между ними ковалентную связь.Эта перекрестная сшивка может происходить внутри одной и той же цепи (внутрицепочечная) или между противоположными цепями двухцепочечной ДНК (межцепочечная) (рисунок 12.9). Эти аддукты мешают клеточному метаболизму, например репликации и транскрипции ДНК, вызывая гибель клеток.

Рис. 12.9. Схематическая диаграмма внутрицепочечных и межцепочечных сшивок ДНК.

УФ-свет может вызвать образование молекулярных поперечных связей между двумя остатками пиримидина, обычно двумя остатками тимина, которые расположены последовательно внутри цепи ДНК (Рисунок 12.10). Двумя распространенными УФ-продуктами являются димеры циклобутан-пиримидина (ЦПД) и 6–4 фотопродукта. Эти премутагенные поражения изменяют структуру и, возможно, пары оснований. До 50–100 таких реакций в секунду может происходить в клетке кожи при воздействии солнечного света, но обычно корректируются в течение нескольких секунд реактивацией фотолиазы или эксцизионной репарацией нуклеотидов. Неисправленные повреждения могут ингибировать полимеразы, вызывать неправильное считывание во время транскрипции или репликации или приводить к остановке репликации. Димеры пиримидина являются основной причиной меланом у людей.

Рис. 12.10 Двухцепочечные разрывы ДНК и образование димера тимина (a) Ионизирующее излучение, такое как рентгеновские лучи и γ-лучи, содержат достаточно энергии, чтобы вызвать одно- и двухцепочечные разрывы в основной цепи ДНК. (b) Энергия неионизирующего излучения, такого как УФ-свет, непосредственно поглощается ДНК, в результате чего остатки тимина, находящиеся рядом в одной цепи ДНК, сшиваются. (c) 6,4-димер, который образует одинарную ковалентную связь, и (d) димер тимин-тимин циклобутана, который образует две ковалентные связи между остатками тимина.

Цифры из: (a и b) Parker, et al (2019) Microbiology from Openstax и (c и d) Smokefoot

Ионизирующее излучение, создаваемое радиоактивным распадом или космическими лучами, вызывает разрывы цепей ДНК (рис. 12.10a). Низкий уровень ионизирующего излучения может вызвать непоправимое повреждение ДНК (что приводит к ошибкам репликации и транскрипции, необходимым для неоплазии, или может вызвать вирусные взаимодействия), что приводит к преждевременному старению и раку.Химические агенты, которые образуют поперечные связи внутри ДНК, особенно межцепочечные поперечные связи, также могут приводить к разрывам цепи ДНК, если поврежденная ДНК подвергается репликации ДНК. Сшитая ДНК может вызывать остановку ферментов топоизомеразы в переходном состоянии, когда остов ДНК находится в расщепленном состоянии. Вместо снятия суперспирализации и повторного закрытия скелета остановившаяся топоизомераза остается ковалентно связанной с ДНК в процессе, называемом прерванный катализ . Это приводит к образованию одноцепочечных разрывов в случае ферментов Top1 или двухцепочечных разрывов в случае ферментов Top2.Двухцепочечные разрывы ДНК из-за остановки топоизомеразы также могут происходить во время транскрипции ДНК (рис. 12.11). Фактически, прерванный катализ и образование разрывов цепей ДНК во время транскрипционных событий могут служить датчиком повреждения внутри клетки и способствовать запуску сигнальных путей ответа на повреждение ДНК, которые запускают процессы репарации ДНК.

Рисунок 12.11 Модель двухцепочечных разрывов ДНК, опосредованных топоизомеразой IIB ( TOP2B) во время транскрипции. ( верхняя диаграмма ) в неиндуцированном состоянии транскрипции Pol II приостанавливается между +25 и +100 от сайта начала транскрипции. Пауза приписывается различным элементам, включая стабилизирующие паузу факторы транскрипции, нуклеосому +1, а также структуру и скручивание ДНК. Положительная суперспирализация перед Pol II может потребовать функции TOP2B. ( Средняя диаграмма ) Активация транскрипции, индуцированная различными стимулами, активирует TOP2B для разрешения скручивания ДНК в промоторе и теле гена.( Bottom Diagram ) В этом процессе двухцепочечные разрывы могут быть образованы из-за абортивного катализа TOP2B, который часто встречается в некоторых генах. Это может быть ответственной за передачу сигналов в ответ на повреждение ДНК, которая наблюдалась в ряде индуцируемых стимулами генов у людей.

Рисунок из: Morimoto, S., et al (2019) Genes 10: 868

Генетическое повреждение, вызванное экзогенными или эндогенными механизмами, представляет постоянную угрозу для клетки.Чтобы сохранить целостность генома, эукариотические клетки разработали механизмы восстановления, специфичные для различных типов повреждений ДНК. Однако, независимо от типа повреждения, сложный механизм наблюдения, который выявляет контрольных точек повреждения ДНК , обнаруживает и сигнализирует о его присутствии механизму восстановления ДНК. Контрольные точки повреждения ДНК были функционально консервативны на протяжении всей эволюции эукариот, при этом большинство соответствующих участников контрольной точки ответа были высоко консервативными от дрожжей до людей.Контрольные точки призваны замедлить развитие клеточного цикла и дать клеткам время для восстановления поврежденной ДНК до репликации ДНК (рис. 12.12). Как только поврежденная ДНК восстанавливается, контрольно-пропускной механизм запускает сигналы, которые возобновят прогрессирование клеточного цикла. Внутри клетки множественные пути способствуют репарации ДНК, но независимо от конкретного задействованного пути репарации традиционно выделяют три фазы активации контрольных точек: (1) обнаружение повреждения, (2) активация сигнального каскада и (3) включение ниже по течению. эффекторы.Фаза сенсора распознает повреждение и активирует фазу передачи сигнала, чтобы заблокировать прогрессирование клеточного цикла и выбрать соответствующий путь восстановления.

В многоклеточных организмах реакция на повреждение ДНК может привести к двум основным физиологическим последствиям: (1) клетки могут подвергаться остановке клеточного цикла, восстанавливать повреждение и повторно входить в клеточный цикл, или (2) клетки могут стать мишенью для гибели клеток. (апоптоз) и удален из популяции. Процесс клеточного цикла высоко консервативен и точно контролируется для управления дупликацией генома и разделением на дочерние клетки.Клеточный цикл состоит из четырех отдельных и упорядоченных фаз, называемых G0 / G1 (разрыв 1), S (синтез ДНК), G2 (разрыв 2) и M (митоз). На каждой стадии клеточного цикла существует несколько контрольных точек, чтобы гарантировать точную репликацию ДНК в S-фазе и точное разделение хромосом на дочерние клетки. Фазы G1 и G2 являются критическими контрольными точками регулирования, посредством чего точка ограничения между фазами G1 и S определяет, входят ли клетки в фазу S или выходят из клеточного цикла, чтобы остановиться на фазе G0.Прогрессирование клеточного цикла требует активности циклин-зависимых киназ (CDK), группы серин / треониновых киназ. CDK активируются, когда они образуют комплексы с регуляторными белками циклина, которые специфически экспрессируются на разных стадиях клеточного цикла. Циклины связываются и стабилизируют CDK в их активной конформации. Образование циклин / CDK контролирует развитие клеточного цикла посредством фосфорилирования целевых генов, таких как белок-супрессор опухоли ретинобластомы (Rb).

Во время повреждения ДНК клеточный цикл останавливается или блокируется действием циклин-зависимых ингибиторов киназ.Как показано на рисунке 12.12, это сложный каскад передачи сигналов, который имеет ряд нисходящих эффектов. Основная функция остановки клеточного цикла заключается в том, что ингибирование CDK дает время для восстановления ДНК до перехода клеточного цикла в S-фазу или митоз. Как показано на рисунке 12.12, две основные контрольные точки клеточного цикла реагируют на повреждение ДНК; они происходят до и после синтеза ДНК в фазах G1 и G2, соответственно, и влияют на активность специфических комплексов CDK. Киназы контрольной точки фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) -подобные протеинкиназы (PI3KKs), атаксия, телеангиэктазия и Rad3-связанный (ATR) белок, мутировавший в результате телеангиэктазии (ATM), а также трансдукторные киназы контрольных точек CHK1 и CHK2 (кодируемые геном CHK1) (кодируемые геном CHEK2) являются ключевыми регуляторами передачи сигналов повреждения ДНК.Передача сигналов повреждения ДНК выявляется с помощью ATM / ATR, которые затем фосфорилируют и активируют CHK2 / CHK1 соответственно. Активированный CHK2 участвует в активации p53, что приводит к p53-зависимой остановке G1 на ранней стадии, чтобы дать время для репарации ДНК. Активация р53 индуцирует экспрессию гена циклин-зависимого ингибитора киназы (CKI) p21 ^CIP1 , что приводит к ингибированию комплексов циклин E / CDK2 и последующей активации аппарата репарации ДНК.

Если репарация ДНК не может быть завершена успешно или клетки не могут программировать, чтобы реагировать на стрессы, вызванные остановкой жизнеспособного клеточного цикла, клетки сталкиваются с судьбой апоптоза, индуцированного p53.Активированный CHK1 опосредует временную остановку S-фазы посредством фосфорилирования для инактивации CDC25A, вызывая убиквитинирование и протеолиз. Более того, активированный CHK1 фосфорилирует и инактивирует CDC25C, что приводит к остановке клеточного цикла в фазе G2. Активный CHK1 также напрямую стимулирует фосфорилирование WEE1, что приводит к усилению ингибирующего фосфорилирования Tyr15 CDK2 и CDK1 и последующему блокированию клеточного цикла в фазе G2. Активность WEE1 также может стимулироваться низкими уровнями активности CDK в фазе клеточного цикла G2.SAC, также известный как митотическая контрольная точка, функционирует как монитор правильного прикрепления хромосом к митотическому веретену в метафазе, что регулируется протеинкиназой TTK (TTK, также известной как монополярное веретено 1 (MPS1)). Активация SAC временно вызывает остановку клеточного цикла посредством ингибирования активации APC / C. Чтобы установить и поддерживать контрольную точку митоза, TTK рекрутирует многие белки контрольной точки на кинетохоры во время митоза посредством фосфорилирования своих субстратов для обеспечения адекватной сегрегации хромосом и целостности генома.Таким образом, геномная нестабильность от дефектов сегрегации хромосом защищена SAC. После прохождения SAC лигазный комплекс APC / C E3 стимулирует и маркирует циклин B и секурин для опосредованной убиквитином деградации, что приводит к инициации митоза. Одним словом, контрольные точки предлагают надежный механизм для обеспечения целостности генома от родительской клетки к дочерней клетке. Каскад передачи сигнала активации контрольной точки в конечном итоге сводится к ингибированию CDK, что указывает на функцию CDK как ключевого фактора развития клеточного цикла.

Рис. 12.12. Судьба клетки после повреждения ДНК. Контрольные точки клеточного цикла индуцируются повреждением ДНК, показаны красным. Ингибиторы циклин-зависимых киназ (CIP / KIP), показанные фиолетовым цветом, блокируют развитие клеточного цикла на всех фазах клеточного цикла (G1, S, G2 или M) после повреждения ДНК путем ингибирования комплексов циклин-зависимых киназ (показаны зеленым ). Сигнальные каскады, активируемые в ответ на повреждение ДНК, также вызывают пути репарации ДНК, или, если повреждение ДНК серьезное, активируется запрограммированная гибель клеток (апоптоз).

Изображение из: Ding, L., et al. (2020) Междунар. J. Mol. Sci. 21 (6): 1960

В дополнение к блокированию развития клеточного цикла, датчики повреждений ДНК также активируют механизмы репарации ДНК, специфичные для данного типа повреждений. Например, разрывы одноцепочечной ДНК восстанавливаются главным образом с помощью эксцизионной репарации оснований, объемные аддукты ДНК и поперечные сшивки восстанавливаются с помощью нуклеотидной эксцизионной репарации, а более мелкие нуклеотидные мутации, такие как алкилирование, восстанавливаются с помощью репарации ошибочного спаривания.Клетки также имеют два основных механизма восстановления двухцепочечных разрывов (DSB). Они включают негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологичную рекомбинацию (HR). Если повреждение слишком велико, чтобы его можно было исправить, будут выявлены пути апоптоза. В следующих разделах будут даны подробности об основных путях репарации ДНК.

репарация ошибочного спаривания ДНК (MMR) — это высококонсервативная система репарации ДНК (таблица 12.2), которая в значительной степени способствует поддержанию стабильности генома за счет коррекции несовпадающих пар оснований и небольших модификаций оснований ДНК, таких как алкилирование.Основным источником несовпадения пар оснований является ошибка репликации, хотя она также может возникать в результате других биологических процессов. Таким образом, аппарат MMR должен иметь механизм для определения, какая цепь ДНК является цепочкой-матрицей, а какая цепь была синтезирована заново. В E. coli метилирование ДНК является распространенной пострепликативной модификацией. Таким образом, во вновь синтезированной ДНК неметилированная цепь распознается как новая цепь, а метилированная цепь используется в качестве матрицы для восстановления несовпадений.В E.coli MMR увеличивает точность репликации ДНК в 20–400 раз. Мутации и эпигенетическое молчание в генах MMR участвуют в почти 90% случаев наследственного неполипозного рака толстой кишки у человека, что указывает на важность этой системы репарации в поддержании стабильности генома. Пострепликативный MMR осуществляется с помощью механизма MMR с длинным участком, в котором задействованы несколько белков, и относительно длинный тракт олигонуклеотида вырезается во время реакции репарации. Напротив, определенные виды несовпадающих пар оснований репарируются посредством MMR с очень коротким участком, в котором короткий олигонуклеотидный тракт вырезается для удаления поражения.

Таблица 12.2 Ферменты устранения несоответствия в бактериях, дрожжах и людях

В настоящее время выяснены два типа механизмов MMR: один, как ожидается, будет использоваться эукариотами и большинством бактерий, а другой специфичен для E. coli и близкородственных бактерий. Как показано на рисунках 12.13 (a) и 12.13 (b), MMR у эукариот и большинства бактерий направляет репарацию на содержащую ошибки цепь несовпадающего дуплекса, распознавая разрывы цепи.С другой стороны, как показано на рисунке 12.13 (c), E. coli MMR считывает отсутствие метилирования как сигнал дискриминации цепи. В обеих системах MMR дискриминация цепей осуществляется путем отщепления эндонуклеазами. Гомологи MutL от эукариот и большинства бактерий надрезают прерывистую цепь, чтобы ввести точку входа или окончания для реакции вырезания. В E. coli MutH разрывает неметилированную цепь дуплекса, чтобы создать точку входа для вырезания. После удаления поврежденной или несовпадающей цепи геликазы (такие как UvrD) и экзонуклеазы (такие как ExoI) вырезают короткую область нуклеотидов из поврежденной цепи.ДНК pol III или ДНК pol δ заполняют пробел, а ДНК-лигаза восстанавливает основу.

Рисунок 12.13 Схематическое изображение моделей пути MMR. (a) MMR эукариот. Несоответствие ДНК возникает из-за неправильного включения основания во время репликации ДНК. MutSα распознает несоответствия оснований. MutLα надрезает 3′- или 5′-сторону несовпадающего основания на прерывистой нити. Полученный сегмент ДНК вырезается экзонуклеазой EXO1 в сотрудничестве с одноцепочечным ДНК-связывающим белком RPA.Нить ДНК повторно синтезируется ДНК-полимеразой δ и ДНК-лигазой. (б) MMR в бактериях, не содержащих mutH, без . Несоответствующие базы распознаются MutS. После разреза прерывистой цепи с помощью MutL содержащая ошибку цепь ДНК удаляется совместными функциями ДНК-геликаз, таких как UvrD, экзонуклеаз RecJ и ExoI и одноцепочечного ДНК-связывающего белка SSB. ДНК-полимераза III и ДНК-лигаза заполняют пробел для завершения восстановления. (c) E. coli MMR. MutS распознает несовпадающие основания, а MutL взаимодействует с комплексом и стабилизирует его.Затем активируется эндонуклеаза MutH, чтобы разрезать неметилированный сайт GATC, чтобы создать точку входа для реакции вырезания. ДНК-геликаза, одноцепочечный ДНК-связывающий белок, и несколько экзонуклеаз участвуют в реакции вырезания.

Рисунок из: Fukui, K. (2010) J. Nuc. Кислоты 260512

Большинство окисленных оснований удаляются из ДНК ферментами, действующими в рамках пути базового эксцизионного восстановления (BER).Одноцепочечные разрывы ДНК также могут быть восстановлены с помощью этого процесса. Удаление окисленных оснований в ДНК происходит довольно быстро. Например, 8-оксо-dG был увеличен в 10 раз в печени мышей, подвергшихся ионизирующему излучению, но избыток 8-оксо-dG был удален с периодом полураспада 11 минут. 8-oxoG вырезается 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазой (OGG1), оставляя апуриновый сайт (AP-сайт) (рис. 12.14). Затем АР-сайты обрабатываются далее в однонитевые разрывы посредством разрезания основной цепи АР-эндонуклеазой 1 (APE1).При эксцизионной репарации длинного патч-основания основание и некоторые дополнительные нуклеотиды заменяются в зависимости от активности полимеразы дельта (Polδ) и эпсилон (Polε) вместе с ядерным антигеном пролиферирующих клеток (PCNA). Старая цепь удаляется Flap-эндонуклеазой 1 (FEN1) до того, как лигаза I (LigI) снова лигирует остов. Эксцизионная репарация короткого патч-основания состоит из полимеразы бета (Polβ), заменяющей единственное недостающее основание, лигазы III (LigIII), связывающей основную цепь ДНК вместе, и перекрестно-комплементарного белка 1 (XRCC1) репарации рентгеновских лучей, помогающего процессу и служащего в качестве подмости для дополнительных факторов.

Рисунок 12.14 Иссечение основания. Эксцизионная репарация оснований (BER) 8-оксо-7,8-дигидрогуанина (8-oxoG). Окислительное повреждение ДНК восстанавливается с помощью нескольких промежуточных продуктов репарации путем эксцизионной репарации оснований (BER). За счет удаления окисленного основания образуется реактивный апуриновый сайт (AP-сайт). Разрез нити создает одиночный разрыв нити, и поврежденный участок затем восстанавливается с помощью короткого или длинного пластыря BER

Рисунок из: Poetsch, A.Р. (2020) Comp & Struct Biotech J. 18: 207-219.

Объемные аддукты ДНК и поперечные сшивки ДНК, например, вызванные УФ-светом, восстанавливаются с использованием путей восстановления нуклеотидов (NER). В высших эукариотических клетках NER с исключительной точностью вырезает 24-32 нуклеотидные фрагменты ДНК, содержащие поврежденное поражение. Репаративный синтез с использованием неповрежденной цепи в качестве матрицы с последующим лигированием одноцепочечного разрыва, возникшего в результате повреждения, является заключительной стадией репарации ДНК.Процесс включает скоординированное действие примерно 30 белков, которые последовательно образуют комплексы с различным составом на ДНК. NER состоит из двух путей, различных с точки зрения первоначального распознавания ущерба. Глобальная эксцизионная репарация нуклеотидов генома (GG-NER) обнаруживает и устраняет объемные повреждения во всем геноме, включая нетранскрибируемые области и молчащий хроматин, а эксцизионная репарация нуклеотидов, связанная с транскрипцией (TC-NER) , работает, повреждение транскрибируемой цепи ДНК ограничивает активность транскрипции.TC-NER активируется за счет остановки РНК-полимеразы II на поврежденных участках транскрибируемой цепи, в то время как GG-NER контролируется белком XPC, специализированным белковым фактором, который выявляет повреждение. Схематический процесс GG-NER представлен на рисунке 12.15.

Рис. 12.15. Схема глобальной эксцизионной репарации генома.

Рисунок из: Петрусева И.О. и др. (2014) 6 (1): 23-34.

Генетические мутации в генах пути NER могут приводить к чувствительным к ультрафиолету и высококанцерогенным патологиям, таким как пигментная ксеродермия (XP), синдром Кокейна (CS) и трихотиодистрофия (TTD), а также к некоторым нейродегенеративным проявлениям.

Xeroderma pigmentosum предоставила названия некоторых генов, участвующих в NER. Мутация генов XP и потеря правильной функции NER вызывают симптомы, связанные с заболеванием. Люди с XP имеют нарушенную способность восстанавливать объемные аддукты и сшивки ДНК, такие как димеры тимина, которые возникают под воздействием УФ-света. Люди, страдающие XP, обладают крайней светочувствительностью, атрофией кожи, гиперпигментацией и высоким уровнем рака кожи, вызванного солнечным светом (рис. 12.16). Риск внутренних опухолей у пациентов с XP также в 1000 раз выше.Более того, заболевание часто сопровождается неврологическими расстройствами. В настоящее время не существует эффективного лечения этого расстройства.

Рисунок 12.16 Восьмилетняя девочка из Гватемалы с пигментной ксеродермой. Фронтальное изображение лица, показывающее большие гиперкератотические поражения с некоторым уплотнением, подозрительным на актинический кератоз и ранний плоскоклеточный рак. Также многочисленные гиперпигментированные лентиго и ксероз по всей передней части лица. Заметное рубцевание роговицы и инъекция очевидны.

Рисунок от: Джеймс Халперн, Брайан Хоппинг и Джошуа М. Бростофф

Обнаружение объемных повреждений ДНК во время NER является особенно сложной задачей для клетки, которая может быть решена только с помощью высокочувствительного распознавания, требующего нескольких белковых компонентов. В отличие от BER, где поврежденное основание одновременно распознается и устраняется одной специализированной гликозилазой, специализированные группы белков ответственны за распознавание поражения и удаление поражения в NER.В эукариотическом NER универсальные сенсорные белки выполняют начальное распознавание всего диапазона объемных повреждений. В случае TC-NER это происходит, когда транскрибирующая РНК-полимераза II останавливается из-за повреждения; в GG-NER это комплексы фактора XPC и гетеродимера DDB1-DDB2 (фактор XPE), усиливающие восстановление УФ-повреждений (рис. 12.15). В общем, распознавание повреждений NER представляет собой многоступенчатый процесс с участием нескольких белков, которые образуют близкие к повреждению комплексы различного состава. Процесс завершается формированием комплекса перед надрезом, готового к удалению поврежденного фрагмента ДНК с помощью специализированных эндонуклеаз NER.

В эукариотической клетке после образования стабильного комплекса XPC / ДНК во время начального распознавания повреждения, NER фактически выполняется репирасомой , которая представляет собой комплекс переменного состава и архитектуры, состоящий из большого количества субъединиц. Отдельные субъединицы комплекса не обладают достаточным сродством и селективностью к субстрату (ДНК, содержащая объемные повреждения). Ситуация меняется, когда в месте повреждения образуются специфические белковые комплексы.Белки NER этих комплексов соединяются процессингом ДНК. В общей сложности 18 полипептидов должны быть точно расположены в пределах двух или трех витков ДНК, когда формируется стабильная структура, готовая к удалению повреждений, и начинается вырезание. Структура белков, связанных с NER, обеспечивает возможность контакта с субстратом ДНК и динамических специфических белок-белковых взаимодействий. Изменения во взаимодействиях, выполняемых одним и тем же белком, являются одним из механизмов, регулирующих процесс репарации и тонкой настройки комплексов, обеспечивая высокоточную эксцизионную репарацию нуклеотидов.

Клетки развили два основных пути восстановления двухцепочечных разрывов в ДНК: путь негомологичного соединения концов (NHEJ) , который обеспечивает прямое повторное запечатывание концов ДНК; и путь гомологичной рекомбинации (HR) , который основан на наличии гомологичных последовательностей ДНК для репарации DSB (Рисунок 2.16)

NHEJ — это самый простой и наиболее широко используемый механизм репарации DSB, встречающихся в ДНК. Ремонт с помощью NHEJ включает прямое повторное запечатывание двух разорванных концов независимо от гомологии последовательностей. Хотя NHEJ активен на протяжении всего клеточного цикла, он относительно более важен во время фазы G1. Белки, необходимые для NHEJ, включают, но не ограничиваются ими, высококонсервативный гетеродимерный комплекс Ku70 / Ku80, каталитическую субъединицу ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PKcs) и ДНК-лигазу IV (LIG4) в комплексе с XRCC4.Непосредственно связывая концы ДНК, Ku70 / Ku80 обеспечивает защиту от экзонуклеаз и, как таковой, действует как ингибитор HR. Очень короткие гомологии последовательностей могут способствовать выравниванию концов ДНК до NHEJ-зависимой репарации, однако они не являются строго обязательными. NHEJ защищает генетическую целостность путем воссоединения разорванных цепей ДНК, которые в противном случае могут быть потеряны во время репликации ДНК и регенерации клеток. Однако во время процесса NHEJ могут происходить вставки или делеции в соединенных областях (рис.2.16).

Рис. 2.16. Основные пути репарации двухцепочечного разрыва ДНК. Пути негомологичного соединения концов (NHEJ) и гомологичной рекомбинации (HR) действуют конкурентно, восстанавливая двухцепочечные разрывы ДНК (DSB). Показаны ключевые игроки NHEJ и HR. Комплекс MRE11 / RAD50 / XRS2 (MRX) рекрутируется очень рано на концах ДНК и, по-видимому, играет важную роль как для NHEJ, так и для HR. Гетеродимер Ku70 / Ku80 необходим для NHEJ и посредством ингибирования резекции концов ДНК (5′-3 ′ экзо) действует как репрессор HR.Точность NHEJ-зависимой репарации DSB низка и, в большинстве случаев, связана с делециями и / или вставками нуклеотидов в репарационных соединениях. Обычной ранней стадией HR-зависимых механизмов является образование оцДНК, которая затем покрывается репликационным белком А (RPA). Механизм однонитевого отжига (SSA) требует наличия прямых повторов (показаны оранжевым цветом) по обе стороны от разрыва. SSA не предполагает какого-либо процесса инвазии цепи и, следовательно, не зависит от белка RAD51. Инвазия цепи и образование D-петли, однако, являются общими этапами механизмов зависимого от синтеза отжига цепи (SDSA) и двойного соединения Холлидея (HJ).В последнем случае двойные перекрестки Холлидея разрешаются с кроссинговером или без него.

Рисунок из: Diccotignies, A. (2013) Frontiers in Genetics 4 (48): 48

В отличие от NHEJ, гомологичная рекомбинация (HR) требует, чтобы гомологичная последовательность ДНК служила матрицей для репарации, зависимой от синтеза ДНК, и включает обширный процессинг конца ДНК. Как и ожидалось, HR является чрезвычайно точным, поскольку он приводит к точной репарации поврежденного локуса с использованием последовательностей ДНК, гомологичных разорванным концам.HR преимущественно использует сестринскую хроматиду в качестве матрицы для репарации DSB, а не гомологичную хромосому. Соответственно, HR в значительной степени ингибируется, пока клетки находятся в фазе G1 клеточного цикла, когда сестринская хроматида еще не реплицируется (Рис. 2.17A). Механизмы репарации HR играют большую роль в репарации DSB, которая происходит после S-фазы репликации ДНК (S-фаза, G2 и M).

Ремонт с помощью HR не определяется уникальным механизмом, но работает с помощью различных механически различных процессов восстановления DSB, включая зависимый от синтеза отжиг цепей (SDSA), разрешение двойных соединений Холлидея и однонитевой отжиг (SSA).Обычным шагом для HR-зависимых механизмов репарации DSB является начальное образование одноцепочечной ДНК (оцДНК) для спаривания с гомологичными матричными последовательностями ДНК. Для этого 5′-цепь ДНК в DSB обрабатывается множеством нуклеаз и дополнительных белков для создания 3′-участка оцДНК, который может использоваться в качестве матрицы для рекомбинации (рис. 2.16).

На рис. 2.17B представлен более подробный обзор процесса управления персоналом. В строго регулируемом процессе управления персоналом можно выделить три основных этапа.Во-первых, концы 3′-одноцепочечной ДНК (оцДНК) образуются путем нуклеолитической деградации 5′-цепей. Этот первый этап катализируется эндонуклеазами, включая комплекс MRN (состоящий из Mre11, Rad50 и Nbs1). На втором этапе концы оцДНК покрываются филаментами репликационного протеина А (RPA). На третьем этапе RPA заменяется на Rad51 в BRCA1- и BRCA2-зависимом процессе, чтобы в конечном итоге провести рекомбиназную реакцию с использованием гомологичной ДНК-матрицы.

Важно отметить, что HR не только используется для восстановления повреждений ДНК, вызванных повреждающими ДНК агентами, но также важен для правильной сегрегации хромосом во время мейоза.Важность ЧСС в этих физиологических процессах иллюстрируется его строгим требованием во время развития. Мыши, лишенные ключевых генов HR, таких как Brca1, Brca2, или Rad51, , демонстрируют обширные генетические изменения, которые приводят к ранней эмбриональной летальности. В то время как гомозиготная инактивация генов HR обычно является эмбриональной летальностью, гетерозиготная инактивация, например, BRCA1, и BRCA2, не влияет на жизнеспособность клеток, а скорее предрасполагает людей к раку, включая рак груди и яичников.Опухоли, которые развиваются у людей с гетерозиготными мутациями BRCA1 / 2 , неизменно теряют свой второй аллель BRCA1 / 2 , что указывает на то, что при некоторых формах рака отсутствие BRCA1 / 2 совместимо с клеточной пролиферацией. Как именно такие опухоли справляются с дефектом сердечного ритма, в настоящее время до конца не изучено.

Рисунок 2.17 Восстановление двухцепочечных разрывов ДНК (DSB). (A) Пути репарации DSB ДНК в контексте регуляции клеточного цикла.Негомологичное соединение концов (NHEJ) может осуществляться на протяжении всего клеточного цикла и обозначено красной линией. Гомологичная рекомбинация (HR) может использоваться только в фазах S / G2 клеточного цикла и обозначена зеленым цветом. (B) Показаны ключевые этапы пути восстановления HR. После распознавания DSB резекция 5′-3′-конца инициируется комплексом MRN (Mre11, Rad50, Nbs1) и CtIP. Впоследствии проводится дальнейшая резекция с помощью белков Exo1, DNA2 и Sgs1 для обеспечения «поддерживаемой» резекции.Затем резецированные концы ДНК связываются репликационным белком А (RPA). Фактическая стадия рекомбинации в HR-репарации, называемая обменом цепи, выполняется рекомбиназой Rad51. Rad51 заменяет RPA, чтобы в конечном итоге собрать спиральные нуклеопротеиновые филаменты, называемые « пресинаптическими филаментами». ’Этому процессу способствуют другие компоненты HR, включая BRCA1 и BRCA2. Заключительный этап разрешения соединения выполняется геликазами, включая синдром Блума, геликазу RecQ, подобную геликазе (BLM).

Рисунок из: Krajewska, M., Fehrmann, R.S.N., de Vries, E.G.E., and van Vugt, A.A.T.M. (2015) Фронт. Genet. 6:96

Если ДНК не восстанавливается до репликации ДНК, клетка должна использовать другую стратегию для репликации ДНК, даже при наличии повреждения ДНК. Это важно, чтобы избежать разрывов двухцепочечной ДНК, которые могут произойти, когда реплисома останавливается на вилке репликации.В этих условиях другой стратегией, которую клетки используют для ответа на повреждение ДНК, является обход повреждений, обнаруженных во время репликации ДНК, и продолжение репликативного процесса. Обход повреждений ДНК может происходить с помощью механизмов рекомбинации или с помощью нового механизма, называемого синтезом трансфузии . Синтез трансфузии использует альтернативную ДНК-полимеразу, которая может заменить ДНК-полимеразу, которая застряла на вилке репликации из-за повреждения ДНК.Специализированные ДНК-полимеразы, которые активны в областях с повреждениями ДНК, имеют активные центры, которые могут приспосабливаться к колебаниям топографии ДНК, что позволяет им обходить повреждения и продолжать репликативный процесс.

Эволюция ДНК-полимераз, которые могут переносить присутствие искаженных повреждений ДНК и продолжать репликативный процесс, можно наблюдать на всех уровнях жизни, от прокариотических одноклеточных организмов до эукариотических многоклеточных организмов, включая человека.Фактически, у позвоночных произошло большое распространение ДНК-полимераз, которые играют роль в механизмах обхода повреждений ДНК и подчеркивают важность этих процессов в устойчивости к повреждениям и выживаемости клеток (Таблица 12.3).

Таблица 12.3 ДНК-полимеразы, участвующие в способном к ошибкам шунтировании

Активность ДНК-полимераз, подверженных ошибкам, жестко регулируется, чтобы избежать безудержного внедрения мутаций в последовательность ДНК. Один из основных механизмов, который используется в реплисоме, которая останавливается на вилке репликации из-за повреждения ДНК, включает моноубиквитинирование PCNA.Вспомните из главы 9, что PCNA — это скользящий зажим, который позволяет ДНК-полимеразе достаточно прочно связываться с ДНК во время репликации, чтобы обеспечить эффективный синтез ДНК. Моноубиквитинирование PCNA позволяет задействовать ДНК-полимеразы с трансфузией и обходить поврежденные очаги во время синтеза ДНК.

Во время синтеза трансфузии полимераза должна вставить dNTP напротив поражения. Вероятно, что ни одно из оснований dNTP не сможет образовывать устойчивые взаимодействия водородных связей с поврежденным поражением.Таким образом, нуклеотид, вызывающий наименьшее искажение или отталкивание, обычно добавляется напротив поражения. Это может вызвать переходные или трансверсионные мутации в месте поражения. Альтернативно, полимеразы с трансфузией могут быть склонны к проскальзыванию и вызывать мутацию вставки или делеции в непосредственной близости от повреждения ДНК. Эти смещения могут приводить к мутациям сдвига рамки считывания, если они происходят в кодирующих областях генов. Таким образом, в течение всей жизни синтез транслезии в многоклеточных организмах может приводить к накоплению мутаций в соматических клетках и вызывать образование опухолей и заболевание раком.

Эволюция путем естественного отбора также возможна из-за случайных мутаций, происходящих внутри половых клеток. Иногда мутации зародышевой линии могут привести к полезной мутации, которая увеличивает выживаемость человека в популяции. Если окажется, что этот ген увеличивает выживаемость популяции, он будет со временем отобран в популяции и вызовет эволюцию этого вида. Примером полезной мутации является случай, когда люди демонстрируют устойчивость к ВИЧ-инфекции.С тех пор, как в 1981 году был зарегистрирован первый случай заражения вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), почти 40 миллионов человек умерли от ВИЧ-инфекции, вируса, вызывающего синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). Вирус нацелен на вспомогательные Т-клетки, которые играют ключевую роль в преодолении врожденного и адаптивного иммунного ответа, заражая и убивая клетки, обычно участвующие в реакции организма на инфекцию. Лекарства от ВИЧ-инфекции нет, но было разработано множество лекарств, замедляющих или блокирующих прогрессирование вируса.Хотя люди во всем мире могут быть инфицированы, самая высокая распространенность среди людей в возрасте 15–49 лет наблюдается в странах Африки к югу от Сахары, где инфицирован почти один человек из 20, что составляет более 70% инфекций во всем мире (рис. 2.18). К сожалению, это также часть мира, где больше всего отсутствуют стратегии профилактики и лекарства для лечения инфекции.

Рис. 2.18. ВИЧ широко распространен в странах Африки к югу от Сахары, но в некоторых других частях мира его распространенность довольно низка.

В последние годы научный интерес вызвал открытие нескольких людей из Северной Европы, устойчивых к ВИЧ-инфекции. В 1998 году американский генетик Стивен Дж. О’Брайен из Национального института здоровья (NIH) и его коллеги опубликовали результаты своего генетического анализа более 4000 человек. Это указывает на то, что многие люди евразийского происхождения (до 14% в некоторых этнических группах) имеют делеционную мутацию, называемую CCR5-delta 32, в гене, кодирующем CCR5.CCR5 — это корецептор, обнаруженный на поверхности Т-клеток, который необходим для проникновения многих штаммов вируса в клетку-хозяина. Мутация приводит к образованию рецептора, с которым ВИЧ не может эффективно связываться, и, таким образом, блокирует проникновение вируса. Люди, гомозиготные по этой мутации, значительно снижают восприимчивость к ВИЧ-инфекции, а гетерозиготные люди также имеют некоторую защиту от инфекции.

Непонятно, почему именно люди североевропейского происхождения несут эту мутацию, но ее распространенность, по-видимому, самая высокая в Северной Европе и неуклонно снижается в популяциях по мере продвижения на юг.Исследования показывают, что мутация присутствовала еще до появления ВИЧ и, возможно, была выбрана для европейского населения в результате контакта с чумой или оспой. Эта мутация может защитить людей от чумы (вызываемой бактерией Yersinia pestis ) и оспы (вызываемой вирусом натуральной оспы), поскольку этот рецептор также может быть вовлечен в эти заболевания. Возраст этой мутации является предметом споров, но оценки показывают, что она появилась между 1875 и 225 годами назад и, возможно, была распространена из Северной Европы через вторжения викингов.

Это захватывающее открытие привело к новым направлениям в исследованиях ВИЧ, включая поиск лекарств, блокирующих связывание CCR5 с ВИЧ у людей, у которых отсутствует мутация. Хотя тестирование ДНК для определения того, какие люди являются носителями мутации CCR5-delta 32, возможно, существуют задокументированные случаи, когда люди, гомозиготные по этой мутации, заражаются ВИЧ. По этой причине официальные органы здравоохранения не рекомендуют тестирование ДНК на мутацию, чтобы не поощрять рискованное поведение у носителей мутации.Тем не менее, ингибирование связывания ВИЧ с CCR5 продолжает оставаться действенной стратегией для разработки лекарственных препаратов для лечения ВИЧ-инфицированных.

Суставной фиброзный хрящ — Почему гиалиновый хрящ не восстанавливается?

Abstract

После повреждения суставной хрящ имеет ограниченную способность к восстановлению. Клинически образуется восстанавливающая ткань, но часто механически это нижний фиброзный хрящ. Использование увеличенного монослоя по сравнению с наивными клетками может объяснить одно из самых больших расхождений в регенерации хряща на основе мезенхимальных стромальных / стволовых клеток (МСК).А именно, исследования с использованием МСК, увеличенных в монослой, на что указывают многочисленные исследования in vitro и , сообщают об основном ограничении индукции коллагена типа X и гипертрофии, фенотипа, связанного с образованием эндохондральной кости. Однако исследования стимуляции и переноса костного мозга сообщают о механически более низком фиброзном хряще коллагена I / II в качестве основного результата. Таким образом, в этом обзоре будут рассмотрены виды коллагена, образующиеся при различных терапевтических подходах. Будут описаны новые разработки в области дизайна каркаса и доставки терапевтических молекул.Будут обсуждены возможные будущие направления клинического перевода. Разрабатываются новые механизмы доставки, и они дают новую надежду на адресную терапевтическую доставку.

Ключевые слова

Хондроциты

Хрящ

Мезенхимальные стволовые клетки

Дифференциация

Хондрогенез

Паракрин

Секретом

Цитокины

Секретом

Цитокины