Ваше предложение

• Синонимы к слову «колос»

Типы буферов для переноса вестерн-блоттинга

Просмотр каталога

• Быстрый заказ
• Библиотека литературы
• Свяжитесь с нами

Буферы для переноса должны обеспечивать как эффективное элюирование белков из гелевой матрицы, так и связывание белка с мембраной. Хотя для разных типов гелей и приложений для блоттинга требуются разные буферы для переноса, выбор буфера также зависит от используемой мембраны и физических характеристик интересующего белка. В этом разделе представлен обзор различных буферов для переноса, таких как Tris/Glycine, CAPS, карбонатные буферы Dunn и прерывистые буферные системы. В нем также приведены общие рекомендации по выбору буферов и мембран в зависимости от типа геля и области применения.

Связанные темы : Методы блоттинга белков, оборудование для блоттинга белков, мембраны и промокательные бумаги, а также условия переноса.

Содержание страницы

Для поддержания проводимости и переноса pH буферы содержат проводящий сильный буферный агент (например, трис, CAPS или карбонат). Кроме того, в буфер для переноса можно включить спирт (например, метанол или этанол), чтобы способствовать связыванию белков с мембранами, а SDS можно добавить для облегчения элюирования белков из гелей.

Независимо от выбранного буфера для переноса, при приготовлении и использовании буферов для переноса:

• Не используйте одну и ту же партию буфера для переноса более одного раза, так как буфер может потерять свою способность поддерживать стабильный рН во время переноса
• Не разбавлять буфер переноса; это также уменьшит емкость буфера
• Не регулируйте pH буферов для переноса, если это не указано, так как это увеличивает проводимость буфера, что проявляется в более высоком начальном выходном токе и сниженном сопротивлении

Вернуться к началу

Наиболее распространены переносы из гелей SDS-PAGE с использованием буферных систем, первоначально описанных Towbin (1979). Стандартный буфер Towbin содержит 25 мМ Трис, 192 мМ глицина, pH 8,3, 20% метанола и иногда 0,025–0,1% SDS.

Буфер, аналогичный по составу стандартному буферу Towbin, представляет собой буфер Bjerrum Schafer-Nielsen (48 мМ Трис, 39 мМ глицин, pH 9,2, 20% метанол), который был разработан для использования в полусухих применениях.

Вернуться к началу

Буфер для переноса на основе CAPS (10 мМ CAPS, pH 11, 10% метанол) может быть предпочтительным для переноса белков с высокой молекулярной массой (например, >150 кДа) и в случаях, когда глицин Компонент буфера Towbin может мешать последующим приложениям для секвенирования белков.

В начало

Уникальной особенностью полусухого блоттинга является возможность использования двух разных буферов во время переноса, известная как прерывистая буферная система. При полусухом переносе буферные резервуары представляют собой фильтровальную бумагу по обе стороны от геля, которые являются независимыми (прерывистыми). В прерывистой системе метанол включается в буфер на мембранной (анодной) стороне сборки блота, а SDS используется на гелевой (катодной) стороне, используя преимущества положительных эффектов каждого компонента буфера. Дискретная буферная система с использованием буфера Tris-CAPS может значительно повысить эффективность переноса белка с помощью полусухого блоттинга. В этой системе используется 60 мМ трис, 40 мМ CAPS, pH 9..6, плюс 15% метанола в фильтровальной бумаге на стороне анода и 0,1% SDS на стороне катода. Концентрированные, предварительно смешанные анодные и катодные буферы доступны для покупки. Дополнительную информацию об использовании прерывистой буферной системы при полусухом переносе см. в бюллетене Bio-Rad 2134.

В начало

Na ₂ CO ₃ , pH 9,9, 20% метанол) может обеспечить более эффективный перенос и улучшить способность антител распознавать белки и связываться с ними. Карбонатный буфер также рекомендуется для переноса основных белков (Garfin and Bers 19). 89).

Вернуться к началу

Подвижность белков во время электрофоретического переноса из нативных гелей будет зависеть от размера и pI интересующего белка по отношению к pH используемого буфера.

• Если pI белка больше, чем pH буфера для переноса, белок несет положительный заряд и будет мигрировать к отрицательному электроду
• Если pI белка близок к pH буфера для переноса, миграция белка из геля снижается. Используйте более щелочной или кислый буфер для увеличения подвижности белка

Белки в нативных гелях, а также кислые и нейтральные белки требуют буферов, не содержащих метанол. Гели для изоэлектрофокусировки, нативный ПААГ и те, которые содержат основные белки или кислотно-мочевину, могут быть перенесены в 0,7% уксусную кислоту. При использовании уксусной кислоты для переноса белки будут заряжены положительно, поэтому мембрану следует располагать на катодной стороне геля.

Общие рекомендации по выбору буфера для переноса и мембраны по типу геля.

Общие рекомендации по выбору буфера для переноса и мембраны в зависимости от области применения.

A Примечание относительно SDS и алкоголя
SDS и алкоголь играют противоположные роли при передаче. ДСН в геле и в комплексах ДСН-белок способствует элюции белка из геля, но ингибирует связывание белка с мембранами. В случаях, когда определенные белки трудно элюировать из геля, для улучшения переноса в буфер для переноса можно добавить SDS. SDS в буфере для переноса снижает эффективность связывания белка с нитроцеллюлозной мембраной; Мембрану PVDF можно заменить нитроцеллюлозой, если в буфере для переноса используется SDS. Добавление SDS увеличивает относительный ток, мощность и нагрев во время переноса и может повлиять на антигенность некоторых белков.

Спирт (метанол или этанол), с другой стороны, удаляет SDS из комплексов SDS-белок и улучшает связывание белка с нитроцеллюлозной мембраной, но оказывает некоторое негативное воздействие на сам гель. Алкоголь может вызвать уменьшение размера пор, осаждение некоторых белков, а некоторые основные белки могут стать положительно заряженными или нейтральными. Все эти факторы будут влиять на эффективность блоттинга.

Примечание : В буфере для переноса следует использовать только высококачественный метанол аналитической чистоты; нечистый метанол может увеличить проводимость буфера переноса и привести к ухудшению переноса.

Вернуться к началу

Гарфин Д.Е. и Берс Г. (1989). Основные аспекты белкового блоттинга. В Белковом блоттинге: методология, исследования и диагностические приложения, B.A. Бальдо и др., Ред. (Базель, Швейцария: Karger), стр. 5–41.

Таубин Х. и др. (1979). Электрофоретический перенос белков из полиакриламидных гелей на листы нитроцеллюлозы: методика и некоторые приложения. Proc Natl Acad Sci USA 76, 4350–4354.

Вернуться к началу

Связанное содержимое

• Документы
• Протоколы

Документы

Номер Описание Опции

2895

Руководство по блоттингу белков, версия C

2032

Брошюра о реагентах для детекции вестерн-блоттинга, ред. F

1529

Вестерн-блоттинг, устранение неполадок, версия C

2134

Повышенная эффективность переноса с использованием буферной системы периодического действия с ячейкой Trans-Blot SD, ред. B

ТЕСТ

Номер Описание Опции

Поддержка

Документы

Заказ

Наша продукция

Компания

вернуться наверх0001

Природный газ, представляющий почти четверть мирового энергетического баланса, играет важную роль в удовлетворении мировых энергетических потребностей.

На протяжении всей цепочки поставок природного газа производителям газа требуются точные измерения состава сжиженного природного газа (СПГ) в режиме реального времени для отбора проб в процессе производства или во время транспортировки для коммерческого учета.

СПГ состоит из метана с более тяжелыми компонентами, такими как этан, пропан, бутан, и микроэлементами, такими как соединения серы и ароматические соединения.

Таким образом, данные о составе и концентрации элементов в смеси могут помочь производителям улучшить понимание и эффективность процесса, улучшить качество и установить ценность продукта.

Потребность в измерении в режиме реального времени возникает, когда природный газ преобразуется в жидкую форму с использованием одной или нескольких компрессорных линий для сжижения и очистки. Линии выработки затем передают потоки СПГ в резервуары для хранения.

Измеряя состав на выходе, производители СПГ лучше понимают, какой продукт поступает в их резервуары. Эти данные позволяют им прогнозировать, как будет стареть СПГ, и лучше планировать поставки по трубопроводу, поездом и по железной дороге.

Несмотря на то, что для этого типа измерения используются установленные методы, эти системы обычно требуют извлечения образцов для тестирования, а результаты задерживаются на 20 минут или дольше.

В результате рамановская спектроскопия быстро завоевывает популярность как эффективная, надежная и экономичная альтернатива, позволяющая получать точные результаты в режиме реального времени.

Спектроскопия комбинационного рассеяния

С момента своего открытия в 1920-х годах спектроскопия комбинационного рассеяния произвела революцию в анализе технологических процессов благодаря неразрушающему режиму работы и способности измерять состав проб.

Спектроскопия комбинационного рассеяния света — это лазерный метод оптического анализа, используемый для измерения состава по колебательным свойствам молекул.

Однако в течение многих лет рамановское оборудование имело репутацию дорогого, громоздкого и сложного в использовании.

В настоящее время достижения в области стабильности и портативности твердотельных рамановских систем, а также технологические усовершенствования в лазерах, оптике и детекторах сделали этот метод более быстрым и доступным для анализа в режиме реального времени.

В результате рамановский анализ все чаще используется в качестве мощного решения для измерения состава и концентрации СПГ. Применительно к встроенным процессам спектроскопия комбинационного рассеяния может предоставить результаты за считанные секунды.

«Комбинационное рассеяние света в анализе состава СПГ является важным достижением», — сказал Мартин Мендес, ведущий инженер по исследованиям и разработкам в компании Analytical Solutions and Products B.V. (ASaP), расположенной в Амстердаме системной интеграторе систем анализа и отбора проб СПГ, используемых в мир. «Использование рамановской спектроскопии для анализа СПГ является относительно новым, и оно уже зарекомендовало себя как высокоточный, эффективный и удобный инструмент для измерения состава».

Образцы отбираются с помощью возбуждающего лазера с длиной волны 785 нм и контактного зонда BallProbe, который производит уникальный спектральный отпечаток, определяющий химический состав и молекулярную структуру СПГ.

BallProbe от MarqMetrix изготавливается из сплава Hastelloy C-276 — суперсплава никеля, молибдена и хрома, устойчивого к экстремальным физическим и химическим воздействиям.

Компания ASaP работает с простыми в использовании коммерческими приборами для спектроскопии комбинационного рассеяния с базирующейся в Сиэтле компанией MarqMetrix. Основанная в 2012 году учеными из Вашингтонского университета, компания специализируется на композиционном анализе с использованием рамановской спектроскопии и стала пионером в области рамановского рассеяния для использования в энергетическом секторе.

Компания MarqMetrix разработала систему «Все в одном» (AIO) для получения идентичных и воспроизводимых результатов от устройства к устройству в корпусе, который на 80 % меньше, чем у предыдущих рамановских приборов.

Каждое устройство является почти точной копией, поэтому общие математические модели могут применяться в разных системах для получения согласованных результатов.

Предыдущие рамановские системы были менее надежными, поскольку для каждой системы требовалась собственная математическая модель и частая повторная калибровка для каждой установки.

Система «все в одном» работает с широким набором контактных датчиков, подходящих для приложений СПГ. BallProbe компании доступен в Hastelloy C-276 — суперсплаве никеля, молибдена и хрома, чтобы противостоять экстремальным физическим и химическим средам.

Система «все в одном» работает с широким набором контактных датчиков, подходящих для приложений СПГ.

Сферическая сапфировая линза зонда может эффективно выдерживать прямой контакт с образцом даже в экстремально холодных и горячих средах (-160°-350° по Цельсию), при высоком давлении (> 400 бар) и в агрессивных средах.

«Мы работаем с MarqMetrix, потому что у них есть высококачественный рамановский прибор, — сказал Мендес. «Погружные оптические датчики компании, которые широко используются в промышленности, позволяют пользователям получать воспроизводимые измерения образцов с точностью выше 1%».

Другим значительным преимуществом рамановской спектроскопии является отсутствие необходимости брать пробы газа для измерения в автономном режиме. Традиционные методы, такие как ГХ, требуют системы впрыска для добавления пробы газа в хроматографическую колонку, которая позволяет компонентам разделяться, а детектор определяет наличие компонента в системе.

Прежде чем можно будет провести надежное измерение, СПГ должен быть переведен из жидкого состояния в газообразное без частичного испарения.

При использовании рамановской системы расходные материалы для тестирования не требуются. «Контактный зонд помещается непосредственно в СПГ без необходимости манипулировать газом, отключать его от сети или вводить газ-носитель», — сказал Мендес. «С меньшим количеством шагов, связанных с измерением, погрешность уменьшается, поэтому измерение намного ближе к истине».

Прямое измерение СПГ методом комбинационного рассеяния дает показания каждые несколько секунд по сравнению с интервалом в 3-5 минут или дольше для традиционных методов.

«Вам нужна информация в режиме реального времени, когда это возможно», — добавил Мендес. «Например, когда дело доходит до коммерческого учета, идеально взять как можно больше репрезентативных проб на протяжении всего процесса разгрузки на танкер или судно».

Калибровка и прогнозное моделирование

Хотя рамановское оборудование MarqMetrix можно использовать для идентификации компонентов СПГ в течение примерно 15 минут после распаковки, для количественного определения концентраций каждого компонента сначала необходимо создать прогнозную модель.

Для этого ASaP устанавливает точность рамановского оборудования на одном из трех своих аналитических испытательных стендов, сравнивая его с измерениями, полученными с помощью традиционного оборудования для газовой хроматографии с подачей СПГ с ближайшей заправочной станции.

«Мы используем сертифицированные приборы для испытаний газовой хроматографией, чтобы получить эталонное значение, которое, как мы знаем, будет как можно ближе к фактическому значению, — пояснил Мендес. «Затем мы проводим измерение с помощью рамановского оборудования и сравниваем два (сопоставляем два измерения для построения модели). Следующим шагом является калибровка Рамановского стандарта сжиженного первичного газа.

Каждое устройство является почти точной копией, поэтому общие математические модели могут быть применены к системам. — добавил Мендес. «После проверки модели клиентам ASaP больше не нужно использовать ГХ, и они могут использовать рамановский анализ исключительно для мгновенных показаний состава СПГ.