Кляксы раскраска: Раскраска клякса | Детские раскраски, распечатать, скачать

Содержание

Раскраски для взрослых: постигни дзен в кляксе, приручи линию и подружись с дудлами

Творчество

Раскраски для взрослых: постигни дзен в кляксе, приручи линию и подружись с дудлами

16 июня 2016 6 663 просмотра


Юлия Скрипник

Сначала вы делаете воодушевленной страницу. А потом — себя самого и мир вокруг. Посмотрите сами на эти необычные раскраски для взрослых и творческие блокноты — и вы разделите наш восторг.

Одна про дудлы, про толпы невероятных дудлов. Вы слегка ошалеете от их безудержного веселья! Вторая — о поиске смысла и познании мира через кляксы. А третья и вовсе про творческий беспорядок — поможет расслабиться и обрести счастье в мелочах. И в заключении — творческий блокнот: он заставит вас удивиться собственной креативности.

Nulla dies sine linea!

Сборище дудлов

Если вам надоели геометрические узоры, котики и цветы — эта книга для вас.

В новой раскраске Зиффлина и иллюстратора Лея Мелендреса еще больше замысловатых паттернов, сверхъестественных существ и уникальных миров. Дракон, рыцарь, йетти и сборище крейзанутых дудлов — подходящая компания для отличного вечера.

Каждый рисунок — целая вселенная со своей историей и героями.

И этой красоты — 50 страниц. Бумага плотная и выдержит любой инструмент: можно раскрашивать красками, фломастерами, гелевыми ручками, карандашами, маркерами. Каждая композиция детально прорисована. Подходит и взрослым, и детям. Хорошее настроение и драйв во время раскрашивания гарантированы. А законченные листы на стене в рамке будут вызывать улыбку.

Тот, кто пройдет про тропе дудлов, уже никогда не будет прежним ;). Источник — @miftvorchestvo.

Хирамеки

Каждая клякса — это вдохновение. Каждая линия — свободна. Откройте свое воображение. «Хирамеки» в переводе с японского означает «своеобразный стиль», «особый отпечаток», «место, где встречаются каракули и воображение».

Проще говоря, это искусство превращения случайной кляксы во что-то удивительное.

Хирамеки заключает в себе два основных вида мыслительного процесса: поиск смысла и познание мира. В маленькой кляксе скрыта магия: ее суть становится явной, стоит лишь добавить черточки и точки так, как подсказывает фантазия.

Если верить тем, кто говорит, что счастье в мелочах, то эта книга должна долго развлекать ваши глаза, руки и голову. А еще почти на каждой странице есть сумаcшедшие забавные хокку.

Смотрите по сторонам туда-сюда: где он, а где она?
Пучок волос — раз, клок волос — два,
вот — шевелюра, а вот — борода.

Хирамеки разделены на 7 уровней — от простых до самых сложных. Вы сможете увидеть в кляксах лица, предметы, животных и даже пришельцев. Настоящее пиршество для вашей фантазии. На каждой странице — воодушевление и радость.

Посмотрите на эти кляксы и позвольте вашему воображению творить магию. Источник — @miftvorchestvo.

Творческий беспорядок

Творческий беспорядок — это уютно и очень красиво. Эта раскраска о любви к мелочам жизни поможет увидеть красоту в повседневных вещах, привести мысли в порядок и расслабиться. Иллюстрации насыщены мелкими деталями: книги, одежда, посуда, носки. Все как в жизни — интересно и красочно!

Разбирать запасы — занятие медитативное, то же самое можно сказать и о раскрашивании.

Это успокаивающее, расслабляющее занятие и для педантов, и для любителей бардака. Вас ждут очаровательные и забавные предметы, которые можно найти в любой квартире — кофейные чашки и солнечные очки, забытые туфли, парочка любовных писем.

Просто откройте «Творческий беспорядок» и добавьте цвета! — Фото@miftvorchestvo

Линия — это точка, которая пошла погулять

Необычный творческий блокнот для рисования, на создание которого вдохновил жизненный девиз художника-абстракциониста Пауля Клее — «Nulla dies sine linea» («Ни дня без линии»). В нем созданы все условия, чтобы удивиться собственной креативности.

А как бы вы изобразили красный, который радуется синему? Да-да, попробуйте проделать это прямо сейчас -)

Внутри — классные иллюстрации и полезные советы. На каждой странице вы найдете инструкции, которые можно трактовать по-разному, что дает максимальную свободу творчества. Художественные навыки не нужны. Чтобы начать — просто освободите ум и следуйте за интуицией.

Вот примеры заданий:

  • Представьте и нарисуйте, что фиолетовый удивился, увидев оранжевый
  • Дорисуйте к красному маку зеленую траву
  • Сделайте эту страницу воодушевленной
  • Изобразите кошку десятью, пятью, одной линией
  • Нарисуйте круги, совершающие марафонский забег
  • Как бы выглядел цветок-астронавт?
  • Нарисуйте свое любимое воспоминание.
Составьте список того, что вас вдохновляет. Нас, например, — этот блокнот -)

Для того чтобы получать удовольствие от рисования, совсем необязательно уметь рисовать. Научившись творить без боязни ошибиться, вы почувствуете себя свободным. Раскрашивайте, творите и радуйтесь лету!

Сказка про кляксу

Каждый из нас знает, что такое «клякса». Кто-то считает её злой, противной, а кто-то использует её в своих целях. Сказка про кляксу обязательно расскажет нам что-то новенькое об этой непредсказуемой особе…

Сказка «Хитрая клякса»
Автор: Ирис Ревю

Жила-была Клякса. Она часто пробиралась в альбомы и тетрадки ребят просто затем, чтобы на нее обратили внимание. Дети злились на Кляксу, но ей до их недовольства не было никакого дела. Она-то считала себя просто красавицей!

Вы спросите, где Клякса родилась? Кто-то говорил, что в чернильнице, кто-то — в красках. Долгое время она никак не проявляла себя, и об её существовании никто не знал.

Но вот однажды Коля Кляксин решил нарисовать домик. Он нашёл подходящую кисточку, намочил её в воде, а потом окунул в краску. Краски было с избытком. Во что это вылилось? В кляксу. А дело было так. С кисточки стекла капля и плюхнулась на альбомный лист.

— Не ждали? – спросила Клякса у Коли.

— Нет, — искренне ответил мальчик.

Было видно, что он расстроился. Что делать? Оставалось только взять новый лист и начать рисовать снова. Но, увидев действия мальчика, Клякса сказала:

— Не торопись. Взять новый лист ты всегда успеешь. Давай превратим меня во что-то полезное.

— Во что можно тебя превратить? – удивился Коля Кляксин.

— А ты подумай. Если человек захочет, то он может многое осуществить.

Коля почесал в затылке. Он решил превратить Кляксу в маленькое озеро. А на берегу озера будет стоять давно задуманный мальчиком домик.

Коля взял голубую краску и превратил бесформенную кляксу в маленькое прекрасное озерцо, рядом с которым летали бабочки, стрекозы. Недалеко цвели цветочки.

Следом Коля нарисовал домик. Аккуратным, красивым он получился. На крыльце дома стояла девочка и любовалась водной гладью озера.

Хороший получился рисунок. Давно Коле хотелось нарисовать нечто подобное. Именно такой Коля представлял и планету Земля – доброй, радостной, со множеством светлых домиков.

Впредь, когда Коля пользовался красками и кисточкой, он делал это аккуратно. Но иногда Коле Кляксину, а ведь на то он и Кляксин, хотелось пошалить. И тогда он начинал свой рисунок с Кляксы. А потом совершал разные превращения. Клякса становилась тучкой, облаком, медвежонком…

Так интересно совершать превращения!

А когда Коля делал перерыв в рисовании, например, читал книги или играл в мяч, Клякса, чтобы не заскучать, пробиралась в альбомы и тетрадки других ребят.

Скучать она не любила!

Вопросы и задания к сказке про кляксу

Каким образом Коля Кляксин познакомился с кляксой?

Что такое клякса?

Как она рождается?

Почему сказка называется «Хитрая клякса»?

Во что решил превратить кляксу Коля?

Каким тебе показался мальчик Коля – находчивым или нет?

Нарисуй, как клякса превращается во что-то хорошее.

Какие пословицы подходят к сказке?

Находчивость на деньги не купишь.
Творчество и ум – родственные понятия.
Смекалка умному подмога.

Сказка Мы ищем кляксу — Сутеев В.Г. С иллюстрациями автора.

Сказка про Машу и Ваню, которые отправились в альбом Художника, чтобы спасти рисунки от кляксы. А альбоме их ждет встреча с Бабой-ягой, акулой, тигром, инопланетянами и даже драконом…

Мы ищем кляксу читать

Всё началось с неприятности. Ваня и Маша пришли к соседу Художнику посмотреть его рисунки.

Вдруг Маша нечаянно опрокинула баночку с тушью прямо на альбом. Получилась большая безобразная клякса.

Ребята заплакали, а Художник сказал:

— Ничего, сейчас достану кляксовыводитель, и мы её…

Художник ушёл в другую комнату, а Клякса, представьте себе, ожила, захихикала и спряталась где-то среди страниц альбома.

Когда Художник принёс кляксовыводитель, кляксы уже не было.

— Она убежала туда… в альбом… — сказали Ваня и Маша.

— Клякса погубит все мои рисунки! — воскликнул Художник. — Её во что бы то ни стало нужно поймать!

— Мы готовы её ловить, но как? — спросили ребята.

— А вот как! Сидите смирно!

Художник быстро-быстро нарисовал в альбом портреты Вани и Маши, потом взмахнул карандашом и произнёс заклинание:

— Мульти-пульти,

Раз, два, три.

И в альбоме

Вы — внутри!

И когда он перевернул страницу альбома…

…Ваня и Маша очутились в сказочном лесу около избушки на курьих ножках. В избушку вели чёрные грязные следы, а из окошка с грохотом летела всякая утварь…

— Клякса здесь… — прошептал Ваня, — мы её подкараулим и…

Вдруг с воем, словно реактивный самолёт, прилетела в ступе Баба-Яга.

— Кто это тут хозяйничает?! Кто здесь безобразничает?! — закричала она, размахивая помелом.

Ребята спрятались в бочку, но Баба-Яга сразу их обнаружила и приказала Филину:

— Ты, Филька, пуще глаза своего сторожи их, а я большой котёл воды вскипячу, и мы их…

— Спасите! — закричал Ваня.

Перевернув страницу альбома, Художник спас ребят от страшной Бабы-Яги, но бочка, к сожалению, оказалась в открытом море…

— Бочка дырявая… мы тонем! — запищали ребята.

— Не бойтесь, — сказал Художник и, несмотря на большие волны, несколькими штрихами нарисовал лодку.

— Теперь перебирайтесь сюда! — скомандовал он.

Ваня и Маша почувствовали себя в безопасности, но ненадолго: огромная чёрная Акула вынырнула из воды и погналась за лодкой.

Художник пририсовал к лодке парус, но Акула не отставала… Пришлось перевернуть страницу… и ребята оказались посреди жаркой пустыни. По песку тянулись чёрные следы…

— Здесь была Клякса, — сказал Ваня.

Ребята пошли по следам и не заметили, как перед ними появился огромный Лев.

Лев раскрыл пасть и громко зарычал…

— Спокойно. Я здесь! — раздался голос Художника.

Рука его взмахнула карандашом, и Лев оказался в прочной клетке.

А ребята… — на следующей странице альбома.

— Где мы? — спросили они.

— Вы находитесь на неизвестной науке планете, которую я придумал, — сказал Художник и пририсовал детям скафандры с антеннами, чтобы они могли двигаться в неземной атмосфере.

Ваня и Маша с любопытством рассматривали незнакомый мир и вдруг заметили в небе странный летательный аппарат, который быстро к ним приближался.

«Летающая тарелка» опустилась неподалёку, и из её люков со свистом выскочили существа, похожие на осьминогов, — обитатели этой планеты.

— Уинпетриско сито бандо цютко, — бормотали они на своём языке, очевидно приветствуя Ваню и Машу.

— Марженгола! Стрикококо! — кричали жители планеты, танцуя вокруг детей.

— Смотри-ка, — тихо сказал Ваня Маше, — ведь один из них совсем чёрный!

— Клякса! — пискнула Маша.

Но было поздно — Клякса юркнула на следующую страницу.

— Да это же наш двор! Мы дома? — удивился Ваня.

— Ты угадал, — сказал Художник. — Я нарисовал наш двор и даже нашего дворника дядю Федю.

— Здесь была Клякса, — сказала Маша, — тут везде её следы.

— Я-то знаю, откуда эти пятна! — вдруг грозно закричал дядя Федя. — И знаю, кто тут безобразничает!

— Это не мы, дядя Федя! Это Клякса!

Художник хотел спасти ребят от дяди Феди, но на этой странице они угодили прямо на спину ужасного Змея Горыныча. Дядя Федя тоже почему-то попал сюда.

— Я вам всем покажу! Всех к порядку приучу! — кричал дядя Федя, размахивая метлой.

Змей Горыныч с ребятами на спине бросился наутёк… но дядя Федя догнал его. И досталось же Змею Горынычу!

А пока дядя Федя с ним расправлялся, Ване и Маше удалось улизнуть на другую страницу альбома.

Там пришлось взбираться на крутые горы и отвесные скалы, и если бы не Художник, который нарисовал мостик через бездонную пропасть, ребята не попали бы на следующую страницу.


Ура!!!

Кляксу нашли и поймали только на самой последней странице.

— Молодцы! — сказал Художник, взмахнул волшебным карандашом и произнёс заклинание:

— Мульти-пульти,

Пятью пять —

И вы в комнате опять!

— Вы волшебник? Фокусник? — спросили ребята.

— Нет, я просто художник-мультипликатор!

(Илл. В.Г.Сутеев)

Кляксография,это что?

В наше время получил широкое распространение достаточно нестандартный вид изобразительной деятельности – кляксография.  Кляксография – это дорисовывание нанесённой на бумагу произвольной кляксы до узнаваемого художественного изображения.  Традиционно кляксы получают, капнув на лист бумаги чернила,  а чтобы возможности для применения фантазии стали шире  форму ее усложняют, накрыв сверху вторым листом и разгоняя чернила между листами в разных направлениях. Есть и другой способ, раздувать каплю чернил по листу, но я его рекомендовать не стану — нужно много сноровки и осторожности.

Если вы собираетесь  приобщить к кляксографии одного ребёнка-сына или дочь,то ,конечно, есть смысл  заготавливать кляксы вместе – ещё и позабавитесь. Но при работе с целыми классами или группами,  этот этап лучше пусть выполняет  сам преподаватель. Капать и размазывать чернила всем-всем классом, право, не стоит -дети перемажутся, а это не наша задача.

Я заготавливаю кляксы так: выделяю вечерок, развожу во флаконе с капельницей чернила с водой 1:3, потому что  просто чернильные кляксы очень мажутся.  и капая на листики,накрываю их другими-стопкой.  Полученным листкам с кляксами  даю  просохнуть(например,на радиаторе), а потом рассматриваю что вышло.  Тут ещё есть такие нюансы-вид клякс, среди прочего будет зависеть от качеств бумаги. В газетную бумагу  краска впитывается быстро, пятно не успевает сильно растечься. На гладкой бумаге, типа ксероксной , чернила можно разгонять во всех направлениях долго и вычурно. Но от себя замечу, что  излишне сложные кляксы  НЕ лучше простеньких. Особой нужды создавать суперзапутанные свехзагадки нет. Многие полученные кляксы вообще ничего особо так не напоминают. Если вы собираетесь проводить занятие со многими детьми, то стоит заранее отобрать наиболее зрелищные кляксы: урок надо проводить динамично, без пауз и заминок с непонятными пятнами..

Лирическое отступление: разбирая пачки высохших клякс, я сортирую — интересные откладываю для занятия, невпечатляющие… что?

Да, дорисовываю сама, просто чтобы потренироваться и доказать себе, что любую кляксу я могу вывести в люди. Но дело это небыстрое, над некоторыми приходится ломать голову очень долго. Понятно, что такие творческие поиски — не вариант для  плановых занятий с детьми. (Впрочем,у меня были классы, в которых дети выстраивались в очередь за  «забракованными «кляксами просто, чтобы показать свою крутость, и превращали убогие пятна в реальные шедевры).

Дети, увлеченные своими выдумками, склонны упрощать изображение и совершенно пренебрегать пропорциями и хотя бы относительным правдоподобием. Поэтому перед занятием кляксографией стоит провести краткое повторение строения животного и человека. Затем на глазах класса дорисовать четыре-пять клякс до картинки, обращая внимание детей, что если кляксу поворачивать,то она в разных положениях «прочитывается»по-разному.

Вот, вчера я накапала клякс, а сегодня дорисовала некоторые для вас.

На первом этапе освоения этого рода творчества учащимся лучше предлагать  работать простыми карандашами, затем, освоившись, можно перейти на фломастеры и цветные карандаши, и наконец наивысшее достижение – дорисовывать гуашевыми красками. Занятия эти развивают воображение, ассоциативное мышление и, с толком применяемые, дают изумительные результаты. Вот, из моих архивов:

Кляксография 1

Дорисовал третьеклассник

Кляксография 3

Это первая статья из серии про  методики развития воображения у детей. Подписывайтесь на обновления блога Handykids.ru -«Изо» и «ручной труд» для детей по почте]

Практическими советами по занятиям кляксографией с вами поделилась Марина Новикова.

Читайте ещё об изобразительных техниках:

Традиционные изобразительные средства

Нетрадиционные  изобразительные техники


Метки: детское творчество, нетрадиционные техники рисования, развитие воображения у детей

Читайте также:

Google+

Марина Новикова

Простой способ раскрасить объект в Иллюстраторе. Подробный видео урок.

В прошлом уроке мы рисовали контур гитары по фотографии, а сейчас раскрасим его. Если рисовать вручную цветные пятна под контуром, это займет много времени, кроме того, в некоторых местах возможна неровность, при использовании автоматического инструмента делается это одним нажатием кнопки. В этом уроке я расскажу, как раскрасить векторное изображение в Adobe Illustrator CC вручную и автоматически.

Раскрашивание вручную

Для ручного метода подойдет инструмент «Кисть-клякса«, который можно сочетать с «Карандашом«, чтобы дорисовывать более мелкие детали. Иногда заливка может выходить за контуры, поэтому, периодически это нужно подправлять «Ластиком». Мой графический планшет позволяет стирать лишнее обратной стороной пера.

Ручной способ раскрашивания, требует большой внимательности и много времени. Лучше его применять лишь в крайних ситуациях, когда не срабатывает автоматический.

Раскрашивание объекта автоматическим способом

Но есть более легкий способ заливки цветом. Выделите весь рисунок и возьмите инструмент «Быстрая заливка«. Этот инструмент, распознает пространство ограниченное контурами и заливает его выбранным цветом. Выберите нужный цвет и наведите мышкой, контур области подсвечивается. Если этого не происходит, значит есть слишком большой зазор между контурами, желательно перед раскраской все их замкнуть. Теперь, достаточно нажать по областям, которые вы хотите раскрасить.

Выделяйте только те области, цвет между которыми должен быть разный.

Например, струны и лады накладываются поверх рисунка и не разграничивают цвета, поэтому я снял с них выделение.

Инструмент «Быстрая заливка» действует как эффект. Поэтому, после завершения раскрашивания рисунок необходимо еще раз «Разобрать…» на объекты. А затем несколько раз разгруппировать.

Теперь можно выставить правильные цвета из палитры или взяв образец «Пипеткой» с фотографии.

Добавление теней, бликов и дополнительных деталей.

Иногда может потребоваться разграничить заливку еще на несколько цветов, например, для создания теней и бликов или дополнительных деталей. Рисуем карандашом новую фигуру, как показано на снимке ниже, выделяем обе.

Берем инструмент «Создание фигур» и удерживая клавишу ALT нажимаем по лишней области. Теперь, новый элемент можно перекрасить в другой цвет.

А вот и готовый векторный рисунок гитары, теперь его можно использовать в макете или продать на микростоке.

Подробнее о раскрашивании в видео уроке:


Пишите в комментариях, получилось ли у вас сделать векторный рисунок или возникли трудности.

(Visited 21 570 times, 39 visits today)

Раскраска для математиков

Одна из самых красивых и до сих пор не решенных задач математики формулируется следующим образом. Попытаемся раскрасить плоскость так, чтобы никакие две точки, находящиеся на расстоянии одного сантиметра друг от друга, не оказались покрашены в один цвет. Какое минимальное число цветов для этого потребуется? Несмотря на кажущуюся простоту, за почти 70 лет существования этой задачи точного ответа до сих пор нет, притом что над ним работала целая плеяда выдающихся ученых, в том числе и Пал Эрдёш, один из крупнейших математиков XX века.

Примерно 60 лет назад математики выяснили, что это минимальное число цветов равно или четырем, или пяти, или шести, или семи — и до последнего момента этот результат не удавалось улучшить. Но на прошлой неделе британец Обри ди Грей опубликовал статью, в которой доказал, что четырех красок тоже не хватает, сократив число вариантов до трех: пять, шесть или семь.

Примечателен также тот факт, что сам ди Грей далек от фундаментальной математики, область его профессиональных интересов больше связана с биомедициной — он является ведущим научным сотрудником фонда SENS борьбы со старением. Пожалуй, ближе всего к математике относятся его статьи, посвященные искусственному интеллекту в медицине.

Редакция N + 1 решила разобраться в истории задачи о раскрашивании плоскости (и не только) и рассказать о том, как математик-любитель смог сделать новый важный шаг к ее решению, в некотором смысле опередив многих профессионалов.


Формулировка проблемы

Задача о хроматическом числе плоскости

Каково наименьшее число цветов, достаточное для раскрашивания плоскости таким образом, чтобы на ней не было двух точек одного цвета, расположенных на расстоянии 1 (одного сантиметра) друг от друга?

Сегодня никто не сомневается в том, что задача о раскрашивании плоскости — из области теории графов. Она возникла в середине XX века, причем, по всей видимости, независимо друг от друга ее придумали сразу несколько математиков — к числу авторов причисляют и самого Пала Эрдёша. В «Математической книге раскрасок» Александр Сойфер рассказывает о результатах своих попыток установить авторство задачи — опросив несколько математиков, Александр пришел к выводу, что первым сформулировал задачу Эдвард Нельсон — тогда студент Университета Чикаго. В 1950 году Эдвард Нельсон занимался проблемой раскрасок планарных графов, которая позднее получила название теоремы о четырех красках.

Планарный граф

Графом называется набор точек (вершин) и соединяющих их отрезков (ребер). Планарным называется такой граф, который можно нарисовать на плоскости без пересечения ребер.

Чему равно наименьшее число красок, достаточное для раскраски всех вершин любого планарного графа так, что никакие две вершины, соединенные ребром, не оказались одноцветными?

У этой проблемы есть более простая эквивалентная формулировка: возьмем некоторую карту, нарисованную на плоскости. Она состоит из замкнутых областей, граничащих друг с другом. Всегда ли эту карту можно раскрасить в четыре цвета так, чтобы никакие две страны одного цвета не имели общей границы?

Нельсон предположил, что вместо того, чтобы раскрашивать всевозможные планарные графы, можно построить один огромный граф, в котором содержатся все возможные планарные графы. И тогда, если доказать, что этот «суперграф» раскрашиваем по правилам в четыре цвета, то утверждение теоремы станет очевидным следствием.

Кандидатом на роль «большого-большого» графа стала такая конструкция: возьмем все (без исключения) точки плоскости. Они станут вершинами нашего графа. Если пара точек находится на расстоянии длиной в единицу (например, в один сантиметр), то мы соединим их отрезком — эти отрезки станут ребрами нашего графа. Конечно, он не будет планарным. Вопрос, который задал Нельсон: можно ли раскрасить вершины такого графа в четыре цвета?

Эта формулировка, при внимательном рассмотрении, полностью совпадает с обычной задачей о раскрашивании плоскости. Просто нам надо увидеть за каждой из точек плоскости вершину графа, соединенную огромным числом ребер с другими вершинами.

Сразу стоит заметить — к сожалению, идея Нельсона не помогла в решении задачи о четырех красках. Настоящее доказательство было представлено лишь 26 лет спустя Кеннетом Аппелем и Вольфгангом Хакеном и оно было основано на классификации всех возможных планарных графов (карт) на 1936 различных категорий (позднее упрощено до 633), раскрашиваемость каждой из которых можно проверить. Это доказательство стало первым компьютерным доказательством сложной математической задачи. Так перебор победил любимое математиками обобщение.


Первые результаты

Первые шаги к решению задачи о раскрашивании плоскости сделать очень просто. Задумаемся над тем, какого количества цветов точно не хватит. Очевидно, одной краски будет мало. А хватит ли двух?

Легко показать, что и двух цветов недостаточно. Для этого потребуется доказательство от противного. Пусть мы раскрасили нашу плоскость в два цвета. Тогда возьмем на ней равносторонний треугольник со стороной равной одному сантиметру. Первая вершина — синяя, вторая — красная. А какого цвета третья вершина? Так как она находится на расстоянии одного сантиметра от первых двух, то ни синей, ни красной быть не может. Налицо логическое противоречие.

Немного сложнее показать, что и трех красок недостаточно. Возьмем ромб, состоящий из двух склеенных между собой по стороне правильных единичных треугольников, и попытаемся его раскрасить. Две склеенных вершины пусть будут синего и красного цвета, а оставшиеся две совершенно точно окажутся третьего, например зеленого, цвета. Расстояние между этими двумя зелеными вершинами равно квадратному корню из трех — никаких противоречий с условием теоремы здесь не возникает.

Но на самом деле мы только что доказали, что любые две точки на плоскости, расположенные друг от друга на расстоянии квадратного корня из трех, будут одноцветными. Значит, если мы возьмем одну зеленую точку и построим вокруг нее окружность диаметром корень из трех, окажется что она тоже будет зеленой! Но между некоторыми точками этой окружности точно будет единичное расстояние (у каждой точки окружности будет минимум две таких соседки). А это уже противоречит условию. Этот результат был получен Гуго Хадвигером в 1961 году — кстати, Хадвигера считают вторым автором задачи о хроматическом числе.

Веретено Мозера — минимальный граф, для раскраски которого нужно четыре цвета

Это построение можно легко упростить — тогда мы получим известную фигуру под названием «веретено Мозера». Возьмем две копии нашего ромба с общей зеленой вершиной и немного повернем их друг относительно друга — так, чтобы расстояние между двумя другими «зелеными» вершинами стало единицей. Вершины такого графа, конечно же, нельзя раскрасить в три цвета — красок потребуется как минимум четыре.

Способ раскрашивания плоскости в девять цветов

Итак, мы выяснили, что при соблюдении исходного условия нельзя раскрасить плоскость в три цвета. Но можно ли вообще хоть как-то раскрасить плоскость так, чтобы эта раскраска соответствовала требованию задачи? Ответ: да, конечно. Простейшая раскраска, приходящая в голову, — сетка из квадратов со стороной 0,51 сантиметра, состоящая из повторяющихся сегментов 3×3, покрашенных в девять разных цветов. Минимальное количество цветов, для которого известна раскраска плоскости, равно семи: в ее основе лежит замощение плоскости шестиугольниками, на манер пчелиных сот.

Способ раскрашивания плоскости в семь цветов

Математики пытались сократить число цветов для верхней границы, но это оказалось не так просто. Например, в одной из раскрасок плоскости семиугольниками и квадратами доля площади, покрашенной в седьмой цвет, не превышает 0,3 процента. Им окрашены лишь маленькие квадраты. Но полностью избавиться от него не выходит.

Раскраска плоскости в семь цветов

Все эти простые результаты были получены еще до 1962 года. И на протяжении более полувека продвинуться в решении этой задачи не удавалось.


Неуловимое число

Особенность задачи о хроматическом числе заключается в том, что, по всей видимости, какого-то общего подхода или инструмента для ее решения нет (или пока нет). С другой стороны, раскрашивание графов было неплохо исследовано, и открыта важная теорема, которая появилась независимо от задачи про плоскость в 1951 году и указывает некоторый путь к тому, как может выглядеть решение. Это теорема де Брёйна-Эрдёша.

Вернемся к формулировке, которую дал для задачи о хроматическом числе Эдвард Нельсон. По сути, наша цель — раскрасить огромный бесконечный граф, в котором вершинами являются все, без исключения, точки действительной плоскости. Николаас де Брёйн и Пал Эрдёш исследовали, как соотносится раскраска бесконечного графа и отдельных его частей, субграфов. Оказывается, хроматическое число бесконечного графа — если оно вообще конечно — равно максимальному хроматическому числу его конечных подграфов.

Мы уже знаем, что хроматическое число плоскости конечно, не превышает семи. Значит, если оно равно, скажем, шести, то мы точно сможем построить конечный граф с единичными расстояниями между связанными вершинами, для «правильной» покраски которого потребуется как минимум шесть цветов. К сожалению, доказать, что другого графа с хроматическим числом, равным семи, не существует, с помощью этой теоремы не выйдет. Зато, если найти такой граф с хроматическим числом, равным семи, то задача о хроматическом числе плоскости будет наконец-то решена.

Стоит заметить, что доказательство теоремы требует использования специальной аксиомы теории множеств — аксиомы выбора. Не вдаваясь в подробности, заметим, что не все системы аксиом включают ее и в некоторых специальных случаях эта теорема может оказаться неверна. А значит, и хроматическое число плоскости, в теории, может зависеть от выбора аксиом.


Другие хроматические числа

Задача о раскрасках плоскости легко расширяется. Например, можно попробовать раскрашивать с теми же требованиями пространства высших размерностей: ничто не мешает раскрашивать трехмерное или четырехмерное пространства. Больше того, можно рассматривать не только плоскости действительных чисел, но и ограничиться только рациональными числами. Для этого случая хроматическое число окажется удивительным образом равным двум. Есть и некоторые другие специальные формулировки задачи, в которых запрещается не одно, а несколько расстояний.

Хроматические числа пространств различных размерностей. R — действительные числа, Q — рациональные числа

Пятицветный граф

Теорема де Брёйна-Эрдёша словно бы предлагает строить все более и более сложные графы с единичными расстояниями между связанными вершинами и исследовать их хроматические числа. Именно этим и решил заняться Обри ди Грей. По сути, он сделал следующее: нашел маленький граф, в котором есть два разных типа раскрасок в четыре цвета, и вплел его сначала в один огромный граф, который запретил первый тип раскрасок, а потом в другой, запретивший второй тип раскрасок. Объединив эти два графа, ди Грей получил новый, еще более монструозный, граф с 20 тысячами вершин, в котором для исходного маленького графа запрещены обе раскраски в четыре цвета. А значит, без пятого цвета не обойтись.

Огромные размеры сеток, которые раскрашивал ди Грей, совершенно не позволяли работать с ними вручную. Поэтому британец активно использовал в построениях компьютер. Проследим за его работой.

Построим правильный шестиугольник со стороной, равной одному сантиметру, поставим точку в его центре и соединим ее с вершинами. Все нарисованные нами отрезки имеют единичную длину, перед нами граф с 7 вершинами и 12 ребрами. Попытаемся раскрасить его в четыре цвета всеми возможными способами. Оказывается, есть всего лишь четыре принципиально различных раскраски шестиугольника, причем в двух из них возникают равносторонние треугольники со стороной, равной квадратному корню из трех, все вершины которых окрашены в один цвет. Их ди Грей называет монохроматическими тройками.

Раскраски сверху содержат монохроматический треугольник, снизу — нет

Aubrey D.N.J. de Grey / arXiv.org, 2018

Оказывается, можно построить такой граф (каркас из вершин и ребер), в котором обязательно найдется монохроматическая тройка. Он будет состоять из 52 таких шестиугольников, правильным образом расположенных на плоскости. Построение начинается с шестиугольника, построенного из шестиугольников из абзаца выше, который затем удваивается и поворачивается относительно центра, а затем снова удваивается и поворачивается относительно вершины, лежащей на расстоянии двух сантиметром от центра.

Каркас из 52 шестиугольников, в котором гарантированно возникнет монохроматическая тройка

Aubrey D.N.J. de Grey / arXiv.org, 2018

Затем ди Грей построил другой граф, в котором монохроматические тройки запрещены. Первая попытка построить этот граф компьютерным перебором, взяв за основу много веретен Мозера, провалилась. Но затем ди Грей заменил их на граф, в котором одна вершина окружена тридцатью другими, лежащими на единичной окружности определенным образом. Затем он взял еще тридцать таких сеток и совместил их центры с вершинами исходного 31-вершинного графа. Получилась 1345-вершинная конструкция — она называется графом W. Семь копий W ди Грей поместил в вершины самого первого единичного шестиугольника с седьмой вершиной в центре и проверил, как его можно раскрасить. Компьютерный перебор показал, что в центральном шестиугольнике не может возникнуть монохроматической тройки.

Каркас, в центре которого гарантированно не может возникнуть монохроматической тройки (справа, слева — исходная структура для построения)

Aubrey D.N.J. de Grey / arXiv.org, 2018

На следующем этапе ди Грей скопировал этот граф 52 раза так, чтобы его частью оказался граф из предыдущего абзаца, в котором монохроматическая тройка обязательно возникнет. Получившийся 20425-вершинный каркас (151311 ребер) нельзя раскрасить в четыре цвета, так как иначе возникает противоречие. Так и получился первый пример графа с единичными расстояниями между связанными вершинами, хроматическое число которого равно пяти.

В конце статьи ди Грей также приводит упрощенный 1567-вершинный граф, который также требует для раскрашивания пять цветов. Правда, как оказалось, в этом месте британец немного ошибся и удалил слишком много вершин.


А что дальше?

Сразу после публикации препринта на arXiv.org профессиональные математики приступили к проверке доказательства. Несмотря на некоторый скепсис — любитель продвинулся в задаче, в которой никто не мог продвинуться почти 60 лет? — оказалось, что решение в целом верно. Это подтвердила многократная независимая компьютерная проверка построения. Правда, с упрощенным графом вышла ошибка — оказалось, что он все же раскрашиваем в четыре цвета. Но этот «баг», как его назвали математики, легко исправляется добавлением 18 вершин, которые ди Грей удалил на последних шагах упрощения.

Вслед за этим ди Грей, посоветовавшись с Терренсом Тао, опубликовал новую задачу на сайте проекта Polymath Projects по поиску возможных упрощений пятицветного графа. На сегодняшний момент лучший результат предложил Марайн Хюле (Marijn Heule) из Университета Техаса, сократив число вершин до 826. Кстати, про работы Марайна мы писали два года назад — он является автором самого большого компьютерного доказательства.

Граф из 826 вершин с единичными расстояниями между связанными вершинами, который невозможно «правильно» раскрасить в четыре цвета

Marijn Heule

Но главная цель поиска маленького графа — не упрощение доказательства. Простой пятицветный граф может стать основой для построения шестицветного графа, если такой существует. Кроме того, можно попытаться сделать похожие построения для улучшения границ задачи о хроматическом числе в высших размерностях.


Важный результат?

Мы обратились за комментарием о значении результатов Обри ди Грея к Андрею Райгородскому, заведующему лабораторией продвинутой комбинаторики и сетевых приложений и директору Физтех-школы прикладной математики и информатики. Публикуем ниже его расширенный комментарий.

«Для плоскости это выдающийся результат, безусловно. Удивительно, что за 70 лет математики — любители и профессионалы — так и не продвинулись. Другое дело, что на большие размерности всерьез это не обобщить. Может быть, если c помощью такой же идеи повозиться с компьютером, то получится улучшить нижнюю границу с шестерки до семерки в размерности три, но это уже не так ярко. В размерности четыре сейчас оценка девять, и она тоже компьютерная, ее сделал Джоффри Экзу, который сейчас активно участвует в обсуждении работы ди Грея на polymathprojects.org и пытается сделать количество вершин поменьше. Но в асимптотике это ничего не даст, это точно.

Когда мы хотим сделать что-то для хроматического числа N-мерного пространства (Rn), то мы хотим получить какое-то улучшение асимптотики. Сейчас есть экспоненциальная оценка, некая константа в степени n. Улучшить константу в основании экспоненты способом ди Грея нельзя. Но в малых размерностях, может быть, это стимулирует какую-то деятельность на компьютере и улучшит оценки.

Но этот результат — ровно для плоскости. Даже если мы возьмем хроматическое число четырехмерного пространства, то нижняя оценка для него сейчас девять, а верхняя порядка тридцати-сорока. И разрыв между нижними и верхними оценками растет экспоненциально. От того, что кто-то улучшит нижнюю оценку на единичку, великого прорыва не случится.

Задачу о хроматическом числе можно расширять. Даже на плоскости есть масса нетривиальных вопросов. Вот, например, давайте у нас раскраска будет устроена не абы как, а так, чтобы точки каждого цвета соответствовали измеримому множеству. Тогда нам потребуется не меньше пяти цветов. Но раз уж мы теперь выяснили, что нам и так надо не меньше пяти цветов, то надо думать, почему число цветов для раскраски измеримыми множествами меньше шести.

Мы можем ограничивать суть цвета. Называть цветом на плоскости множества каких-то хороших точек, например, измеримые, как в примере выше, или ограниченные жордановыми кривыми. Это означает, что мы будем красить плоскость какими-то кляксами, это еще более сильное ограничение, чем измеримость. Для покраски кляксами, например, известно, что хроматическое число не может быть меньше шести (и, конечно, не больше семи).

Алексей Белов-Канель предложил еще один любопытный результат — для покраски прослойки. Возьмем тонкую прослойку в трехмерном пространстве с ненулевой толщиной, причем толщина может быть сколь угодно маленькой. Ясно, что верхняя оценка для хроматического числа такой фигуры тоже семь: мы можем покрасить ее так же, как и плоскость в шестиугольники, а затем построить над ними такие призмы. Когда мы красим плоскость, то шестиугольное замощение оставляет у нас некоторый запас, позволяющий заполнить пространство прослойки. Оказалось, что если рассматривать такую прослойку в трехмерном пространстве, то на ее покраску уйдет минимум от пяти до семи цветов, а в четырехмерном — от шести до семи.

Может быть, на основе компьютерного вычисления можно сделать что-то еще лучшее. Может, получится придумать, как умножить плоскость на какую-то [0, ε25], чтобы в этой размерности в точности семь цветов было. Сейчас у меня куча народу этим занимается и проверяет.

Если есть желание найти точное хроматическое число, то это только про плоскость или про трехмерное пространство. В общем случае не видно вообще никаких инструментов. То, что сделал Обри ди Грей, — он просто придумал некий способ конструирования конкретного графа. Хорошо, что он сработал для размерности два, но это никак не обобщается на размерность N. Это вполне стандартная идея, она витала в воздухе.

Есть шанс, что мы найдем когда-нибудь хроматическое число плоскости. Но я не верю, что у нас есть хоть какой-то шанс найти хроматическое число Rn в точности. Асимптотические оценки сверху и снизу будут.

Есть похожие классические задачи в комбинаторике, такие как число Рамсея. Никто не знает, чему равно число Рамсея от параметров (5, 5). Общей формулы для числа Рамсея для параметров S и T никто не ожидает получить в ближайшем будущем. И это не вопрос о построении конкретного графа, как это сделал Обри ди Грей. Это вопрос о том, как в принципе устроен мир. Это гораздо сложнее.

Надо сказать, что Сойфер верил, что хроматическое число будет не меньше пяти. В каком то смысле Александр предсказал то, что сделал ди Грей. Я верил, что хроматическое число будет равно четырем, — потому что долгое время никто не мог сделать пять. Сейчас не очень понятно, во что верить. Наверное, не семь — пять или шесть, трудно судить, непонятно пока», — завершил свою мысль Андрей Райгородский.


Зачем?

Задача раскрасок графов, на самом деле, имеет вполне конкретные применения в программировании и оптимизации. В некотором смысле, даже судоку можно свести к раскраске графа. Но, конечно же, многие математические задачи решаются совсем не ради практических применений. Лучшей иллюстрацией этого положения будет цитата из книги Александра Сойфера «Математическая книга раскрасок»:

«Уже много лет я убежден, что хроматическое число будет равно 7 или 6. Как-то раз Пал Эрдёш сказал, что у Бога есть бесконечная книга, в которой содержатся все теоремы и самые лучшие их доказательства, и некоторым Он показывает ее на мгновение. Если бы я был удостоен такой чести и у меня был бы выбор, я бы попросил заглянуть на страницу с задачей о хроматическом числе плоскости. А вы?»

Владимир Королёв

Раскраска приключения незнайки и его друзей. Как нарисовать незнайку карандашом поэтапно

Советские мультфильмы всегда вызывают теплые воспоминания и легкое недоумение у молодого поколения. Как же так? Мультики сделаны не на компе с помощью трехмерной графики? Да, их рисовали красками, поэтому они все примитивные, плоские, политкорректные. (Взять, например, Винни Пуха) Такое вот у нас было детство. Персонажа, о котором пойдет речь в этом уроке, знают даже самые мелкие. Расскажу как рисовать Незнайку. Это коротышка с большим носом и шилом в заднице шляпой на голове. Одет он как заядлый хиппи, во все цвета радуги. Отличительные черты: повышенная хвастливость, необоснованная смелость, критическое невежество. Этого вы не знали:

  • На могиле автора Незнайки изображен именно мальчик с мультфильма. Толи автор любил так сильно своего персонажа, толи он писал его с себя.
  • Китайцы очень полюбили этот мультик. Они даже собственный перевод имеют, но главный атрибут – активное использование образа Незнайки при оформлении российского павильона на международной выставке ЭКСПО-2010 в Шанхае.

Приступим к художественной части.

Как нарисовать Незнайку карандашом поэтапно

Шаг первый. Создаем спичечного человечка с большим ореолом вокруг головы. Шаг второй. Отталкиваясь от нарисованных линий, даем человечку больше объема. Шляпу делаем более острой, конечности более заметными. Шаг третий. Время одеть мальчугана. Рисуем ботинки, брюки, маленький галстук под расстегнутым воротником. Выделаем под шляпой прическу в стиле хай-трэш. Шаг четвертый. Для лучшего восприятия, добавьте складки в местах закатанных рукавов, выделите подошвы на ботинках. Ну, главное – не забудьте обо всех чертах лица. Непоседа готов к новым подвигам. Если Вы хотите увидеть как рисовать других персонажей мультфильмов, которые Вам нравятся, пишите мне об этом на страничке заказов. Смотрите еще такие уроки рисования.

Раздел представляет раскраски с героями произведений Николая Носова о приключениях маленьких человечков. Основной персонаж этой серии сказок – Незнайка. Всего о нем было издано три части:
«Приключения Незнайки и его друзей»,
Незнайка в Солнечном городе,
Незнайка на Луне.
По этой сказочной трилогии создано несколько замечательных мультфильмов и мультсериалов.

Раскраски о приключениях Незнайки

На нашем сайте можно скачать 36 раскрасок с изображением Незнайки и других персонажей, участвовавших в книгах и мультиках о нем. Нажмите на изображения с этими забавными коротышками, чтобы распечатать их бесплатно. Вы найдете среди них раскраски таких героев:

1. Раскраска Незнайка.

Главный участник описываемых в книгах сказочных событий – коротышка по имени Незнайка. Зовут его так потому, что он очень не любит учиться и, из-за своего не знания, часто влипает в разные истории.

  • Незнайка обладает веснушками и огненно-рыжими, торчащими во все стороны волосами.
  • На голове его голубая широкополая шляпа, кроме того он носит рубашку оранжевого цвета, ярко-желтые брюки, зеленый галстук и коричневые башмаки.
  • Незнайка смелый и сообразительный оптимист, при этом не обладает знаниями и любит хвастаться.

2. Раскраска Знайка.

Один из центральных персонажей мультфильма – Знайка – ученый и большой авторитет среди других жителей Цветочного города.

  • Про Знайку можно сказать так: умен, любознателен, много читает, является полной противоположностью Незнайки.
  • Он носит очки, черный костюм и галстук.

3. Раскраска Пилюлькин.

В Цветочном городе Пилюлькин работает доктором.

  • Как и все врачи, Пилюлькин носит белый халат, на голове его красуется белая шапочка с красным крестом, а с собой он носит свой врачебный чемоданчик.
  • Однако, в отличие от других , лечит Пилюлькин своеобразно – в его рецептах присутствуют только касторка и йод – и это на все случаи жизни.

4. Раскраска Винтик и Шпунтик.

Братья Винтик и Шпунтик – мастера на все руки, также проживающие в Цветочном городе.

  • Братья всегда появляются в книге вместе, никогда не разлучаются и всегда что-нибудь изобретают.
  • Винтик и Шпунтик умеют все на свете – они и механики, и слесари, и электрики, и плотники.

Кроме перечисленных коротышек, среди раскрасок про Незнайку есть еще много персонажей: художник Тюбик, любитель сладких напитков Сиропчик, композитор Гусля, малышки Синеглазка и Белочка, поэт Цветик и другие.


В одном сказочном городе жили коротышки…В городе у них было очень красиво. Вокруг каждого дома росли цветы: маргаритки, ромашки, одуванчики. Там даже улицы назывались именами цветов: улица Колокольчиков, аллея Ромашек, бульвар Васильков. А сам город назывался Цветочным городом.

В одном домике на улице Колокольчиков жило шестнадцать малышей-коротышей…Знайка…доктор Пилюлькин…Винтик со своим помощником Шпунтиком…Сиропчик…охотник Пулька. У него была маленькая собачка Булька…Жил художник Тюбик, музыкант Гусля и другие малыши: Торопыжка, Ворчун, Молчун, Пончик, Растеряйка, два брата — Авоська и Небоська. Но самым известным среди них был малыш, по имени Незнайка…

Братцы, спасайся! Кусок летит!
— Какой кусок? — спрашивают его.
— Кусок, братцы! От солнца оторвался кусок. Скоро шлепнется — и всем будет крышка. Знаете, какое солнце? Оно больше всей нашей Земли!

Гусля дал ему большую медную трубу. Незнайка как подует в нее, труба как заревет!
— Вот это хороший инструмент! — обрадовался Незнайка. — Громко играет!

Нет, это плохой портрет, — сказал Гунька. — Дай я его порву.
— Зачем же уничтожать художественное произведение? — ответил Незнайка. Гунька хотел отнять у него портрет, и они принялись драться. На шум прибежали Знайка, доктор Пилюлькин и остальные малыши.

Однажды Незнайка пришел к Цветику и сказал:
— Слушай, Цветик, научи меня сочинять стихи. Я тоже хочу быть поэтом.
— А у тебя способности есть? — спросил Цветик.
— Конечно, есть. Я очень способный, — ответил Незнайка.

Незнайка испугался, хотел остановить машину и потянул какой-то рычаг. Но машина, вместо того чтобы остановиться, поехала еще быстрей. На дороге попалась беседка. Трах-та-ра-рах! Беседка рассыпалась на кусочки. Незнайку с ног до головы забросало щепками.

Шар между тем поднимался все выше и выше…Стекляшкин забрался на крышу дома и стал смотреть на это пятнышко в свою трубу. Рядом с ним на самом краю крыши стоял поэт Цветик…

В это время корзина с силой ударилась о землю и перевернулась. Авоська схватился руками за Небоську, а Небоська — за Авоську, и они вместе вывалились из корзины. За ними, как горох, посыпались остальные коротышки…
Воздушное путешествие окончилось.

Синеглазка сняла со стены полотенце и протянула Незнайке. Незнайка повозил полотенцем по лицу и только после этого решился открыть глаза.

А у нас был малыш, по имени Знайка. Трусишка такой! Он увидел, что шар падает, и давай плакать, а потом как сиганет вниз с парашютом — и пошел домой. Шар сразу стал легче и опять вверх полетел. Потом вдруг опять полетит вниз, да как хватит о землю, да как подскочит, да снова как хватит… Я вывалился из корзины — тррах головой о землю!..

Ворчун с удивлением взглянул на него:
— Незнайка!
…Он уцепился за рукав Незнайки и не хотел его выпускать.

Это восьмиколесный паровой автомобиль с фисташковым охлаждением, — объяснил Шурупчик.

Через несколько минут черенок был перепилен и яблоко повисло на веревке. Винтик велел Бублику подогнать машину прямо под висящее яблоко. Малышки начали постепенно отпускать веревку. Яблоко опустилось прямо в кузов машины. Веревку отвязали, и машина повезла яблоко к дому.

Зачем же письмо? — растерянно пробормотал он. — Мы ведь недалеко живем. Можно и так поговорить.
— Ах, какой вы скучный, Незнайка! Вы ничего не хотите для меня сделать. Ведь это так интересно — письмо получить!
— Ну хорошо, — согласился Незнайка. — Я напишу письмо.

Незнайка часто сажал кляксы в тетради. И к тому же как только посадит кляксу, так сейчас же слизнет ее языком. От этого кляксы у него получались с длинными хвостами. Такие хвостатые кляксы Незнайка называл кометами. Эти «кометы» были у него чуть ли не на каждой страничке. Но Незнайка не унывал, так как знал, что терпение и труд помогут ему избавиться и от «комет».

Колориметрический вестерн-блоттинг

Колориметрическое обнаружение — это экономичный и простой метод обнаружения аналита при вестерн-блоттинге. Ферментные репортеры, конъюгированные со вторичными антителами, реагируют с хромогенным субстратом, генерируя визуально определяемый сигнал, таким образом идентифицируя присутствие интересующего белка непосредственно на блоттинговой мембране.

Вестерн-блоттинг с колориметрическим детектированием использует вторичное антитело, конъюгированное с репортерной молекулой фермента, которое катализирует превращение растворимого хромогенного субстрата в окрашенный нерастворимый продукт.Этот продукт осаждается на мембране для блоттинга, образуя цветные полосы, которые можно увидеть невооруженным глазом, идентифицируя интересующий белок. Колориметрическое обнаружение сигнала — полезный метод для общего лабораторного использования с низкими затратами на установку, поскольку для визуализации сигнала не требуется специального оборудования.

Рисунок 1: Косвенное колориметрическое обнаружение. A. Конъюгированное с ферментом вторичное антитело связывается с первичным антителом в интересующем белке. B. Субстрат добавлен к комплексу антитело-антиген.C. Фермент реагирует с субстратом, образуя детектируемый окрашенный продукт.

Проявление блоттинга просто: мембрану инкубируют с хромогенным субстратом до тех пор, пока не разовьется требуемый уровень сигнала, затем субстрат просто смывают. Это останавливает ферментативную реакцию и останавливает дальнейшее развитие блота. Колориметрическое обнаружение выполняется легко и быстро, предлагая большую гибкость для оптимизации по сравнению с хемилюминесцентными или флуоресцентными системами.Однако иммобилизованный осадок не поддается удалению и повторному зондированию мембраны, что делает ненадежным многократное зондирование с дополнительными антителами.

Колориметрический вестерн-блоттинг может иметь высокую чувствительность, но продолжительная инкубация приводит к усилению фонового сигнала, который может скрыть сигнал от интересующего белка. Следовательно, колориметрическое определение может не подходить для белков с низким содержанием. Однако, когда известно, что белка много или метод оптимизирован, простота и низкая стоимость делают колориметрическое обнаружение привлекательным.Существует множество доступных субстратов, которые производят различные цветные осадки, каждая из которых обладает разной чувствительностью.

Рисунок 2: Колориметрический вестерн-блоттинг. Тяжелые (HC 50 кДа) и легкие (LC 25 кДа) цепи восстановленного и SDS-денатурированного мышиного IgG были разделены с помощью SDS-PAGE и обнаружены на вестерн-блотах с использованием пероксидазы-козьего антимышиного IgG (H + L) и визуализированы с помощью TMB хромогенный субстрат.



Артикул:

Альбертс Б. и др. (1994) Молекулярная биология клетки.3-е изд. Пресс для гирлянды. Лондон

Калюжный А (2016) Иммуногистохимия — важные элементы и не только. Издательство Springer International, Швейцария.

Roitt et al (2005) Immunology. 6-е изд. Мосби. Испания

методов обнаружения | ЛСР | Bio-Rad

ru-ruLUSQ6KKG4Методы обнаруженияМетоды обнаружения / webroot / web / html / lsr / solutions / technologies / western_blotting

В этом разделе представлен обзор различных методов обнаружения, используемых для визуализации белки после иммунодетекции.Теория, лежащая в основе нескольких широко используемых вестерн-блоттингов методы обнаружения, такие как колориметрические, хемилюминесцентные и флуоресцентные методы, и другие менее распространенные методы, такие как хемофлуоресценция, авторадиография и иммунозолото. методы маркировки выделены ниже.

Связанные темы : Антитело Отбор и разбавление , Удаление и Reprobing Membranes и Western Блоттинг .

Обнаружение белков

Связанные с мембраной белки обычно обнаруживаются с помощью вторичных антител, которые помечены радиоизотопами или коллоидным золотом или конъюгированы с флуоресцентными молекулы (флуорофоры) или фермент, такой как щелочная фосфатаза (AP) или хрен пероксидаза (HRP). В ранних системах блоттинга использовались реагенты с меткой 125 , аналогичные к тем, которые используются в радиоиммуноанализах.Эти системы обеспечивают чувствительные результаты, но особые проблемы обращения с реагентами 125 I и их утилизации не позволяют продолжали использовать эту технику. С тех пор ряд ферментных систем и детекторов реагенты эволюционировали.

Механизм обнаружения химического состава. В каждом методе детекции вестерн-блоттинга, детектируемый сигнал генерируется после связывания антитело, специфичное для интересующего белка. При колориметрическом обнаружении ( A ) сигнал — цветной осадок. В хемилюминесценции ( B ) сама реакция излучает свет.При обнаружении флуоресценции ( C ) антитело помечен флуорофором.

В наиболее распространенных методах обнаружения используются вторичные антитела, конъюгированные с AP или HRP. В этих методах при добавлении ферментного субстрата либо окрашенный осадок наносится на блот (колориметрическое определение), хемилюминесцентный или флуоресцентный продукт формируется, и световой сигнал фиксируется на пленке или с помощью цифрового изображения систему (см. рисунок выше).Вторичные антитела, конъюгированные с флуорофорами, набирают популярность и может быть непосредственно визуализирована и захвачена совместимым тепловизором, без необходимость в дополнительном жидком субстрате (см. Флуоресценция Обнаружение ).

Колориметрическое обнаружение

Колориметрические системы HRP
Системы HRP имеют преимущество перед другие системы обнаружения, в которых как ферментный конъюгат, так и колориметрическое обнаружение субстраты экономичны.Наиболее распространенными субстратами для колориметрической пероксидазы пероксидазы являются 4-хлор-1-нафтол. (4CN) (Hawkes et al. 1982) и 3,3′-диаминобензидин (DAB) (Tsang et al. 1985) (см. рисунок ниже). Снижены некоторые ограничения колориметрических систем обнаружения HRP. чувствительность по сравнению с колориметрическими системами обнаружения AP, исчезновение пятен при воздействие света, ингибирование активности HRP азидом и неспецифическое цветное осаждение.

Ферменты, такие как AP и HRP, превращают несколько субстратов в окрашенный осадок. (см. таблицу ниже). Поскольку осадок накапливается на пятне, появляется цветной сигнал, который легко увидеть на пятне. Ферментативный реакция может быть отслежена и остановлена ​​при достижении желаемого сигнала над фоном. Колориметрическое обнаружение проще в использовании, чем методы обнаружения на основе пленки, которые требуют метод проб и ошибок при определении подходящего времени воздействия и использование дорогостоящих материалов такие как рентгеновская пленка и химикаты для фотолаборатории.Колориметрическое обнаружение считается метод средней чувствительности по сравнению с радиоактивным или хемилюминесцентным детектированием.

Параметры колориметрического обнаружения с помощью HRP

Параметры колориметрического обнаружения с помощью HRP. DAB и 4CN — это обычно используемые хромогенные субстраты для HRP. В присутствии H 2 O 2 , HRP катализирует окисление субстрата до продукта, который виден на блоте. Слева реакция с DAB; правильно, реакция с 4CN.

Колориметрические системы AP

В колориметрических системах AP используется растворимый 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP). и нитросиний тетразолий (NBT) в качестве субстратов для получения стабильного продукта реакции которые не исчезнут (см. рисунок ниже).AP может быть легко деактивирован воздействием кислые растворы. Множественное зондирование одной и той же мембраны альтернативным антителом датчики могут быть выполнены с использованием подложек разного цвета, например, синего и красный (Блейк и др. 1984, Тернер 1983, Куриен и Скофилд 2003).

Колориметрическая проявка AP

Колориметрическая проявка AP. В колориметрической система AP катализирует субстраты BCIP и NBT с образованием окрашенного осадка. визуализация белка на вестерн-блоте. Сначала дефосфорилирование BCIP с помощью AP происходит, давая промежуточное соединение бромхлориндоксила. Затем индоксил окисляется. с помощью NBT для получения индигоидного красителя (пурпурный осадок).НБТ также снижается на индоксил, раскрывающий тетразольное кольцо с образованием нерастворимого диформазана (синий осадок). Комбинация индигоидного красителя BCIP и нерастворимого формазана NBT образует осадок пурпурно-синего цвета.

Колориметрические и хемилюминесцентные кляксы

Колориметрические и хемилюминесцентные блоты. Разведение слитого белка GST иммунодетектировали с использованием моноклональных антител, специфичных к GST, за которым следует A , вторичное антитело, конъюгированное с AP, и BCIP / NBT. субстрат для колориметрического обнаружения, или B , вторичный конъюгированный с HRP антитела и Immun-Star & trade; WesternC и торговля; хемилюминесцентный субстрат для хемилюминесценции обнаружение.

Колориметрические системы обнаружения

Обнаружение Метод Подложка Обнаружение Чувствительность Сигнал Цвет Продукт Параметры Преимущества
Обнаружение и подложка
Иммуноблоттинг Наборы для анализа Наборы Сухой Порошок
Колориметрический HRP 4CN 500 стр. Фиолетовый X X X Быстрое проявление цвета, низкая стоимость, низкая фоновая активность ферментов
Колориметрический HRP DAB 500 стр. Коричневый & nbsp; & nbsp; X Нерастворимый продукт, легко образующий хелат с четырехокиси осмия.Чувствительность может быть усилен добавлением металлов
Колориметрический HRP Opti-4CN & trade; 100 стр. Фиолетовый X & nbsp; & nbsp; Высокая чувствительность, немеркнущий цвет, низкий фон
Колориметрический HRP Opti-4CN с усилением 5 стр. Фиолетовый X & nbsp; & nbsp; Наилучшая доступная чувствительность & mdash; равный хемилюминесценции; Комплект предоставляет все необходимые компоненты
Колориметрическая точка доступа BCIP / NBT 100 стр. Фиолетовый X X X Высокая чувствительность

Предварительно смешанный индивидуальный колориметрический субстрат
Предварительно смешанный наборы ферментных субстратов и реактивы для проявления, в том числе порошковые 4CN и DAB красители реагенты проявки, также доступны.Готовые наборы удобны и надежны, и они снижают воздействие опасных реагентов, используемых для окрашивания белков. кляксы.

Иммуноблот & reg; Наборы для анализа
Иммун-Блот наборы для анализа содержат реагенты, необходимые для стандартной колориметрии HRP / 4CN или AP. обнаружение на вестерн-блоттинге с дополнительным удобством предварительно смешанных буферов и ферментов подложки.Кроме того, эти наборы содержат вторичные антитела, конъюгированные с HRP или AP. Все компоненты набора проходят индивидуальную проверку качества при применении блоттинга. В каждый комплект входит инструкция по эксплуатации с тщательно протестированным протоколом и руководство по поиску и устранению неисправностей, которое упрощает иммунологическое выявление.

Opti-4CN & trade; и усиленный Opti-4CN субстрат и комплекты обнаружения
Колориметрическое обнаружение HRP с 4CN уже предлагает очень низкий фон и обнаружение чувствительность около
500 пг антигена. Opti-4CN от Bio-Rad kit увеличивает эту чувствительность обнаружения до 100 пг. Opti-4CN доступен как предварительно смешанный набор субстратов или в сочетании с антителом, конъюгированным с HRP, при обнаружении комплект.

усиленный Субстрат Opti-4CN и наборы для обнаружения основаны на запатентованной HRP-активируемой амплификации. реагенты от Bio-Rad.Эти наборы позволяют колориметрическое обнаружение до 5 пг, сопоставление или даже превышающая чувствительность, достигаемую радиометрической и некоторой хемилюминесценцией системы, но без затрат или времени, затрачиваемых на разработку блотов в темной комнате.

Обнаружение хемилюминесценции

Хемилюминесценция возникает, когда химический субстрат катализируется ферментом, например как AP или HRP, и производит свет как побочный продукт [см. рисунки выше].Световой сигнал могут быть захвачены на рентгеновской пленке или с помощью устройства формирования изображения с зарядовой связью (ПЗС), такого как Система ChemiDoc XRS + и ChemiDoc MP System . Эта технология легко адаптируется к существующим процедурам вестерн-блоттинга, поскольку хемилюминесценция использует конъюгированные с ферментом антитела для активации светового сигнала.Методы блокировки и промывки знакомы.

Преимущества хемилюминесцентного вестерн-блоттинга по сравнению с другими методами — скорость и чувствительность (см. таблицу ниже). Этот метод идеален для ПЗС-изображений, для которых типичное время экспозиции блотов составляет от 5 секунд до 5 минут, в зависимости от от чувствительности субстрата. Это большое улучшение по сравнению с 125 I системы, которым может потребоваться до 48 часов для экспонирования пленки.Обнаружение протеина вниз к суммам фемтограмм возможно с этими системами. Это более чувствительно, чем большинство колориметрические системы и сопоставимы с радиоизотопным детектированием. Чувствительность обнаружения зависит от аффинности белка, первичного антитела, вторичного антитела и Субстрат HRP и может варьироваться от образца к образцу.

Системы обнаружения хемилюминесценции

Метод обнаружения Подложка Чувствительность обнаружения Параметры продукта Преимущества Недостатки
Хемилюминесцентный HRP
Immun-Star HRP Люминол 1 & ndash; 3 стр. Конъюгаты Короткая (30 секунд) выдержка Азид подавляет активность ферментов
& nbsp; & nbsp; субстрат HRP Продолжительность сигнала 6 & ndash; 8 часов & nbsp;
& nbsp; & nbsp; Наборы для иммуноблоттинга Совместим с ПВДФ и нитроцеллюлозой
Рабочий раствор стабильный в течение 24 часов при комнатной температуре
Immun-Star WesternC Люминол Фемтограмма Конъюгаты Продолжительность сигнала до
24 часов
Азид подавляет активность ферментов
Оптимизирован для устройств формирования изображений ПЗС
Высокая чувствительность
Хемилюминесцентный AP
AP Immun-Star CDP- звездочка 10 стр. Конъюгаты Время воздействия от 30 секунд до 5 минут Эндогенная фосфатаза активность может привести к ложным срабатываниям
Подложка AP Продолжительность сигнала до
24 часов
Наборы для иммуноблоттинга Блот можно активировать повторно

Безопасность — еще одно преимущество хемилюминесцентного обнаружения.У него нет проблемы безопасности, связанные с обнаружением изотопов, такие как воздействие на персонал радиация, высокие затраты и экологические проблемы.

Иммун-Стар и трейд; Наборы для хемилюминесценции
Наборы Immun-Star включают субстрат CDP-Star (активируется AP) или люминол (активируется HRP) и производят сильный сигнал как на нитроцеллюлозе, так и на ПВДФ.Световой сигнал генерируется с наборами Immun-Star не только обеспечивает быстрое воздействие, но и длится столько же, сколько и 24 часа ( Immun-Star & trade; AP Kits ) после первоначальной активации блота.Эти кляксы можно реагировать с помощью свежий субстрат, даже через несколько недель после исчезновения сигнала. Их также можно раздеть и переодевались несколько раз.

Набор для хемилюминесценции Immun-Star WesternC разработан для использования с Точность Плюс протеин и торговля; WesternC и торговля; стандарты и системы визуализации ПЗС.Это предлагает чувствительность на уровне фемтограмм и совместимость с любыми антителами, конъюгированными с HRP (см. Рисунок ниже). Обеспечивается сильная интенсивность сигнала, оптимизированная для визуализации на ПЗС-матрице.

Обнаружение антигена и стандартов Precision Plus Protein WesternC

Обнаружение антигена и точность Стандарты Plus Protein WesternC с использованием хемилюминесцентного детектора Immun-Star WesternC комплект .Белки и 5 мкл белковых стандартов (дорожка 1) и серия разведений из E. coli клеточный лизат (дорожки 2 & ndash; 6) подвергали электрофорезу на 4 & ndash; 20% Критерий и торговля; гель и перенесен на нитроцеллюлозную мембрану. Блот зондировали с антителом, специфичным для слитых белков GST, за которым следует вторичный конъюгированный с HRP антитело и конъюгат StrepTactin-HRP.После 5-минутной инкубации в Immun-Star Решение для обнаружения WesternC, блот визуализировали на тепловизоре ChemiDoc XRS + в течение 5 секунд.

Обнаружение флуоресценции

При обнаружении флуоресценции первичное или вторичное антитело, меченное флуорофором. используется при иммунодетекции.Источник света возбуждает флуорофор и излучаемый флуоресцентный сигнал фиксируется камерой для получения окончательного изображения. Во флуоресценции фотон высокой энергии (hv ex ) возбуждает флуорофор, заставляя его уйти основное состояние (S 0 ) и перейти в состояние с более высокой энергией (S ‘ 1 ). Часть этой энергии рассеивается, позволяя флуорофору войти в расслабленное возбужденное состояние. состояние (S 1 ).Излучается фотон света (hv ex ), возвращающий флуорофор в основное состояние. Испускаемый фотон имеет более низкую энергию (большую длину волны) из-за рассеивания энергии в возбужденном состоянии.

Обнаружение флуоресценции

При использовании детектирования флуоресценции учитывайте следующие оптические характеристики. флуорофоров для оптимизации сигнала:

  • Квантовый выход — эффективность испускания фотонов после поглощения. фотона.Процессы, которые возвращают флуорофор в основное состояние, но не в результате испускания флуоресцентного фотона снижается квантовый выход. Флуорофоры с более высоким квантовым выходом, как правило, ярче
  • Коэффициент экстинкции — показатель того, насколько хорошо флуорофор поглощает свет определенной длины волны. Поскольку поглощение зависит от длины пути и концентрации (закон Бера) коэффициент экстинкции обычно выражается в см -1 M -1 .& nbsp; Как и в случае с квантовым выходом, флуорофоры с более высокими коэффициентами экстинкции являются обычно ярче
  • Стоксов сдвиг — разница в максимальном возбуждении и длины волн излучения флуорофора. Поскольку некоторая энергия рассеивается, пока флуорофор находится в возбужденном состоянии, испускаемые фотоны имеют меньшую энергию (большую длину волны), чем свет, используемый для возбуждения.Большие стоксовы сдвиги минимизируют перекрытие между возбуждением и длины волн излучения, увеличивающие детектируемый сигнал
  • Спектры возбуждения и испускания & mdash; спектры возбуждения графики интенсивности флуоресценции флуорофора в диапазоне возбуждения длины волн; Спектры излучения показывают длины волн излучения флуоресцирующей молекулы.Выберите флуорофоры, которые могут возбуждаться источником света в тепловизоре и которые имеют спектры излучения, которые могут быть зафиксированы прибором. При выполнении мультиплексного Вестерны, выбирайте флуорофоры с минимально перекрывающимися спектрами, чтобы избежать канала перекрестные помехи

Спектры возбуждения и излучения

Несколько флуорофоров, охватывающих широкий диапазон длин волн возбуждения и излучения. теперь доступны, в том числе на основе органических красителей (например, цианина и флуоресцеин), нанокристаллы полупроводникового материала и естественно флуоресцентные белки (например, фикобилипротеины, такие как фикоэритрин и аллофикоцианин).

Обнаружение флуоресценции (см. рисунок ниже) имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методы:

  • Мультиплексирование — использование нескольких и разноцветных флуорофоры для одновременного обнаружения нескольких белков-мишеней на одном блоте. При обнаружении нескольких белков с помощью флуоресцентного мультиплексного вестерн-блоттинга убедитесь, что флуоресцентные сигналы, генерируемые для каждого белка, можно дифференцировать.Использовать первичный антитела от разных видов хозяев (например, мыши и кролика) и вторичные антитела, которые перекрестно абсорбируются против других видов, чтобы избежать перекрестной реактивности. Используйте флуорофоры, конъюгированные со вторичными антителами с различными спектрами, чтобы они можно оптически отличать друг от друга, чтобы избежать перекрестной флуоресценции.
  • Динамический диапазон — в 10 раз больший динамический диапазон по сравнению с хемилюминесценцией. обнаружение и, следовательно, лучшая линейность в пределах обнаружения
  • Стабильность & mdash; многие флуоресцентные молекулы стабильны в течение длительный период времени, позволяющий хранить кляксы для последующего повторного отображения & ndash; часто спустя недели или месяцы & ndash; без значительной потери сигнала.Наибольшая флуоресценция методы также совместимы с протоколами снятия изоляции и повторного зондирования при условии, что Блоты не должны высыхать между последовательными раундами обнаружения вестерн-блоттинга.

& nbsp;

Мультиплексное обнаружение флуоресценции

Обнаружение мультиплексной флуоресценции серии двукратных разведений двух белков, GST (красный) и ингибитора трипсина сои (зеленый). Начальная концентрация составляла 500 нг каждого белка. Точность Плюс Белок и торговля; WesternC и торговля; стандарты использовались в качестве маркеров.

Другие методы обнаружения

Биолюминесценция
Биолюминесценция — это естественное излучение света. многими организмами.Биолюминесцентные системы различаются по строению и функциям ферменты и кофакторы, участвующие в процессе, а также механизм генерации света реакции. Биолюминесценция также используется как метод обнаружения белков и нуклеиновых кислот. кислоты на мембране.

Обнаружение биолюминесценции включает инкубацию мембраны (со связанным антиген-антитело-фермент комплекс) в биолюминогенном субстрате и одновременное измерение излучаемого света (см. рисунок ниже).Субстрат, участвующий в этом обнаружении система представляет собой производное на основе люциферина. Детектирование света осуществляется с помощью подсчета фотонов. камера и промокшие белки визуализируются в виде ярких пятен. Эта техника похожа на хемилюминесценцию по своей чувствительности и скорости обнаружения, но широко не используются, и некоторые биолюминогенные субстраты коммерчески доступны. ПВДФ является предпочтительной мембраной для обнаружения биолюминесценции, поскольку нитроцеллюлозные мембраны могут содержать вещества, подавляющие активность люциферазы.

Хемифлуоресценция
Хемифлуоресценция — это ферментативное превращение подложки к флуоресцентному продукту (см. рисунок ниже). Флуорогенные соединения (нефлуоресцентные или слабо флуоресцентные вещества, которые могут быть преобразованы в флуоресцентные продукты) доступны для использования с широким спектром ферментов, включая AP и HRP.Фермент отщепляет фосфатную группу от флуорогенного субстрата. чтобы получить высоко флуоресцентный продукт. Флуоресценцию можно обнаружить с помощью флуоресценции. имидж-сканер, такой как PharosFX System или ChemiDoc Система МП . Хемифлуоресценция обеспечивает стабильный флуоресцентный продукт реакции, поэтому пятна можно сканировать позже. Этот метод также совместим со стандартными процедуры зачистки и повторного зондирования.

Авторадиография
Гамма-излучающий радиоизотоп 125 I может использоваться для маркировки лизинов в иммуноглобулинах для радиометрического обнаружения антигенов (см. рисунок ниже). Прямое иммунологическое обнаружение (с использованием меченые вторичные антитела) всего 1 мкг точечного иммуноглобулина с высокой удельной активностью 125 I. зонды.Помеченные радиоактивным изотопом пятна могут быть обнаружены используя рентгеновскую пленку, метод, известный как авторадиография. Из-за связанных опасностей с радиоактивно меченными конъюгатами популярность авторадиографии снижается в пользу колориметрических и хемилюминесцентных методов.

Маркировка иммунным золотом
В методах обнаружения иммунного золота используются меченные золотом вторичные антитела для обнаружения антигена.Поскольку этот метод имеет относительно низкая чувствительность и непостоянный сигнал, методы усиления серебра аналогичны к описанным для окрашивания общего белка коллоидного золота были разработаны как средство усиления сигнала (см. рисунок ниже). При использовании серебра фон создается на блот и чувствительность увеличиваются в 10 раз, что эквивалентно колориметрическому обнаружению AP и в несколько раз более чувствительна, чем авторадиография.

Механизм обнаружения химии

Механизм обнаружения химического состава. При обнаружении биолюминесценции ( A ) сама ферментативная реакция испускает свет, в то время как в хемофлуоресценции ( B ) продукт реакции флуоресцентный.При авторадиографии ( C ) само вторичное антитело несет радиоактивную метку, а в маркировке иммунозолота ( D ) вторичные антитела помечены золотом, а сигнал усиливается осаждением серебра.

Ссылки

Байер Э.А. и Вильчек М. (1980). Использование авидин-биотинового комплекса в качестве инструмента молекулярная биология.Методы Biochem Anal 26, 1 & ndash; 45.

Блейк М.С. и др. (1984). Быстрый и чувствительный метод обнаружения конъюгированной щелочной фосфатазой анти-антитела на Вестерн-блоттинге. Anal Biochem 136, 175 & ndash; 179.

Чайет Л. и Вольф Ф. Дж. (1964). Свойства стрептавидина, биотин-связывающего белка производится Streptomyces. Arch Biochem Biophys 106, 1 & ndash; 5.

Гесдон Дж. Л. и др.(1979). Использование авидин-биотинового взаимодействия в иммуноферментных техники. J Histochem Cytochem 27, 1131 & ndash; 1139.

Хоукс Р. и др. (1982). Анализ точечного иммунного связывания для моноклональных и других антител. Anal Biochem 119, 142 & ndash; 147.

Хсу С.М. и др. (1981). Использование комплекса авидин-биотин-пероксидаза (ABC) в иммунопероксидазе методы: сравнение процедур ABC и немеченых антител (PAP).J Histochem Cytochem 29, 577 & ndash; 580.

Куриен Б.Т. и Скофилд Р.Х. (2003 г.). Белковый блоттинг: обзор. J Immunol методы 274, 1 & ndash; 15.

Цанг В.К. и др. (1985). Иммуноэлектротрансферный блот с ферментом (EITB). В ферментно-опосредованном Иммуноанализ. T.T. Ngo и H.M. Ленхофф, ред. (Нью-Йорк: Plenum Press), стр. 389 & ndash; 414.

Протоколы
Число Описание Параметры
6216 Состав буфера для обнаружения Нажмите, чтобы загрузить
6218 Удаление пятен & amp; Репробирование Нажмите, чтобы загрузить
6219 Иммунодетекция Нажмите, чтобы загрузить
5881 Расширенный мультиплексный флуоресцентный вестерн-блоттинг, ред. A5881 / webroot / web / pdf / lsr / Lithuania / Bulletin_5881.pdfLiteraturePDFApplication_Notes / webroot / web / images / general / icons / icon_pdf.gifNo5881, детектирование белков на основе флуоресценции, обнаружение белков на основе флуоресценции на кляксах, система визуализации Molecular Imager VersaDoc MP, системы визуализации, техническая записка, бюллетень 5881, Rockland Immunochemicals, одновременное зондирование, иммуноблот, иммуноблоттинг, Программное обеспечение для одномерного анализа Quantity One, флуорофор, флуорофор, возбуждение, 170-9600, 1709600, 170-8640, 1708640, 170-8650, 1708650 2895 Руководство по блоттингу белков, версия C2895 / webroot / web / pdf / lsr / Literate / Bulletin_2895.pdfLiteraturePDFOther / webroot / web / images / general / icons / icon_pdf.gifРуководство по белковому блоттингуNoProtein Blotting Guide, Ver C2895 Bulletin 2895, пероксидаза хрена (HRP), комплекс фермент-антитело, щелочная фосфатаза (AP), таблетки нитросинего тетразолия (NBT), BCIP, вторичный датчик антител, амидочерный, стрептавидин-биотин, анионный краситель, пятно для блоттинга общего белка, нитроцеллюлоза, подложка нитроцеллюлоза или поливинилидендифторид (ПВДФ) или низкофлуоресцентные мембраны ПВДФ LF, антитело, иммуноглобулин (IgG), антиген, анализ, авидин, биотин, фон, неспецифический шум, буфер Бьеррума Шафера-Нильсена, блокирующий реагент, вестерн-блоттинг, BLOTTO, хемилюминесценция, коллоидное золото, реагент для проявления цвета, колориметрическое обнаружение, хемилюминесцентное обнаружение, конъюгат фермент-антитело, краситель кумасси синий, диаминобензидин (DAB), дот-блот, буфер Данна, электрофоретический блоттинг, поролоновые подушечки, фильтровальная бумага, желатин, высокоинтенсивный перенос, иммуноанализ, иммуноблоттинг, иммунодетекция, лиганд, мембрана, сэндвичи с мембраной / фильтровальной бумагой, микрофильтрация, блоттинг, мультиплексирование, мультиэкран аппарат, нативный PAGE, электрофорез в полиакриламидном геле, NHS-биотин, неферментативный зонд, неферментативный зонд, обезжиренное сухое молоко, неспецифическое связывание, фикобилипротеин, источник питания, первичные антитела, предварительно окрашенные стандарты, маркеры молекулярной массы или лестницы, протеин A, протеин G, быстрый полусухой блоттинг, SDS-PAGE, додецилсульфат натрия, додецилсульфат натрия, отношение сигнал / шум, отношение сигнал / шум, Без пятен технология, ПЗС-сканер, устройство с зарядовой связью, StrepTactin, последовательность Strep-tag, субстрат, змеевик суперохлаждения, промокание в баке, буфер Towbin, Tween 20 3179 Флуоресцентные наночастицы для вестерн-блоттинга, Ред. A3179 / webroot / web / pdf / lsr /rature / Bulletin_3179.pdfLiteraturePDFBrochures_and_Specifications / webroot / web / images / general / icons / icon_pdf.gif Нет флуоресцентных наночастиц для вестерн-блоттинга, Rev A3179detection, иммунный, мультиплексный, qd, 1708640, антитела, точка, LIT3179, мультиплексирование, чувствительность, 170-8640, 1709450, иммунная звезда, флуоресценция, иммунная звезда, иммунная звезда, маркированная, мультиплекс, наночастица, pharos fx, q, 1708650, дот-блоты, сравнение, конъюгаты, молекулярный имидж-сканер, система pharosfx, qd-метка, квантовая точка, наоборот, 170-8650, блот, конъюгат, дот-блот, qdot, 170-9450, блоты, визуализация, этикетка, наночастицы, наночастицы, q-точка сопряжена, версадок 4000 5809 Получение изображений хемилюминесцентных вестерн-блотов: сравнение цифровых изображений и рентгеновских лучей Фильм, Rev A 5809 / webroot / web / pdf / lsr / Lithuania / Bulletin_5809.pdfLiteraturePDFApplication_Notes / webroot / web / images / general / icons / icon_pdf.gifNo Изображение хемилюминесцентных вестерн-блотов: сравнение цифровых изображений и рентгеновских снимков Фильм, Rev A 5809Блоттинг, камеры устройств с зарядовой связью, динамический диапазон, LIT5809, Molecular Imager Система ChemiDoc XRS, интенсивность полосы, формирователи изображения, комплект Immun-Star WesternC, бюллетень 5809, Программное обеспечение для одномерного анализа Quantity One, обнаружение сигнала, техническая информация, хемилюминесценция, Системы VersaDoc MP 4000 и 5000, камера CCD, цифровой захват люминесцентных сигналов, Калиброванный денситометр GS-800, однократная экспозиция, визуализация блотов 5723 Увеличьте пропускную способность вестерн-блоттинга с помощью мультиплексной флуоресцентной детекции, Ред. B5723 / webroot / web / pdf / lsr /rature / Bulletin_5723.pdfLiteraturePDFApplication_Notes / webroot / web / images / general / icons / icon_pdf.gif Нет Увеличьте пропускную способность вестерн-блоттинга с помощью мультиплексной флуоресцентной детекции Rev B5723bulletin 2895, Criterion, Molecular Imager VersaDoc MP systems, руководство, на основе флуоресценции визуализация, несколько мишеней, стандарты Precision Plus Protein, флуоресценция, PharosFX система, RGB, Блоттинг, устройство с зарядовой связью, светодиод, гели ReadyGel, CCD, устранение неисправностей, WesternC стандартный, инструкция по применению, LIT5723, мембрана с низким уровнем флуоресценции, программное обеспечение Quantity One, красный зеленый и синее возбуждение Life Science Research / Продукция / Электрофорез и блоттинг / Электрофорез белков и блоттинг / вестерн-блоттинг / реагенты и наборы для иммунодетекции / иммуноблоттинг AP Chemistry Колориметрические наборы -> MT :: 3061b982-7f30-412c-b69d-179103a7e86c ## Life Science Research / Products / Electrophoresis и блоттинг / электрофорез и блоттинг белков / вестерн-блоттинг / иммунодетекция Реагенты и наборы / Колориметрические наборы Opti-4CN для иммуноблоттинга -> MT :: 274c03cb-afc8-4ff0-92d5-3838ef70d9db ## Life Science Research / Products / Электрофорез и блоттинг / электрофорез и блоттинг белков / вестерн-блоттинг / иммунодетекция Реагенты и наборы / Наборы для хемилюминесценции Immun-Star HRP -> MT :: e08909eb-3369-42ec-a585-df1868f ## Исследования в области естественных наук / Продукция / Электрофорез и блоттинг / электрофорез и блоттинг белков / вестерн-блоттинг / иммунодетекция Реагенты и наборы / Наборы для хемилюминесценции Immun-Star AP -> MT :: e08909eb-3369-42ec-a585-df1868f ## Эдди CD Методы обнаружения12.09.11 10:34 AM12.09.21 10:36 AMAE, AI, AL, AM, AR, AT, AU, AZ, BA, BD, BE, BF, BG, BH, BN, BO , BR, BW, CA, CH, CL, CM, CN, CO, CR, CY, CZ, DE, DK, DO, DZ, EC, EE, EG, EH, ER, ES, ET, FI, FM, FO , FR, GA, GE, GF, GH, GP, GR, GT, GU, HK, HN, HR, HT, HU, ID, IE, IL, IN, IS, IT, JM, JO, JP, KE, KH , KR, KW, KZ, LB, LI, LK, LT, LU, LV, MA, MD, MG, MK, ML, MO, MQ, MS, MT, MU, MX, MY, NG, NI, NL, NO , NP, NZ, OM, PA, PE, PF, PG, PH, PK, PL, PR, PS, PT, PW, PY, QA, RO, RS, RU, SA, SB, SE, SG, SI, SK , SN, ST, SV, TG, TH, TN, TO, TR, TT, TW, TZ, UA, UG, UK, US, UY, UZ, VA, VE, VU, XK, YE, ZA, VNenLSR / LSR / Технологии / Western_BlottingN0 Исследования в области биологии / Решения / Технологии / Двумерный электрофорез -> MTS :: LUSQG6LPT ## Life Science Research / Solutions / Technologies / Белковый электрофорез -> MTS :: LUSOVO47B ## Исследования в области биологии / Решения / Приложения / Разделение белков и Анализ / Быстрое разделение Перенос и анализ -> МТС :: LUSOUMFCN ## Исследования в области наук о жизни / Решения / Технологии / Двумерный электрофорез -> MTS :: LUSQG6LPT ## Life Science Research / Solutions / Technologies / Белковый электрофорез -> MTS :: LUSOVO47B ## Исследования в области биологии / Решения / Приложения / Разделение белков и Анализ / Быстрое разделение Перенос и анализ -> МТС :: LUSOUMFCN ## 0 Введение в Immunodetection / ru-ru / applications-technologies / detection-methods? ID = LUSQ4HE8Z

В этом разделе представлен обзор различных методов обнаружения, используемых для визуализации белков после иммунодетекции.Теория, лежащая в основе нескольких широко используемых методов обнаружения вестерн-блоттинга, таких как колориметрические, хемилюминесцентные и флуоресцентные методы, а также других менее распространенных методов, таких как хемифлуоресценция, авторадиография и методы мечения иммунным золотом, освещена ниже.

Связанные темы : Отбор и разведение антител, удаление и повторное зондирование мембран и вестерн-блоттинг.

Содержание страницы

Мембранные белки обычно обнаруживаются с помощью вторичных антител, меченных радиоизотопами или коллоидным золотом, или конъюгированных с флуоресцентными молекулами (флуорофорами) или ферментом, таким как щелочная фосфатаза (AP) или пероксидаза хрена (HRP).В ранних системах блоттинга использовались реагенты, меченные 125 I, аналогичные тем, которые используются в радиоиммуноанализах. Эти системы обеспечивают чувствительные результаты, но особые проблемы обращения с реагентами 125 I и их утилизации препятствуют дальнейшему использованию этого метода. С тех пор был разработан ряд ферментных систем и реагентов для обнаружения.

Механизм обнаружения химии. В каждом методе вестерн-блоттинга детектируемый сигнал генерируется после связывания антитела, специфичного для интересующего белка.При колориметрическом обнаружении ( A ) сигнал представляет собой окрашенный осадок. При хемилюминесценции ( B ) сама реакция излучает свет. При обнаружении флуоресценции ( C ) антитело метят флуорофором.

Наиболее распространенные методы обнаружения используют вторичные антитела, конъюгированные с AP или HRP. В этих методах, когда добавляется ферментный субстрат, либо окрашенный осадок осаждается на блоте (колориметрическое обнаружение), либо образуется хемилюминесцентный или флуоресцентный продукт, и световой сигнал фиксируется на пленке или с помощью системы цифрового изображения (см. Рисунок выше. ).Вторичные антитела, конъюгированные с флуорофорами, становятся все более популярными и могут быть непосредственно визуализированы и захвачены совместимым имидж-сканером без необходимости использования дополнительного жидкого субстрата (см. Определение флуоресценции).

Колориметрические системы HRP
Системы HRP имеют преимущество перед другими системами обнаружения в том, что как ферментный конъюгат, так и субстраты для колориметрического обнаружения являются экономичными. Наиболее распространенными субстратами для колориметрической HRP являются 4-хлор-1-нафтол (4CN) (Hawkes et al.1982) и 3,3′-диаминобензидин (DAB) (Tsang et al. 1985) (см. Рисунок ниже). Некоторыми ограничениями колориметрических систем обнаружения HRP являются пониженная чувствительность по сравнению с колориметрическими системами обнаружения AP, исчезновение пятен при воздействии света, ингибирование активности HRP азидом и неспецифическое окрашивание.

Ферменты, такие как AP и HRP, превращают несколько субстратов в окрашенный осадок (см. Таблицу ниже). По мере того, как осадок накапливается на пятне, появляется цветной сигнал, который легко виден глазом на пятне.Ферментативную реакцию можно отслеживать и останавливать, когда желаемый сигнал превышает фон. Колориметрическое обнаружение проще в использовании, чем методы обнаружения на основе пленки, которые требуют проб и ошибок при определении подходящего времени экспонирования и используют дорогостоящие материалы, такие как рентгеновская пленка и химические вещества для фотолаборатории. Колориметрическое обнаружение считается методом средней чувствительности по сравнению с радиоактивным или хемилюминесцентным обнаружением.

Варианты колориметрического обнаружения с HRP. DAB и 4CN являются обычно используемыми хромогенными субстратами для HRP. В присутствии H 2 O 2 HRP катализирует окисление субстрата в продукт, который виден на блоте. Слева реакция с DAB; справа, реакция с 4CN.

Колориметрические системы AP

Колориметрические системы AP используют растворимый 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP) и нитросиний тетразолий (NBT) в качестве субстратов для получения стабильного продукта реакции, который не тускнеет (см. Рисунок ниже).АП можно легко инактивировать воздействием кислых растворов. Множественное зондирование одной и той же мембраны с помощью альтернативных зондов антител можно проводить с использованием субстратов, которые производят разные цвета, такие как синий и красный (Blake et al. 1984, Turner 1983, Kurien and Scofield 2003).

Колориметрическая проявка AP. В колориметрической системе АР катализирует субстраты BCIP и NBT с образованием окрашенного осадка, визуализирующего белок на вестерн-блоттинге. Сначала происходит дефосфорилирование BCIP с помощью AP с образованием промежуточного бромхлориндоксила.Затем индоксил окисляется NBT с образованием индигоидного красителя (пурпурный осадок). NBT также восстанавливается индоксилом, раскрывая тетразольное кольцо с образованием нерастворимого диформазана (синий осадок). Комбинация индигоидного красителя BCIP и нерастворимого формазана NBT образует осадок пурпурно-синего цвета.

Колориметрические и хемилюминесцентные блоты. Разведение слитого белка GST было иммунодетектировано с использованием моноклонального антитела, специфичного к GST, за которым следовало A , AP-конъюгированное вторичное антитело и субстрат BCIP / NBT для колориметрического обнаружения, или B , вторичное антитело, конъюгированное с HRP, и Хемилюминесцентный субстрат Immun-Star ™ WesternC ™ для хемилюминесцентного обнаружения.

Колориметрические системы обнаружения

Обнаружение и подложка
Наборы для иммуноблоттинга Комплекты Сухой порошок
Колориметрический HRP 4CN 500 стр. фиолетовый Х Х Х Быстрое проявление цвета, низкая стоимость, низкая фоновая активность ферментов
Колориметрический HRP DAB 500 стр. Коричневый Х Нерастворимый продукт, легко образующий хелат с четырехокисью осмия.Чувствительность можно дополнительно повысить, добавив металлы
Колориметрический HRP Opti-4CN ™ 100 стр. фиолетовый Х Высокая чувствительность, немеркнущие цвета, низкий фон
Колориметрический HRP Opti-4CN с усилителем 5 стр. фиолетовый Х Наилучшая доступная чувствительность — равна хемилюминовой способности; комплект содержит все необходимые компоненты
Колориметрический AP BCIP / NBT 100 стр. фиолетовый Х Х Х Высокая чувствительность

Предварительно смешанный и индивидуальный колориметрический субстрат
Также доступны наборы предварительно смешанных ферментных субстратов и реактивы для проявления, включая порошковые реагенты для проявления цвета 4CN и DAB.Предварительно приготовленные наборы удобны и надежны, и они снижают воздействие опасных реагентов, используемых при окрашивании белковых блотов.

Наборы для иммуноблоттинга ® Наборы для анализа
Наборы для анализа для иммуноблоттинга содержат реагенты, необходимые для стандартного колориметрического определения HRP / 4CN или AP на вестерн-блоттинге с дополнительным удобством предварительно смешанных буферов и ферментных субстратов. Кроме того, эти наборы содержат вторичные антитела, конъюгированные с HRP или AP. Все компоненты набора проходят индивидуальную проверку качества при применении блоттинга.В каждый комплект входит инструкция по эксплуатации с тщательно протестированным протоколом и руководством по поиску и устранению неисправностей, упрощающее иммунологическое выявление.

Opti-4CN ™ и усиленный Opti-4CN субстрат и наборы для обнаружения
Колориметрическое обнаружение HRP с 4CN уже предлагает очень низкий фон и чувствительность обнаружения около
500 пг антигена. Комплект Opti-4CN от Bio-Rad повышает эту чувствительность обнаружения до 100 пг. Opti-4CN доступен в виде предварительно смешанного набора субстратов или в сочетании с антителом, конъюгированным с HRP, в наборе для обнаружения.

Амплифицированный субстрат Opti-4CN и наборы для обнаружения основаны на патентованных реактивах для амплификации, активируемых HRP, от Bio-Rad. Эти наборы позволяют колориметрическое обнаружение до 5 пг, что соответствует или даже превышает чувствительность, достигаемую с помощью радиометрических и некоторых хемилюминесцентных систем, но без затрат или времени, связанных с проявлением блотов в темной комнате.

Хемилюминесценция возникает, когда химический субстрат катализируется ферментом, таким как AP или HRP, и производит свет в качестве побочного продукта [см. Рисунки выше].Световой сигнал может быть записан на рентгеновскую пленку или с помощью устройства формирования изображения с зарядовой связью (CCD), такого как ChemiDoc XRS + System и ChemiDoc MP System. Эта технология легко адаптируется к существующим процедурам вестерн-блоттинга, поскольку хемилюминесценция использует конъюгированные с ферментом антитела для активации светового сигнала. Методы блокировки и промывки — знакомые процедуры.

Преимуществами хемилюминесцентного вестерн-блоттинга перед другими методами являются скорость и чувствительность (см. Таблицу ниже). Этот метод идеально подходит для получения изображений на ПЗС-матрице, время воздействия которых обычно составляет от 5 секунд до 5 минут, в зависимости от чувствительности подложки.Это большое улучшение по сравнению с системами 125 I, для экспонирования которых может потребоваться до 48 часов. С помощью этих систем возможно определение количества белка до фемтограмм. Это более чувствительно, чем большинство колориметрических систем, и сравнимо с радиоизотопным обнаружением. Чувствительность обнаружения зависит от аффинности белка, первичного антитела, вторичного антитела и субстрата HRP и может варьироваться от одного образца к другому.

Хемилюминесцентные системы обнаружения

Метод обнаружения Подложка Чувствительность обнаружения Опции продукта Преимущества Недостатки
Хемилюминесцентный HRP
Иммун-Стар HRP Люминол 1–3 стр. Конъюгаты Короткая (30 сек) выдержка Азид подавляет активность ферментов
Субстрат HRP Продолжительность сигнала 6–8 часов
Наборы для иммуноблоттинга Совместим с ПВДФ и нитроцеллюлозой
Рабочий раствор, стабильный в течение 24 часов при комнатной температуре
Immun-Star WesternC Люминол Фемтограмма Конъюгаты Продолжительность сигнала до
24 часа
Азид подавляет активность ферментов
Оптимизирован для ПЗС тепловизоров
Высокая чувствительность
Хемилюминесцентный AP
Иммун-Стар AP CDP- Звезда 10 стр. Конъюгаты Выдержка от 30 секунд до 5 минут Активность эндогенной фосфатазы может приводить к ложноположительным результатам
Подложка AP Продолжительность сигнала до
24 часа
Наборы для иммуноблоттинга Блот можно реактивировать

Безопасность — еще одно преимущество хемилюминесцентного обнаружения.У него нет проблем безопасности, связанных с обнаружением изотопов, таких как облучение персонала, высокие затраты и экологические проблемы.

Наборы для хемилюминесценции Immun-Star ™
Наборы Immun-Star включают либо субстрат CDP-Star (активированный AP), либо люминол (активируемый HRP) и производят сильный сигнал как на нитроцеллюлозе, так и на PVDF. Световой сигнал, генерируемый наборами Immun-Star, не только обеспечивает быстрое воздействие, но и длится до 24 часов (набор для хемилюминесценции Immun-Star ™ WesternC ™ и наборы Immun-Star ™ AP) после первоначальной активации блота.Эти блоты могут реагировать со свежим субстратом даже через несколько недель после исчезновения сигнала. Их также можно раздевать и переодевать несколько раз.

Набор для хемилюминесценции Immun-Star WesternC разработан для использования со стандартами Precision Plus Protein ™ WesternC ™ и системами визуализации CCD. Он обеспечивает чувствительность на уровне фемтограмм и совместимость с любыми антителами, конъюгированными с HRP (см. Рисунок ниже). Обеспечивается высокая интенсивность сигнала, оптимизированная для визуализации на ПЗС-матрице.

Обнаружение антигена и стандартов Precision Plus Protein WesternC с использованием набора для хемилюминесцентного обнаружения Immun-Star WesternC .Белки и 5 мкл белковых стандартов (дорожка 1) и серии разведений лизата клеток E. coli (дорожки 2–6) подвергали электрофорезу на 4–20% геле Criterion ™ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Блот анализировали антителом, специфичным для слитых белков GST, а затем вторичным антителом, конъюгированным с HRP, и конъюгатом StrepTactin-HRP. После 5-минутной инкубации в растворе для обнаружения Immun-Star WesternC блот визуализировали на имидж-сканере ChemiDoc XRS + в течение 5 секунд.

При обнаружении флуоресценции во время иммунодетекции используется первичное или вторичное антитело, меченное флуорофором.Источник света возбуждает флуорофор, и излучаемый флуоресцентный сигнал фиксируется камерой для получения окончательного изображения. При флуоресценции фотон высокой энергии (hv ex ) возбуждает флуорофор, заставляя его покинуть основное состояние (S 0 ) и перейти в состояние с более высокой энергией (S ‘ 1 ). Часть этой энергии рассеивается, позволяя флуорофору перейти в расслабленное возбужденное состояние (S 1 ). Излучается фотон света (hv ex ), возвращающий флуорофор в основное состояние.Испускаемый фотон имеет более низкую энергию (большую длину волны) из-за рассеивания энергии в возбужденном состоянии.

При использовании детектирования флуоресценции учитывайте следующие оптические характеристики флуорофоров для оптимизации сигнала:

  • Квантовый выход — эффективность испускания фотона после поглощения фотона. Процессы, которые возвращают флуорофор в основное состояние, но не приводят к испусканию флуоресцентного фотона, снижают квантовый выход.Флуорофоры с более высоким квантовым выходом обычно ярче
  • Коэффициент экстинкции — показатель того, насколько хорошо флуорофор поглощает свет определенной длины волны. Поскольку поглощение зависит от длины пути и концентрации (закон Бера), коэффициент экстинкции обычно выражается в см -1 M -1 . Как и в случае с квантовым выходом, флуорофоры с более высокими коэффициентами экстинкции обычно ярче
  • Стоксов сдвиг — разность максимальных длин волн возбуждения и излучения флуорофора.Поскольку некоторая энергия рассеивается, когда флуорофор находится в возбужденном состоянии, испускаемые фотоны имеют меньшую энергию (большую длину волны), чем свет, используемый для возбуждения. Большие стоксовы сдвиги минимизируют перекрытие между длинами волн возбуждения и излучения, увеличивая обнаруживаемый сигнал
  • Спектры возбуждения и излучения — спектры возбуждения представляют собой графики интенсивности флуоресценции флуорофора в диапазоне длин волн возбуждения; Спектры излучения показывают длины волн излучения флуоресцирующей молекулы.Выберите флуорофоры, которые могут возбуждаться источником света в тепловизоре и которые имеют спектры излучения, которые может регистрировать прибор. При выполнении мультиплексных вестернов выбирайте флуорофоры с минимально перекрывающимися спектрами, чтобы избежать перекрестных помех между каналами

В настоящее время доступно несколько флуорофоров, охватывающих широкий диапазон длин волн возбуждения и излучения, в том числе некоторые на основе органических красителей (например, цианина и флуоресцеина), нанокристаллов полупроводникового материала и естественно флуоресцентных белков (например, фикобилипротеинов, таких как фикоэритрин и аллофикоцианин. ).

Обнаружение флуоресценции

(см. Рисунок ниже) имеет ряд преимуществ по сравнению с другими методами:

  • Мультиплексирование — использование нескольких флуорофоров разного цвета для одновременного обнаружения нескольких целевых белков на одном блоте. При обнаружении нескольких белков в мультиплексном флуоресцентном вестерн-блоте убедитесь, что флуоресцентные сигналы, генерируемые для каждого белка, можно дифференцировать. Используйте первичные антитела от разных видов хозяев (например, мыши и кролика) и вторичные антитела, которые перекрестно абсорбируются против других видов, чтобы избежать перекрестной реактивности.Используйте флуорофоры, конъюгированные со вторичными антителами с различными спектрами, чтобы их можно было оптически отличить друг от друга, чтобы избежать перекрестной флуоресценции
  • Динамический диапазон — В 10 раз больший динамический диапазон по сравнению с обнаружением хемилюминесценции и, следовательно, лучшая линейность в пределах обнаружения
  • Стабильность — Многие флуоресцентные молекулы стабильны в течение длительного периода времени, что позволяет сохранять блоты для повторной визуализации на более позднем этапе — часто через несколько недель или месяцев — без значительной потери сигнала.Большинство методов флуоресценции также совместимы с протоколами стриппинга и повторного зондирования при условии, что блоты не высыхают между последовательными раундами детектирования вестерн-блоттингом

Мультиплексное флуоресцентное обнаружение серии двукратных разведений двух белков, GST (красный) и ингибитора трипсина сои (зеленый). Начальная концентрация составляла 500 нг каждого белка. Стандарты Precision Plus Protein ™ WesternC ™ использовали в качестве маркеров.

Биолюминесценция
Биолюминесценция — это естественное излучение света многими организмами.Системы биолюминесценции различаются по структуре и функциям ферментов и кофакторов, участвующих в процессе, а также по механизму реакций генерации света. Биолюминесценция также используется как метод обнаружения белков и нуклеиновых кислот на мембране.

Обнаружение биолюминесценции включает инкубацию мембраны (со связанным комплексом антиген-антитело-фермент) в биолюминогенном субстрате и одновременное измерение излучаемого света (см. Рисунок ниже). Субстрат, задействованный в этой системе обнаружения, представляет собой производное на основе люциферина.Детектирование света выполняется с помощью камеры для подсчета фотонов, и промокшие белки визуализируются в виде ярких пятен. Этот метод похож на хемилюминесценцию по своей чувствительности и скорости обнаружения, но он не широко используется, и на рынке имеется мало биолюминогенных субстратов. PVDF является предпочтительной мембраной для обнаружения биолюминесценции, поскольку мембраны из нитроцеллюлозы могут содержать вещества, ингибирующие активность люциферазы.

Хемифлуоресценция
Хемифлуоресценция — это ферментативное превращение субстрата во флуоресцентный продукт (см. Рисунок ниже).Флуорогенные соединения (нефлуоресцентные или слабо флуоресцентные вещества, которые могут превращаться в флуоресцентные продукты) доступны для использования с широким спектром ферментов, включая AP и HRP. Фермент отщепляет фосфатную группу от флуорогенного субстрата с получением продукта с высокой флуоресценцией. Флуоресценцию можно обнаружить с помощью флюоресцентного имидж-сканера, такого как PharosFX System или ChemiDoc MP System. Хемифлуоресценция обеспечивает стабильный флуоресцентный продукт реакции, поэтому блоты можно сканировать позже.Этот метод также совместим со стандартными процедурами снятия изоляции и повторного зондирования.

Авторадиография
Гамма-излучающий радиоизотоп 125 I можно использовать для мечения лизинов в иммуноглобулинах для радиометрического обнаружения антигенов (см. Рисунок ниже). Прямое иммунологическое обнаружение (с использованием меченых вторичных антител) всего 1 мкг точечного иммуноглобулина возможно с высокой специфической активностью 125 I. Помеченные радиоактивным изотопом пятна могут быть обнаружены с помощью рентгеновской пленки, метода, известного как авторадиография.Из-за опасностей, связанных с радиоактивно меченными конъюгатами, популярность авторадиографии снижается в пользу колориметрических и хемилюминесцентных методов.

Маркировка иммунным золотом
В методах обнаружения иммунного золота для обнаружения антигена используются вторичные антитела, меченные золотом. Поскольку этот метод имеет относительно низкую чувствительность и сигнал непостоянен, для усиления сигнала были разработаны методы усиления серебра, аналогичные описанным для окрашивания общего белка коллоидного золота (см. Рисунок ниже).При использовании серебра на блоте создается фон, и чувствительность увеличивается в 10 раз, что эквивалентно колориметрическому обнаружению AP и в несколько раз более чувствительно, чем авторадиография.

Механизм обнаружения химии. При детектировании биолюминесценции ( A ) сама ферментативная реакция излучает свет, тогда как при хемифлуоресценции ( B ) продукт реакции флуоресцирует. В авторадиографии ( C ) вторичное антитело само несет радиоактивную метку, а при маркировке иммунным золотом ( D ) вторичное антитело мечено золотом, а сигнал усиливается преципитацией серебра.

Байер Э.А. и Вильчек М. (1980). Использование авидин-биотинового комплекса как инструмента в молекулярной биологии. Методы Biochem Anal 26, 1–45.

Blake MS et al. (1984). Быстрый и чувствительный метод обнаружения антител, конъюгированных с щелочной фосфатазой, на Вестерн-блоттинге. Анальная биохимия 136, 175–179.

Chaiet L и Wolf FJ (1964). Свойства стрептавидина, биотин-связывающего белка, продуцируемого Streptomyces. Arch Biochem Biophys 106, 1–5.

Guesdon J-L et al.(1979). Использование авидин-биотинового взаимодействия в иммуноферментных методах. J. Histochem Cytochem 27, 1131–1139.

Hawkes R et al. (1982). Анализ точечного иммунного связывания для моноклональных и других антител. Анальная биохимия, 119, 142–147.

Hsu SM et al. (1981). Использование комплекса авидин-биотин-пероксидаза (ABC) в методах иммунопероксидазы: сравнение процедур ABC и немеченых антител (PAP). J. Histochem Cytochem 29, 577–580.

Куриен Б.Т. и Скофилд Р.Х. (2003).Белковый блоттинг: обзор. J Immunol Methods 274, 1–15.

Цанг В.К. и др. (1985). Иммуноэлектротрансферный блот с ферментом (EITB). В иммуноферментном иммуноанализе. T.T. Ngo и H.M. Ленхофф, ред. (Нью-Йорк: Plenum Press), стр. 389–414.

Номер Описание Скачать
5881 Улучшенный мультиплексный флуоресцентный вестерн-блоттинг, Rev A Нажмите, чтобы загрузить
2895 Руководство по белковому блоттингу, версия C Нажмите, чтобы загрузить
3179 Флуоресцентные наночастицы для вестерн-блоттинга, Rev A Нажмите, чтобы загрузить
5809 Визуализация хемилюминесцентных вестерн-блотов: сравнение цифровых изображений и рентгеновской пленки, Ред. A Нажмите, чтобы загрузить
5723 Увеличьте пропускную способность вестерн-блоттинга с помощью мультиплексной флуоресцентной детекции, Rev B Нажмите, чтобы загрузить

Свиток

Хемилюминесцентный вестерн-блоттинг | Thermo Fisher Scientific

Хемилюминесцентное обнаружение для вестерн-блоттинга популярно, потому что оно предлагает несколько преимуществ по сравнению с другими методами обнаружения.Использование хемилюминесценции позволяет делать несколько экспозиций, что позволяет оптимизировать соотношение сигнал / шум. Реагенты обнаружения могут быть удалены, и весь блот может быть повторно зондирован для визуализации другого белка или для оптимизации обнаружения первого белка. Большой линейный диапазон отклика позволяет обнаруживать и количественно определять широкий диапазон концентраций белка. Что наиболее важно, хемилюминесценция дает наибольшую потенциальную чувствительность из всех доступных методов обнаружения вестерн-блоттинга. Эти преимущества позволили хемилюминесценции стать предпочтительным методом обнаружения в большинстве белковых лабораторий.

Изучите хемилюминесцентные субстраты Протокол хемилюминесцентного вестерн-блоттинга Скачать техническое руководство по хемилюминесцентному вестерн-блоттингу



Вступление

Вестерн-блоттинг — это мощный метод, позволяющий косвенно определять образцы белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозных или поливинилиденфторидных мембранах (ПВДФ).При обычном вестерн-блоттинге образцы белка сначала разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE), а затем электрофоретически переносят на мембрану. После стадии блокирования мембрану исследуют первичным антителом, которое было индуцировано против рассматриваемого антигена. После последующей стадии промывки мембрану инкубируют с конъюгированным вторичным антителом, которое реагирует с первичным антителом. Двумя наиболее распространенными ферментами, конъюгированными со вторичными антителами, являются пероксидаза хрена (HRP) и щелочная фосфатаза (AP).Эти ферменты катализируют химическую реакцию для генерации записываемого сигнала в виде света.

Щелкните изображение для увеличения

Обнаружение хемилюминесцентного вестерн-блоттинга.

Хемилюминесцентные субстраты для HRP и AP отличаются от других субстратов тем, что обнаруживаемый свет является временным продуктом реакции, который присутствует только во время реакции фермент-субстрат. Это контрастирует с хромогенными субстратами, которые производят стабильный окрашенный продукт; эти окрашенные осадки остаются на мембране после завершения реакции фермент-субстрат.На хемилюминесцентном вестерн-блоте субстрат является лимитирующим реагентом в реакции; по мере того, как субстрат истощается, светоотдача уменьшается и в конечном итоге прекращается. Хорошо оптимизированная процедура с использованием правильных разведений антител будет обеспечивать стабильный световой поток в течение нескольких часов, что позволяет стабильно и точно определять белки.

Хемилюминесцентные методы обнаружения вестерн-блоттинга

Выбор субстрата для хемилюминесцентного вестерн-блоттинга определяется выбранным репортерным ферментом.В частности, реагенты на основе люминола и акридана являются хемилюминесцентными субстратами HRP. Для хемилюминесцентного обнаружения АР доступны субстраты на основе акридана и 1,2-диоксетана.

Хемилюминесцентная реакция субстрата HRP-люминола. Хемилюминесценция — это свойство химических реакций, в результате которых в качестве побочного продукта выделяется свет. Люминол — один из наиболее широко используемых хемилюминесцентных реагентов. Окисление люминола пероксидом приводит к образованию продукта в возбужденном состоянии, называемого 3-аминофталатом. Этот продукт распадается на более низкое энергетическое состояние, испуская фотоны света.

Хемилюминесцентная реакция субстрата АР — CDP-Star. CDP-Star дефосфорилируется АР с образованием метастабильного промежуточного аниона диоксетана фенолята, который разлагается и излучает свет с максимальной интенсивностью на длине волны 475 нм. Излучение света происходит только во время реакции фермент-субстрат.

Субстраты HRP (пероксидаза хрена) Субстраты АР (щелочная фосфатаза)
Чувствительность Чувствительность фемограммы Чувствительность пикограммы
Генерация сигнала Немедленно Постепенно увеличивается с максимумом сигнала на ~ 30-60 минут
Продолжительность сигнала До 24 часов 24-96 часов
Соображения Совместим с распространенными буферами, такими как TBS и PBS Не совместим с фосфатными буферами
Когда использовать Антитела или зонды, конъюгированные с HRP Антитела или зонды, конъюгированные с AP

Пероксидаза хрена (HRP) катализирует окисление субстратов перекисью водорода, в результате чего образуется окрашенный или флуоресцентный продукт, а в качестве побочного продукта реакции выделяется свет.HRP оптимально функционирует при pH, близком к нейтральному, и может подавляться цианидами, сульфидами и азидами. Конъюгаты антитело-HRP превосходят конъюгаты антитело-AP в отношении специфической активности как фермента, так и антитела. Кроме того, его высокая скорость оборота, хорошая стабильность, низкая стоимость и широкая доступность субстратов делают HRP предпочтительным ферментом для большинства приложений. Из-за относительно небольшого размера фермента HRP дальнейшее повышение чувствительности может быть достигнуто за счет использования вторичных антител, конъюгированных с поли-HRP, и может устранить необходимость использования систем амплификации типа ABC для некоторых исследователей.Щелочная фосфатаза (ЩФ) катализирует гидролиз фосфатных групп из молекулы субстрата, приводя к окрашенному или флуоресцентному продукту и высвобождению света в качестве побочного продукта реакции. AP обладает оптимальной ферментативной активностью при щелочном pH (pH 8–10) и может подавляться цианидами, арсенатом, неорганическим фосфатом и хелаторами двухвалентных катионов, такими как EDTA. В качестве метки для вестерн-блоттинга AP предлагает явное преимущество перед другими ферментами. Поскольку скорость реакции остается линейной, чувствительность обнаружения можно повысить, просто позволив реакции протекать в течение более длительного периода времени.

Поскольку HRP — самый популярный фермент, используемый в вестерн-блоттинге, он будет обсуждаться в этой статье в качестве нашего примера. Доступно несколько разновидностей хемилюминесцентных HRP-субстратов Thermo Scientific Pierce ECL и SuperSignal, которые обеспечивают различные уровни чувствительности для хемилюминесцентного вестерн-блоттинга. Обратитесь к Таблице 1, чтобы определить наиболее подходящий хемилюминесцентный субстрат HRP на основе количества интересующего целевого белка, количества образца, содержащего целевой белок, а также уровня чувствительности и типа инструментов, доступных для обнаружения.В таблице также приведены характеристики обычно используемых хемилюминесцентных субстратов с улучшенной хемилюминесценцией (ECL) и SuperSignal.

Хемилюминесцентные субстраты для HRP обычно представляют собой двухкомпонентные системы, состоящие из стабильного раствора пероксида и улучшенного раствора субстрата, часто на основе люминола. В большинстве случаев для приготовления рабочего раствора смешиваются равные объемы двух компонентов. При инкубации с блотом, на котором связаны антитела, конъюгированные с HRP (или другие зонды), происходит химическая реакция, излучающая свет с длиной волны 425 нм, который может быть уловлен с помощью рентгеновской пленки и устройств визуализации CCD-камеры, которые обнаруживают хемилюминесценцию.Хотя рентгеновская пленка обеспечивает качественные и полуколичественные данные и полезна для подтверждения присутствия целевых белков, тепловизоры на базе охлаждаемых ПЗС-камер предлагают преимущества количественного анализа, быстрого сбора данных, более высокой чувствительности, большего разрешения и большего динамического диапазона, чем фильм.

Таблица 1. Хемилюминесцентные HRP-субстраты Thermo Scientific.
Подложка Pierce ECL Подложка Pierce ECL Plus Подложка SuperSignal West Pico PLUS Подложка SuperSignal West Dura Подложка SuperSignal West Femto Подложка SuperSignal West Atto
Уровень обнаружения Низкая и средняя пикограмма Низкая пикограмма От низкой пикограммы к высокой фемтограмме Средняя фемтограмма Фемтограмма от нижней до средней Низкая фемтограмма — высокая аттограмма
Продолжительность сигнала 0.5–2 часа 5 часов 6–24 ч. 24 часа 8 часов 6 часов
Методы обнаружения Рентгеновская пленка, ПЗС-камера Рентгеновская пленка, ПЗС-датчик изображения, флуоресцентный формирователь изображения Рентгеновская пленка, ПЗС-камера Рентгеновская пленка, ПЗС-камера Рентгеновская пленка, ПЗС-камера Рентгеновская пленка, ПЗС-камера
Рекомендуемое разведение первичных антител * 1: 1,000 1: 1,000 1: 1,000 1: 5,000 1: 5,000 1: 5,000
Рекомендуемое вторичное разведение антител * 1: 25 000 — 1: 200 000 1: 1000 — 1: 15 000 1: 20 000 — 1: 100 000 1: 50 000 — 1: 250 000 1: 100 000 — 1: 500 000 1: 100 000 — 1: 250 000
Выберите, когда… … мишень и образец в изобилии … мишени меньше, образец ограничен, и вам необходимо хемифлуоресцентное обнаружение … мишени меньше, количество образцов ограничено, и вам нужна более высокая чувствительность, чем обеспечивает ECL-субстрат начального уровня … цель менее многочисленна, выборка ограничена, и вы используете захват изображения ПЗС … мишени меньше всего, образец ценен, а вам нужна максимальная чувствительность… мишень меньше всего, образец прецизионный, и вам нужна максимальная чувствительность
Ценность для вас Низкая стоимость; легко перейти с других ECL-подложек начального уровня Наилучшая гибкость обнаружения с опцией хемифлуоресцентного обнаружения Лучшее соотношение цены и качества; работает для большинства вестерн-блотов Наилучшая длительность сигнала Хорошая чувствительность в оптимальных условиях Максимальная чувствительность при меньшей необходимости оптимизации
* На основе концентрации антител 1 мг / мл

Световой поток, генерируемый во время хемилюминесцентной реакции с люминолом, относительно недолговечен; поэтому были разработаны усиленные хемилюминесцентные (ECL) субстраты.Например, использование усилителя с люминолом увеличивает чувствительность сигнала, интенсивность и продолжительность реакции фермент-субстрат. Субстрат Pierce ECL подходит для вестерн-блоттинга, когда исследуются обильные белки или где эксперимент был оптимизирован. Однако были разработаны субстраты, обеспечивающие высокочувствительное обнаружение белков. Например, хемилюминесцентный субстрат SuperSignal West Pico PLUS позволяет обнаруживать белок на уровне от пикограмм до фемтограмм с помощью вестерн-блоттинга.

Подробнее: Определение белков с низким содержанием в вестерн-блоттинге
Подробнее: Руководство по выбору хемилюминесцентных субстратов

Технические соображения

Разведение антител

Одним из наиболее важных технических факторов вестерн-блоттинга является оптимизация разведений антител.На желаемое разведение антитела могут влиять многие факторы, включая объем доступного антитела, специфичность антитела к антигену, изобилие белка и выбор доступных субстратов. Кроме того, отдельные лабораторные протоколы могут направлять исследователей к предпочтительным, ранее оптимизированным условиям. Оптимизация антител — критический шаг для обеспечения надлежащего отношения сигнал / шум. Первичное антитело, специфичное к антигену-мишени, связывается с доступными сайтами эпитопа на белке. После серии этапов промывки, которые помогают удалить несвязанное первичное антитело, вторичное антитело, конъюгированное с ферментом, таким как HRP, инкубируется и связывается с первичным антителом.Множественные вторичные антитела могут связываться с одним первичным антителом, что приводит к процессу амплификации, в результате чего большее количество светопродуцирующих меток может реагировать и производить более детектируемый сигнал. Слишком большое количество первичных или вторичных антител может вызвать перенасыщение блота или чрезмерный фоновый шум. Кроме того, слишком много антител может привести к быстрому формированию сигнала с последующей деградацией — сигнал может быстро исчезнуть, прежде чем его можно будет зафиксировать на пленке или с помощью системы визуализации. Эти проблемы крайне затрудняют надлежащий анализ и выводы из эксперимента.Приведенная ниже таблица может помочь предоставить общие рекомендации по разведениям антител в зависимости от целевого белка или количества образца, условий антител и выбранного субстрата. Также важно отметить, что при переходе с одного субстрата на другой может потребоваться повторная оптимизация разведений антител в соответствии с рекомендациями производителя.

Рекомендации по разведению антител
Условия
Образец Антиген Антитело Рекомендуемый субстрат Первичный Вторичная Особенности
Обилие образца Антиген в изобилии Качество антител хорошее SuperSignal West Pico PLUS 1: 1К 1: 100 К
Обилие образца Антиген в изобилии неизвестен Качество антител неизвестно SuperSignal West Pico PLUS 1: 1К 1: 100 К Если полосы не видны, блот можно промыть и повторно визуализировать с помощью Atto
Обилие образца Низкое содержание антигена Низкое качество антител Подложка SuperSignal West Atto 1: 1К 1: 100 К
Обилие образца Низкое содержание антигена Качество антител хорошее Подложка SuperSignal West Atto 1: 2K 1: 250 К Предполагается, что обычное основное использование составляет 1: 1K
Обилие образца Низкое содержание антигена Количество антител ограничено Подложка SuperSignal West Atto 1: 5К 1: 100 К Предполагается, что обычное основное использование составляет 1: 1K
Обилие образца Антиген в изобилии Количество антител ограничено Подложка SuperSignal West Atto 1: 20 К 1: 250 К Предполагается, что обычное основное использование составляет 1: 1K
Образец ограничен Антиген в изобилии Качество антител хорошее SuperSignal West Pico PLUS 1: 1К 1: 100 К В качестве альтернативы можно было бы загружать меньше и использовать Atto при тех же концентрациях антител
Образец ограничен Обилие антигена неизвестно Качество антител неизвестно SuperSignal West Pico PLUS 1: 1К 1: 100 К Если полосы не видны, блот можно промыть и повторно визуализировать с помощью Atto
Образец ограничен Низкое содержание антигена Качество антител хорошее Подложка SuperSignal West Atto 1: 1К 1: 250 К
Образец ограничен Низкое содержание антигена Низкое качество антител Подложка SuperSignal West Atto 1: 1К 1: 100 К
* На основе концентрации антител 1 мг / мл

Захват сигнала

Вестерн-блоттинг — мощное рутинное приложение; однако захват хемилюминесцентного сигнала может быть сложной задачей, поскольку вестерн-блоттинг включает в себя ряд шагов, для выполнения которых требуются определенные навыки.Отсутствие захвата сигнала может быть вызвано многими факторами. При таком большом количестве переменных (, таблица 2, ) устранение неполадок в проблемном пятне можно сравнить с поиском «иголки в стоге сена». Традиционный протокол часто неэффективен при обнаружении определенного белка. Поэтому для оптимизации результатов часто требуются руководства по устранению неполадок. Для обзора факторов, влияющих на результаты вестерн-блоттинга, просмотрите Таблицу 2. Для получения информации об устранении неполадок вестерн-блоттинга посетите веб-сайт Western Blot — Troubleshooting.

Таблица 2. Факторы, влияющие на результаты вестерн-блоттинга.
Фактор Переменная характеристика Советы
Целевой антиген Конформация, стабильность, доступный эпитоп (ы)
Полиакриламидный гель Производитель, процентный полиакриламид, возраст, лот Используйте гели Bis-Tris для белков с низким / средним содержанием, используйте гели Tris-глицина для белков с высоким содержанием, гели Tricine для белков с низким молекулярным весом и гели Tris-Acetate для белков с высоким молекулярным весом
Мембрана Производитель, тип, лот
Первичное антитело Специфичность, титр, сродство, время инкубации и температура Используйте антитела, утвержденные специально для вестерн-блоттинга
HRP конъюгат Уровень активации фермента и активность, исходное животное, концентрация, детергент
Буфер блокировки Тип, концентрация, перекрестная реактивность
Моющие средства Буфер, объем, продолжительность, частота Используйте минимум 6 промывок по 5 минут перед добавлением субстрата для тщательного удаления несвязавшихся вторичных антител
Подложка Чувствительность, производитель партия, возраст
Метод обнаружения Возраст пленки, производитель оборудования для визуализации, время экспозиции

Интенсивность и продолжительность сигнала

В оптимальных условиях вестерн-блоттинга хемилюминесцентный сигнал может длиться 6–24 часа.Уровень и продолжительность генерации света зависят от конкретного используемого субстрата и соотношения фермент-субстрат в системе. Хотя количество субстрата на блоте относительно постоянно, количество присутствующего фермента зависит от добавленного количества и других факторов (, таблица 2, ). Слишком большое количество ферментного конъюгата, нанесенного на систему вестерн-блоттинга, является одной из основных причин изменчивости сигнала, темного фона, короткой продолжительности сигнала и низкой чувствительности. Кривая излучения сигнала, которая медленно затухает (см. Рисунок ниже), желательна, поскольку она демонстрирует, что каждый компонент системы оптимизирован и позволяет воспроизводить результаты.Слишком быстро затухающий сигнал может вызвать изменчивость, низкую чувствительность, высокий фон и проблемы с документированием сигнала. Длительный сигнал сводит к минимуму вариабельность результатов из-за эффективности переноса, партий подложки от разных производителей и других факторов. Реакция окисления молекул HRP люминолом в субстрате приводит к образованию свободных радикалов в дополнение к производимому свету. Изобилие HRP в системе создаст изобилие свободных радикалов, увеличивая вероятность инактивации HRP.Свободные радикалы могут также повредить антиген, антитела и мембрану, что приведет к снижению эффективности повторного зондирования. На приведенном ниже рисунке показан пример кривых излучения сигнала, созданных для подложек с коротким и длительным сроком службы.

Сравнение кривых излучения сигналов для подложек с короткой и большой длительностью. Когда фермент присутствует в системе вестерн-блоттинга, выходной сигнал достигает пика вскоре после нанесения субстрата и быстро истощает субстрат ( Сигнал 1 ). В оптимальной системе пик излучения сигнала достигает примерно через 5 минут после нанесения субстрата и плато в течение нескольких часов ( Сигнал 2 ).

Прямые и косвенные методы

Для прямого обнаружения используются меченые первичные антитела.Поскольку инкубация с вторичным антителом исключается, эта стратегия занимает меньше времени, чем классический вестерн-блоттинг. Кроме того, устраняется фоновый сигнал перекрестной реактивности со вторичным антителом. Прямое обнаружение также позволяет зондировать несколько целей одновременно. Однако маркировка первичного антитела иногда отрицательно сказывается на его иммунореактивности и не допускает усиления сигнала. Поскольку прямой метод обычно менее чувствителен, чем косвенное обнаружение, он наиболее полезен, когда цель относительно многочисленна.Одним из вариантов является биотинилирование первичного антитела, что является непрямым методом, который усиливает сигнал и устраняет необходимость во вторичных антителах. Мечение реагентами для биотинилирования обычно приводит к более чем одному фрагменту биотина на молекулу антитела. Каждая биотиновая составляющая способна взаимодействовать с конъюгированным с ферментом авидином, стрептавидином или белком NeutrAvidin Thermo Scientific (каталожный номер 31000). По существу, биотин-связывающий конъюгат заменяет вторичное антитело, и его соответствующая молярная концентрация такая же, как если бы использовалось вторичное антитело.Небольшой размер реагентов для биотинилирования (обычно менее 2 кДа) по сравнению с ферментами (40 кДа для HRP; 140 кДа для AP) часто снижает стерические затруднения, обеспечивая большую функциональность меченого первичного антитела.

Прямое и непрямое обнаружение белка и амплификация сигнала за счет образования комплекса авидин-биотин в анализе, включающем обнаружение с помощью специфических антител (например,г., иммуноферментный анализ).

Дальневосточные методы

Иногда антитела к конкретному антигену недоступны или непригодны для вестерн-блоттинга. Специфическое для целевого белка обнаружение с помощью блоттинга возможно, если соответствующий связывающий партнер доступен для использования в качестве зонда. Этот тип приложения, называемый дальневосточным блоттингом, обычно используется для обнаружения или подтверждения межбелкового взаимодействия.Существует множество вариантов детекции вестерн-блоттингом, которые включают, но не ограничиваются, ранее упомянутые стратегии. При дальнем вестерн-блоттинге меченые партнеры по связыванию могут быть помечены реакцией трансляции in vitro с меченным 35S зондом. Также возможно биотинилирование зонда и детектирование конъюгатом биотин-связывающего белка. Дополнительным преимуществом этого типа обнаружения является усиление сигнала. Однако при использовании этого метода нельзя перемаркировать зонд, чтобы не допустить нарушения обнаружения цели.Кроме того, рекомбинантный зонд может быть экспрессирован в бактериях с меткой, такой как GST, HA, c-Myc или FLAG, в которых обнаружение происходит с помощью меченого антитела к конкретной метке. Как и в случае с другими приложениями блоттинга, метод дальнего Запада эффективен как для мембранных, так и для гелевых систем обнаружения. На диаграмме ниже показан рабочий процесс на дальнем западе.

Схема дальнего вестерн-блоттинга для анализа белок-белковых взаимодействий. В этом примере меченый белок-приманка используется для зондирования переносящей мембраны или геля на предмет белка жертвы. После связывания антитело, конъюгированное с ферментом (пероксидаза хрена; HRP), которое нацелено на бирку-приманку, используется для обозначения взаимодействия, которое затем обнаруживается ферментативной хемилюминесценцией. Этот общий подход может быть скорректирован, как показано в таблице ниже, с помощью немаркированного белка приманки, который определяется антителом, биотинилированного белка приманки, который обнаруживается конъюгированным с ферментом стрептавидином, или меченного радиоактивным изотопом белка приманки, который обнаруживается при воздействии на пленку.

Подробнее: Анализ дальнего вестерн-блоттинга
Изучите: Набор для дальнего вестерн-блоттинга

Сбор данных

Сигнал хемилюминесцентного вестерн-блоттинга может быть захвачен с помощью рентгеновской пленки, цифровых устройств формирования изображений на основе камеры с зарядовой связью (ПЗС) и фосфорных устройств формирования изображений, которые обнаруживают хемилюминесценцию.Хотя рентгеновская пленка обеспечивает качественные и полуколичественные данные и полезна для подтверждения присутствия целевых белков, приборы для визуализации на основе ПЗС-камеры предлагают преимущества качественного анализа, мгновенного захвата и анализа изображений, более высокой чувствительности, большего разрешения и большего размера. динамический диапазон, чем у пленки. Кроме того, нет необходимости в выделенном темном помещении и оборудовании для проявки. Инструменты для визуализации можно разместить прямо на столе рядом с другим лабораторным оборудованием.

ПЗС-камеры для хемилюминесцентного захвата изображений
Преимущества Ограничения
Динамический диапазон> 4 порядков Длительные выдержки (> 60 минут) могут привести к усилению фона из-за шума камеры
Интеллектуальные алгоритмы помогают определить оптимальное время экспозиции
Оптимизированный анализ и хранение изображений
Мгновенная визуализация результатов
Количественный
Системы визуализации iBright имеют 9.ПЗС-камера с охлаждением 1 МП обеспечивает высокую чувствительность и динамический диапазон, помогая обнаруживать незначительные различия в образцах.

Часто необходимо экспонировать несколько пленок в разные периоды времени, чтобы получить правильный баланс между сигналом и фоном. Цель состоит в том, чтобы рассчитать время воздействия мембран на пленку так, чтобы желаемый сигнал был четко виден, а фон оставался низким.Это сложно выполнить, поскольку процесс не может быть отслежен и остановлен при достижении желаемой конечной точки. Если пленка не экспонируется достаточно долго (недоэкспонирована), сигнал не будет виден. Если пленка экспонируется слишком долго (передержанная), сигнал может потеряться на заднем плане или отдельные полосы могут стать размытыми вместе. Кроме того, оценка оптимального времени экспозиции очень субъективна, так как трудно визуально определить точную точку, в которой достигается наилучший баланс сигнала и шума.Часто выполняются многократные этапы экспонирования пленки и проявления пленки, что может потребовать значительных затрат времени. После того, как данные записаны на пленку, пленка часто сканируется, чтобы сделать цифровую копию данных, которая затем экспортируется в программное обеспечение для анализа, чтобы облегчить дальнейший анализ, такой как денситометрия и оценка молекулярной массы.

Одним из самых больших преимуществ систем цифровой обработки изображений является возможность точной настройки времени экспозиции (некоторые системы предлагают возможность настройки времени экспозиции с точностью до тысячных долей секунды).Кроме того, многие системы предлагают особую настройку автоматической экспозиции, в которой используются алгоритмы, которые автоматически определяют оптимальное время экспозиции, что не только позволяет получить изображение с оптимальным соотношением сигнал / шум, но также экономит значительное количество времени по сравнению с часто необходимыми многократными экспозициями. с пленкой. Поскольку данные регистрируются в цифровом виде, их можно легко экспортировать в программное обеспечение для анализа (исключая этап сканирования с помощью пленки). Некоторые из самых современных систем предлагают возможность выполнять анализ непосредственно на приборе.Эти удобства делают цифровую визуализацию популярной заменой записи данных на пленку.

Подробнее: Рентгеновская пленка и инструменты для цифровой визуализации
Подробнее: Системы вестерн-блоттинга

Маркеры молекулярной массы

Для обнаружения любого вестерн-блоттинга желательно использовать предварительно окрашенные маркеры молекулярной массы, которые переносятся на мембрану вместе с образцом белка.Появление маркеров молекулярной массы на мембране позволяет оценить молекулярную массу любых обнаруженных полос белка, а также эффективно разделить представляющие интерес белки в геле перед этапом переноса. Когда хемилюминесцентное обнаружение используется для вестерн-блоттинга, полосы белка обнаруживаются на пленке или с помощью оборудования для цифровой визуализации. Если не модифицированы, маркеры молекулярной массы не отображаются на пленке, поскольку они не производят световой поток. Для этого есть несколько решений, описанных ниже.

iBright Prestained Protein Ladder содержит двенадцать рекомбинантных белков, десять (от 11 до 250 кДа), которые окрашены синим цветом и помечены флюором для прямой и ближней ИК-флуоресцентной визуализации и определения размера белков, и два (30 кДа и 80 кДа), которые неокрашены и содержат сайты связывания IgG для связывания первичных и вторичных антител, используемых для хемилюминесцентного и флуоресцентного обнаружения целевого белка.

Одним из решений является использование маркеров молекулярной массы, которые используют домены связывания антител из белка A или G. Домены захвата антител этих белков встроены в маркеры молекулярной массы и, таким образом, связываются с антителами, используемыми в вестерн-блоттинге, обеспечивая передачу сигнала. должны быть сгенерированы и зафиксированы вместе с экспериментальными данными.Применение этих маркеров ограничено, поскольку различное сродство антител к протеинам A и G приводит к различным уровням сигнала. Многие антитела, такие как антитела подкласса IgG1 мыши, не связываются прочно с белком A или G. Другой популярный вариант — использовать маркеры молекулярной массы биотинилированного белка, которые позволяют использовать стрептавидин вместе с антителами для обнаружения или при биотинилированных антителах для первичного обнаружения. используются.

Изучить: Лэддеры белков вестерн-блоттинга

Рекомендуемое чтение

  1. г.Х. Торп, Л. Дж. Крика. (1986) Усиленные хемилюминесцентные реакции, катализируемые пероксидазой хрена. Методы в энзимологии 133: 331–54.
  2. Alegria-Schaffer, A., et al. (2009) Выполнение и оптимизация вестерн-блоттинга с упором на хемилюминесцентное обнаружение. Методы Энзимол 463: 573–99.
  3. Гассманн, М., Гранахер, Б., Роде, Б. и Фогель, Дж. (2009) Количественная оценка вестерн-блоттинга: подводные камни денситометрии. Электрофорез 30: 1845–55.

Дополнительные ресурсы

Набор цветных пятен Наклейки на стену Наклейка на стену

Винил
• Полуглянцевый
• Съемный
• Белый непрозрачный материал (непрозрачный)
• Самоклеящаяся основа

Vinyl приклеится практически к любой гладкой внутренней поверхности, включая стены, стекло, пол, окна и многое другое!

Примечание. Если вы давний поклонник WallMonkeys, возможно, вы ищете наш предыдущий клей Photo-Tex.Винил — наш новый материал по умолчанию, мы считаем, что он лучше подходит для ваших стен. Вы можете запросить Photo-Tex для настенных росписей прямоугольной и квадратной формы в разделе примечаний при оформлении заказа.

Все заказы печатаются и отправляются в течение 1-3 рабочих дней. Доказательства доступны в течение 1 рабочего дня с момента размещения заказа.

Если для вашего заказа требуется подтверждение, производство может быть отложено на время внесения корректировок.

* Срочное производство доступно по запросу. Посмотреть часто задаваемые вопросы о срочном производстве можно здесь.


См. Подробные инструкции здесь.

1. Оставьте наклейку развернутой и положите на ровную поверхность (на ночь для размеров 36 дюймов и больше).
2. Очистите поверхность сухой тканью, чтобы удалить пыль и химические вещества.
3. Осторожно удалите наклейку с бумажной подложки. Рекомендуются дополнительные руки для размеров 36 дюймов и выше.
4. Плотно пригладьте поверхность наклейки к стене, начав с центра и потянув наружу. Удалите и снова установите углы, чтобы выпустить пузырьки воздуха.



Можно ли использовать наклейки WallMonkeys на улице?
— Нет, винил предназначен только для использования внутри помещений.
Будет ли убран белый фон?
— Да, любой полностью белый фон будет отклеиваться, когда наклейка будет размещена на стене. Для более сложных дизайнов может потребоваться небольшая белая рамка для облегчения нанесения.
Могу ли я настроить наклейку?
— Да, все заказы печатаются по запросу. Мы бесплатно предлагаем нестандартные размеры и настройку зеркального отображения. Просто добавьте примечание к своему заказу при оформлении заказа.
Могу ли я предварительно просмотреть свой заказ перед его печатью?
— Да, цифровое подтверждение предоставляется по запросу в течение 1 рабочего дня.Запросите его в разделе заметок при оформлении заказа.

См. Больше часто задаваемых вопросов здесь.


Пятнистая линия Энди Уорхола — Музей Энди Уорхола

Об искусстве

Рисунок Уорхола Французский образ — одна из многих иллюстраций обуви, которые он создал с помощью линейного рисунка, известного как техника пятнистых линий. Уорхол впервые экспериментировал с пятнистой линией, когда еще учился в колледже Технологического института Карнеги (ныне Университет Карнеги-Меллона).Он продолжал разрабатывать эту технику в своей коммерческой работе в Нью-Йорке на протяжении 1950-х годов. Размытая линия позволила Уорхолу создать множество иллюстраций на одну и ту же тему. Этот тип производства позволил ему предложить клиентам несколько идей, чтобы повысить шансы на то, что один из его рисунков будет выбран для окончательной рекламы.

Blotted line объединяет рисунок с базовой гравюрой. Уорхол начал с того, что скопировал карандашный рисунок на лист невпитывающей бумаги, например кальке.Затем он прикрепил этот лист бумаги ко второму листу более впитывающей бумаги, склеив их края вместе с одной стороны. Перьевой ручкой Уорхол закрасил небольшой участок нарисованных линий. Затем он перенес чернила на второй лист, сложив его вдоль петли и слегка прижав или «промокнув» две бумаги вместе. Результатом стали пунктирные, ломаные и тонкие линии, характерные для иллюстраций Уорхола. Уорхол часто красил свои промокшие штриховые рисунки акварельными красками или накладывал сусальное золото.

Точки обзора

Еще одна причина, по которой ему так понравилась [техника промокших линий] [была], что, имея мастер-рисунок, с помощью которого вы делали свою кляксу, вы могли продолжать промокать, перерисовывать и промокать каждый раз и делать дубликаты изображений.

Ассистент Уорхола по коммерческому искусству Натан Глюк в Патрике С. Смите,

Искусство и фильмы Энди Уорхола , 1986

Совершенно верно, что он мог рисовать что угодно и очень и очень быстро.Итак, мы его много использовали.

Художественный руководитель Тина С. Фредерикс, Патрик С. Смит,
Уорхол: Беседы о художнике , 1988

Мы с Энди начали беспрецедентную по тем временам кампанию. Каждое воскресенье в газете New York Times мы публиковали полные страницы, полстраницы. И это было ярким событием для И. Миллера и для Энди. Это расширило его аудиторию так, как никогда не могла бы сделать ни одна редакционная статья журнала. В море крошечных изображений, которые были на страницах «Таймс», эти смелые фантазии-блокбастеры были необычайно эффективны.Рекламы возродили и возродили бренд I. Miller, и из безвкусного, затхлого, затхлого, пыльного, вдовствующего заведения он превратился в стильный торговый центр для дебютанток.

Художественный руководитель Джеральдин Штутц, аудиогид выставки, созданный компанией Antenna audio
в сотрудничестве с Музеем Энди Уорхола и Художественной галереей Онтарио

Заключение

Попросите учащихся повесить свои рисунки рядом с исходным материалом. На отдельном листе бумаги попросите учащихся указать, что они решили включить и приукрасить, и что они решили исключить из исходного источника в своих окончательных иллюстрациях.Используя шкалу оценок от 1 до 5 (пять — высшая оценка), попросите учащихся оценить привлекательность иллюстраций их продуктов. Студенты должны написать одно или два предложения, объясняющих их оценку. Обсудите с классом, какие рисунки удаются, а какие нет и почему.

Добавочный номер

Если есть время, сделайте серию рисунков из одного и того же исходного изображения с изменениями цвета, декора и воздействия.

Радуга раскраски — Пакет действий

Поделиться — это забота!

У нас есть для вас несколько прекрасных бесплатных печатных изданий; раскраски радуги и некоторые другие листы деятельности на основе радугиКарли Райт создала их, используя ключевые темы своей книги «Радужные кляксы». Еще одно эксклюзивное занятие для KiddyCharts, которое поможет играть и учиться вместе с детьми.

Это спонсируемый пост, содержащий партнерские ссылки Amazon

У нас есть несколько разных занятий для вас, пока вы читаете книгу — всего шесть разных листов для вас в пакете заданий:

  • Два поиска по словам,
  • Три страницы-раскраски радуги, чтобы вы могли практиковаться в рисовании всеми цветами радуги, и, наконец,
  • Страница действий, взятая непосредственно из книги, где вы можете выбрать свое любимое Радужное пятно, чтобы рисовать и раскрашивать!

Не забудьте взглянуть на песню The Rainbow Blots, пока изучаете эти листы?

Как всегда — мы поделимся с вами действиями, прежде чем предложим загрузку, чтобы вы могли точно знать, что вы получаете заранее.

Раскраски радуги: Знакомство с радужными кляксами

Наша первая страница — это небольшое введение в персонажей «Радужных пятен»; Почему бы вашим детям не раскрасить их все, как в книге, или не проявить немного творчества с цветами радуги?

Развлекайтесь с радужными кляксами

На этой радужной раскраске показано, как Радужные Кляксы немного развлекаются с некоторыми вещами, окрашенными в цвет радуги. Можете ли вы, дети, заметить их и рассказать немного о них? Может быть, они тоже могут раскрасить их правильными цветами и сопоставить их с персонажем Радужных пятен?

Раскраска над радугой

Это последняя из имеющихся у нас для вас радужных раскрасок. На ней изображена радуга, чтобы ваши дети могли попрактиковаться в понимании цветов радуги по-настоящему.

Радужные кляксы Wordsearch 1

Первый из наших поисков слов на радужную тематику, который поможет закрепить понимание цветов радуги у детей.

Радуга Кляксы Wordsearch 2

Это второй лист, который у нас есть для книги, чтобы улучшить понимание и понимание цветов радуги. Мы надеемся, что они оба понравятся вам, дети.

Создайте своего собственного персонажа Rainbow Blots

Наше последнее задание из книги — это задание «Сделай свой собственный» — детям предлагается сделать свои собственные радужные кляксы и поделиться им в листе заданий.Почему бы не побудить их дать волю своему воображению и цвету?

Мы действительно надеемся, что вам понравятся эти занятия, которые мы собрали для вас в книге «Радужные кляксы» — если вы хотите узнать об этом немного больше. Вот автор, Карли, читает это вслух своей дочери:

<< Чтобы загрузить этот пакет занятий - нажмите на круглое изображение ниже >>

Спасибо, что пришли к нам, и обязательно посмотрите книгу Карли «Радужные кляксы», которая помогает научить детей цветам радуги в правильном порядке, новым, веселым и увлекательным способом.

В книге представлена ​​новая песня о цветах радуги, которая поможет детям легко и с радостью разучить радугу.

Если вы ищете другие интересные занятия для детей, не забудьте подписаться на нашу рассылку новостей….

У нас также есть некоторые другие цветные задания на сайте, на которые стоит обратить внимание.

Как всегда, существует множество других замечательных идей для создания радуги и развлечения с цветами, так почему бы не взглянуть на некоторые из них?

Нам нравятся все эти идеи и эта задача — и мы надеемся, что вы тоже.Скоро увидимся на сайте,

 Елена
 

Приколите на потом!

Поделиться — это забота!

Кляксы для детей и малышей

Занятие рисованием кляксами настолько просто, насколько это возможно, и самое замечательное то, что вся семья может принять участие.

Если вы можете промокнуть краску и сложить лист бумаги, у вас есть все, что нужно, чтобы сделать это произведение искусства, и возможности безграничны с точки зрения выбора краски и цвета бумаги.

Art можно повесить где угодно в доме!

Если вы украсите свой дом произведениями искусства своего ребенка, он почувствует себя еще более его частью. Секрет успеха в том, чтобы проявить смелость и действовать! Дети смелы. Они повсюду вешают свои работы, и мы тоже должны!

Все, что вам нужно для этого занятия, — это прочная художественная бумага, краска и пластиковые ложки! Просто включите свое воображение и получайте удовольствие!

Что вам понадобится:

  • Строительная бумага
  • Краска
  • Ложки пластиковые

Шаг 1. Возьмите припасы

  • Выньте художественную бумагу, краску и пластиковые ложки.
  • Подготовьте станцию ​​для покраски. Залейте краску отдельного цвета в каждый лоток для краски. Положите старую газету и приготовьте влажную ткань для легкой уборки!
  • Сложите бумагу пополам.

Шаг 2: Добавьте краску

  • Попросите ребенка развернуть бумагу и разложить ее.
  • Помогите им взять шарик краски и нанести каплю на правую сторону листа.
  • Возьмите ложку краски другого цвета и нанесите ее рядом с краской первого цвета.Повторите то же самое с 3-м цветом.
  • Ничего страшного, если цвета накладываются друг на друга, но постарайтесь держать это подальше от края бумаги, чтобы он не брызгал сбоку!

Шаг 3: Нажмите и разгладьте

  • После того, как вы закончите рисовать на бумаге, сложите бумагу и помогите ребенку прижать ее руками.
  • Попросите их двигать руками вперед и назад, разглаживая бумагу.
  • Вы чувствуете, как краска растекается под вашими руками по бумаге?
  • Как вы думаете, что вы увидите, когда откроете бумагу?

Шаг 4: Раскройте свои работы!

  • Разверните бумагу, чтобы раскрыть свое прекрасное творение.
  • Что ты видишь? Использовать свое воображение!
  • У вас больше цветов, чем когда вы начали? Откуда они пришли? (Подсказка: цвета смешиваются!)
Грег Стокдейл 3 мая 2015 г.

admin

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.