Окончание -ED: написание, произношение, использование

Окончание -ED заслуживает отдельной статьи, прежде всего, потому что оно открывает перед изучающими новый уровень общения: прошедшее время. Изучив, как использовать окончание -ED, вы приобретаете новое языковое средство выражения своих мыслей и уже можете общаться с собеседником на новые темы, которые было сложно обсудить при помощи настоящего времени.

Мы впервые встречаемся с окончанием —ED на уровне elementary, когда приступаем к изучению английского. Тогда же мы учимся делить глаголы на правильные и неправильные. Окончание -ED добавляется только к правильным глаголам, чтобы образовать вторую и третью форму глагола. Вторая форма используется для образования времени Past Simple. Но недостаточно просто запомнить, что глагол с окончанием -ED употребляется в прошедшем времени. Необходимо также разобраться в особенностях использования окончания, а именно в произношении и написании глаголов с окончанием -ED.

Произношение

Первый нюанс, который часто упускают из виду как преподаватели так и изучающие — это произношение окончания. Как только его не произносят, и чаще всего неверно. При изучении особенностей произношения любых окончаний помните, что окончание добавляется к слову, а не слово к окончанию, поэтому окончание будет приспосабливаться под слово, а не наоборот. Глагол всегда сохраняет свое звучание. Если, добавив окончание,  у вас меняется произношение глагола, значит вы произносите его неправильно.

Чтобы понять, как следует произносить окончание—ED с тем или иным глаголом, вы должны обратить внимание на последний звук глагола.

После звуков /t/ и /d/, окончание произносится как /ɪd/, так как иначе вам будет очень сложно произнести слово:

count — counted
end — ended
invite — invited
land — landed
start — started
visit — visited

wait — waited

Запомните, что окончание —ED никогда не произносится как /ed/, только /ɪd/, а также просто /t/ или /d/.

Если глагол оканчивается на глухой звук: /p/, /h/,/s/, /k/, /f/, /tʃ/, /ʃ/, то окончание произносится глухо: /t/:

ask — asked
clap — clapped
dress — dressed
help — helped
like — liked
touch — touched
wash — washed

Если глагол оканчивается на звонкий или гласный звук, то окончание произносится звонко: /d/:

answer — answered
call — called
cry — cried
love — loved
move — moved
phone — phoned
play — played

К сожалению, многие изучающие откровенно пренебрегают произношением окончания —ED и произносят его так, как им кажется правильным. Так как в русском языке мы оглушаем звонкие окончания слов, сами того не замечая: мы произносим

‘хлеп’ (хлеб), ‘сапок’ (сапог), ‘снек’ (снег) и так далее, то и в английском мы произносим слова по тому же принципу, не задумываясь. В английском языке оглушать звонкие звуки нельзя. Это приводит не только к ужасному произношению, но и к искажению слов.

Например, если вы в слове played оглушаете окончание, то у вас выходит pleɪT. A plate — это тарелка. Если вы в слове lived вместо /lɪVd/ произносите /lɪFt/, то получается совершенно другое слово — lift, которое переводится «поднимать».

Таких примеров можно привести очень много. Вы никогда не избавитесь от акцента и не приобретете хорошее английское произношение, если будете оглушать окончания, поэтому не стесняйтесь тренироваться, лучше произносите слово медленно, но четко, не искажая звуки.

Написание

С произношением разобрались, теперь рассмотрим правила написания окончания -ED с глаголами.

Чаще всего окончание просто добавляется к основе глагола и никаких изменений в написании не происходит:

open — opened
call — called
look — looked
listen — listened
talk — talked

Существует ряд правил, которые вступают в силу, когда к глаголу добавляется окончание -ED.

1. Если глагол уже оканчивается на -Е, то к нему добавляется только -D:

   smile — smiled
   bake — baked
   close — closed
   live — lived
   move — moved

2. Правило, на которое важно обратить ваше внимание — это добавление окончания к глаголу, который оканчивается на -Y. По предыдущему опыту добавления окончаний (образование множественного числа или Present Simple, так как если вы уже знакомитесь с Past Simple, то по умолчанию Present уже вами освоен) вы помните, что если слово оканчивается на -Y, то с ним что-то должно происходить при добавлении окончания. Отсюда возникают всякие интересные варианты написания, которые не всегда правильные.

   play — played
   enjoy — enjoyed
   prey — preyed
   stay — stayed
   employ — employed

   Если же правильный глагол, который вы хотите использовать в Past Simple, оканчивается на согласную, после которой стоит -Y, тогда с чистой совестью можете заменять Y на I и добавлять -ED:

   copy — copied
   cry — cried
   try — tried
   spy — spied
   tidy — tidied

3. Если глагол оканчивается на одну согласную, перед которой стоит ударная гласная (закрытый ударный слог), то перед добавлением окончания -ED последняя согласная удваивается:

   star — starred
   

   stop — stopped
   drop — dropped
   rob — robbed
   beg — begged
   refer — referred
   prefer — preferred

4. Если же глагол оканчивается на две согласные, то просто добавляется окончание и ничего не меняется:

   climb — climbed
   comb — combed
   start — started

5. Когда глагол состоит из нескольких слогов, и последний слог безударный, то последняя согласная не удваивается:

   benefit — benefited
   profit — profited

6. В британском варианте английского (BrE) есть несколько глаголов-исключений, которые имеют удвоенную согласную перед окончанием -ED, несмотря на ударение:

   travel — travelled
   quarrel — quarrelled
   label — labelled
   signal — signalled

В американском варианте английского эти слова не удваивают конечную согласную.

Использование

Теперь  поговорим об использовании глаголов  с окончанием -ED.

Основное использование этой формы глаголов: время Past Simple. Кстати, глаголы с окончанием можно встретить только в утвердительной форме Past Simple, потому как в отрицательных и вопросительных предложениях появляется вспомогательный глагол DID и основной глагол остается в первой форме, без окончаний.

У правильных глаголов вторая и третья форма совпадает, поэтому во всех временах группы Perfect нам тоже будут встречаться глаголы с окончанием -ED во всех типах высказывания.

Пассивный залог ( Passive Voice ) тоже непременно включает третью форму глагола, поэтому в пассивных конструкциях вы обязательно столкнетесь с глаголами с окончанием -ED.

И наконец, многие глаголы с окончанием -ED приобрели функцию прилагательных:

interested — заинтересованный
motivated — мотивированный
prepared — приготовленный
isolated — изолированный
recommended — рекомендованный

Важно помнить, что окончание можно добавлять только к правильным глаголам, а неправильные просто выучить. Если у вас с этим проблема — воспользуйтесь нашими полезными советами.

 

Узнать больше
в онлайн-школе
ENGINFORM

Если вы только приступили к изучению английского, то именно на этом этапе важно усвоить те особенности, о которых мы рассказали в этой статье, потому что в дальнейшем вас ждут более сложные аспекты иностранного языка. Таким образам, запомнив несложные особенности использования окончания -ED в самом начале, вы облегчите себе задачу на будущее.

Успехов вам! Изучайте английский с удовольствием!

озвученные таблицы с топ-80 самых популярных

I knew you were going to screw everything up.	Я знала, что ты все испортишь.
They laughed at his joke and couldn’t stop.	Они смеялись над его шуткой и не могли остановиться.
He owned this shop for 20 years.	Он владел этим магазином 20 лет.
We need to pay the rent on time every month.	Каждый месяц нам нужно вовремя платить аренду.
Every evening the whole family gathers to listen how grandmother reads.	Каждый вечер вся семья собирается, чтобы послушать, как бабушка читает.
I run 6 kilometres every morning.	Каждое утро я пробегаю 6 километров.
I tried to warn you about this.	Я пытался тебя предупредить по поводу этого.
I work from 9 to 5 every day. We can meet at the corner of the street at 5:30 p.m.	Я работаю с 9 до 5. Мы можем встретиться на углу улицы в 5:30 вечера.
He hit me and ran away.	Он ударил меня и убежал.
I do it every day: cook, clean and go to work.	Я делаю это каждый день: готовлю, убираюсь и иду на работу.
She draws amazing pictures.	Она рисует потрясающие картины.
She learned to do this at the art center nearby.	Она научилась это делать в художественном центре неподалеку.
Put the book on the shelf when you are done.	Когда закончишь, положи книгу на полку.
The telephone rang twice but nobody answered.	Телефон звонил два раза, но никто не ответил.
She said they are going to Norway this winter.	Она сказала, что зимой они собираются поехать в Норвегию.
Send all these letters not later than on Friday.	Отправь эти письма не позже пятницы.
Dear, sit next to me and tell me what bothers you.	Дорогая, сядь рядом со мной и расскажи, что тебя беспокоит.
She was standing so far from me, that I could hardly see her.	Она стояла так далеко от меня, что я едва ли мог ее увидеть.
We need to thank him for helping us and bring him some cake.	Мы должны поблагодарить его за помощь и отнести ему немного пирога.
We watch football every Friday.	Каждую пятницу мы смотрим футбол.
Write me as often as you can.	Пиши мне так часто, как только сможешь.
Call your dad and remind him to buy tomatoes.	Позвони отцу и напомни ему купить помидоры.
I found that note in the book. Do you believe it belonged to our grandparents?	Я нашел эту записку в книге. Думаешь, она принадлежала нашим бабушке и дедушке?
I forgot to tell you that we leave tomorrow morning.	Я забыл сказать тебе, что завтра утром мы уезжаем.
Children grow so fast.	Дети так быстро растут.
What happened last night? I heard you shouting.	Что случилось прошлой ночью? Я слышала, как ты кричала.
I feared the shadow in the dark.	Я испугалась тени в темноте.
Wherever you go, I will follow you.	Куда бы ты ни пошел, я пойду за тобой.
Keep that in secret for a few more days.	Еще несколько дней держи это в тайне.
You did a great job, Arthur.	Ты проделал отличную работу, Артур.
I had three dogs when I was small.	Когда я был маленький, у меня было три собаки.
Come to my office and explain everything.	Приходи в мой офис и все поясни.
I care about you and your health.	Я беспокоюсь о тебе и твоем здоровье.
She gave me this ring on my 18th birthday.	Она отдала мне это кольцо на мой 18-й день рождения.
Hold on tight. We are taking off.	Держись крепче. Мы взлетаем.
We live here since I remember myself. I don’t believe my parents are going to move.	Мы живем здесь с тех пор, как я себя помню. Не верю, что мои родители собираются переехать.
I want you to open the envelope and follow all the instructions.	Я хочу, чтобы ты открыла конверт и следовала всем инструкциям.
You seem to know each other very well.	Кажется, что вы знаете друг друга очень хорошо.
Take it and carry to the nearest post office.	Возьми это и отнеси на ближайшую почту.
I wanted to become a doctor, but failed the exams.	Я хотела стать врачом, но завалила экзамены.

Читать «Ария» — Гаряев Омар Максутович — Страница 1

Ария

Омар Гаряев

© Омар Гаряев, 2018

ISBN 978-5-4490-0260-0

Создано в интеллектуальной издательской системе Ridero

Книга Первая. Страна Света

В стародавние времена жил народ, называемый АРИИ. АР – это обратная транскрипция от «РА» – «СВЕТ», так как арии писали справа налево. Их называли народом СВЕТА. АРИЯ – «Я» и «СВЕТ». Разговаривал этот народ на едином для всех языке – санскрите.

Территория, на которой жил этот народ простиралась от границ на Востоке с нынешней Японией, горами Алтая и горными хребтами Тянь-Шаня на юге и далее на юго-запад до границ аравийской пустыни, куда входила территория Междуречья и затем граница поворачивала на север и проходила по Кавказскому хребту. Территории современного Афганистана, Ирана, Палестины и Сирии в состав арийской империи в описываемый период не входили. Чёрное море называлось Морем Ветров. Великая река Волга называлась тогда «Иль-Тиль», что переводится как «Кормилица» и впадала в Море Ветров. Море называлось так потому, что часто дули сильные ветры и плавать было по нему небезопасно. Однако самые отважные из народа строили крепкие суда и плавали в другие страны, о чем будет рассказано позже.

Часть I. Война

Глава I. Поход

Итак, жил в одном городе страны Арии мужчина. Звали его Ашкер-баки. «Баки» означало его род, также как фамилия сейчас. «Ашкер» означало «Тот, кого нельзя согнуть; крепкий, выносливый». И был этот мужчина вождём своего племени и рода. Была у него жена, звали её Ашхум, что значило «Аш» – голова, «хум» – женщина. Фамилий у женщин не было. Когда девушка выходила замуж, ей давалась приставка «хум». Например, до замужества её звали Аш-кылык, «кылык» означало – незрелый, не достигшая брачного возраста. Мальчики с самого рождения носили имя с названием рода. Замужняя женщина звалась так: Ашхум, жена Ашкер-баки. Или другое имя – Куна-хум, что переводится как «Куна» – сыр. Так вот, жена Ашкер-баки была на сносях, а муж её решил отправиться в дальний поход. Пришло известие, что в их страну вторгся сильный и многочисленный враг. Ему нужно было собрать лучших мужчин, умевших воевать и отправиться с ними к месту сбора всей армии. Страна была огромна, и её территория поделена на регионы или самостоятельные государственные образования. Например, северный край назывался ГИПЕРБОРЕЯ. Южный край – АХАТНУН. «Ахат» означало «земля, дарованная Ахату».

«Нун» – область, находящаяся на краю, у границ страны. Центральная область страны называлась Д`АРИЯ. Название означало «Дарованная Ариям». «Гиперборея» – «бор высокий; «-ея» -лежащая за высоким бором». Восточная область страны называлась РАМУН. В переводе значит: «РА» -СВЕТ; «МУ» – это был народ, очень древний, гораздо древнее ариев; так вот тот народ проживал раньше в стране, называемой ЛЕМУРИЯ, что означало «ЛЕ» – лежащая между «УРом». «УР» – это «горы». Напр. древнее название Уральских гор означает: «УР – АЛ» – горный массив с крутым обрывами. В древности там было обширное плато, огороженное горами и в том месте жил этот народ. Потом произошёл глобальный катаклизм, после чего выжившие населили территорию МУ. Позже эта страна значилась как МУГАЛИЯ. Находилась на юге нынешней Монголии.

Западная область Арии называлась ДАРГОН. Гоны – это те, кто чтил КОН. На их диалекте – «Гон». Земля, дарованная Гонам. Это территория теперешней Украины, Молдавии, Восточной Румынии и восточной части Польши. Границы в те времена были размыты и условно проходили по естественным преградам – рекам или горным хребтам. К северу и на северо-восток простиралась обширная Гиперборея, густо заросшая лесами и изобиловавшая дичью и всевозможным зверьём.

Сделав краткий географический обзор страны, вернёмся к нашему герою – Ашкер-баки. Попрощавшись с женой, он взял коня и отправился в путь во главе своей дружины. Путь их пролегал через обширные лесостепи, шли они в пешем и конном походном строю на Восток по территории Д`Арии. Путь их пролегал через города-крепости численностью не более 50 тысяч человек. Все эти города имели, как правило, защитный ров вокруг стен. Внутри городов жил свободный народ Д`Арии. Городские сословия были такие: купцы, ремесленники, писари, судьи. Во главе города или поселения стоял выборный староста. Его выбирали раз в два года на собрании. В городе его выбирали выборные представители сословий, а в сельской общине сами члены общины. Каждый год он отчитывался на Совете старейшин, выборных представителей от каждого сословия. Ещё я не сказал про тех, кто кормился землёй, рекой, лесом и продавал либо обменивал продукты земледелия или промысла в городах. Крестьяне по-нашему, а тогда они назывались ревоки. «Ре» – река, «вок» – приспособление для ловли зверя или рыбы, «ки» – «землепашец». Они входили в отдельное сословие «ревоки» и представители от этого сословия входили в состав Городского Совета, так как вся страна была разделена на административные образования, как у нас сейчас райцентры. Крупных городов было мало, они в основном находились на пересечениях транспортных и торговых путей. Крупные города представляли собой хорошо укреплённые крепости с бойницами на стенах и с башнями на углах. В те времена Д’Ария входила в военный союз с другими государствами, перечисленными выше, так как время от времени приходилось обороняться и защищать свою территорию от внешних врагов. Для этого в каждом городе существовала каста воинов, составляющая полк военного коменданта города. Эта должность утверждалась главным военным министром страны и, как правило, на этот пост назначались проверенные, опытные командиры. Таким был Ашкер-баки. Его звание было онуф. Это был опытный воин, прошедший суровую выучку и имевший опыт в сражениях. Его звание соответствовало званию полковника русской армии. «Он» значило «круг», «уф» – означало «взять врага в кольцо и уничтожить».

Двигаясь на восток, полк Ашкер-баки останавливался в небольших городах и встречался с новыми полками и постепенно численность войска росла. И когда полки достигли границ Рамуна, совокупная численность армии составляла около ста тысяч воинов. Надо сказать, что в те времена вести передавались конным посыльным. Другая армия шла с севера из Гипербореи и обе армии должны были соединиться у большой реки на границе с Рамуном. Рамун вёл жестокую войну с вторгшимся врагом с юга, их города стойко держались, но многие были побеждены и они ждали помощи. Надо отметить, что рамуны были очень мужественными, отважными и лучшими воинами в империи. Они совсем не знали страха, прекрасно держались в седле, стреляя на ходу из лука, словом были превосходными наездниками. Однако враг обладал численным превосходством и постепенно блокировал города.

Когда две армии соединились, их было уже более двухсот тысяч воинов, а это уже была сила. Их возглавил самый опытный полководец империи – Ашхун, родом из ГАЛИИ. В те времена Галия входила в состав Мугалии, которая в свою очередь входила в состав Рамуна. Это был высокий мужчина, пятидесяти четырёх лет, ростом около 1 м 83 см, с худощавым лицом и голубыми глазами, волнистыми тёмно-русыми волосами, короткой бородой и усами, физически развитый, жилистый и с выдающимися способностями. Он возглавил объединённую армию и бросил её на юг на помощь своему народу.

Итак, наша армия под руководством смелого Ашхуна вышла на рубеж реки и начала переправу. Переправлялись в то время так. Вначале переправлялся передовой отряд с необходимым инструментом и начинал наводить мост, а то и два для всей армии. В то время использовались бурдюки, как для переправы, так и для поддержки наплавного моста. Чтобы течение не снесло их, они связывались между собой прочными верёвками, а затем прикреплялись к якорям, опускаемым на дно. Сверху привязывался дощатый настил, и такой мост служил переправой для обозов с фуражом и продовольствием. Также по нему шли пешие воины. Если было возможно, то конница переправлялась вплавь. Тяжёлое вооружение – доспехи тяжёлой конницы (и такие полки существовали) перевозились на повозках через наплавной мост.

«Умер – закопали, а для чего тогда жил, и не понял даже»: последнее интервью Павла әти

Всего пару недель назад духовник кряшенских приходов Татарстанской митрополии рассказывал об атеизме, татаризации прихожан и «уходе с миром»

Насколько в Татарстане созданы условиях для развития кряшенской веры, культуры. Хотелось бы вам, чтобы по каким-то направлениям работа шла более интенсивно?Накануне на 63-м году жизни скончался благочинный кряшенских приходов Казанской епархии, протоиерей Павел Павлов. Так получилось, что его недавнее интервью «БИЗНЕС Online», вызвавшее серьезный резонанс среди читателей, оказалось последним для отца Павла, который не скрывал, что долгое время боролся с тяжелым недугом. Наша редакция решила, что лучший способ почтить память доброго пастыря — это напомнить аудитории о разговоре с мудрым многолетним настоятелем Тихвинского храма.

Павел Павлов: «У любого народа есть свои апостолы. Вот и к кряшенам вера пришла не через князя, а через миссионеров, через апостолов, через посланников» Фото: Сергей Елагин

«К КРЯШЕНАМ ВЕРА ПРИШЛА НЕ ЧЕРЕЗ КНЯЗЯ, А ЧЕРЕЗ МИССИОНЕРОВ, ЧЕРЕЗ АПОСТОЛОВ»

— Павел әти (именно так обращаются кряшены к священникам — прим. ред.), наше интервью выходит в День Крещения Руси. А что этот праздник значит для православных кряшен?

— Вы знаете, есть такое священное предание и даже конкретный день, когда община и люди, которые в нее входили, были участниками этого события. Крестился князь Владимир, крестились высокопоставленные вельможи, славянская знать. Церковь с этим считается, а иначе откуда бы мы знали, что русской православной церкви более тысячи лет? Вот есть эта дата — 15 июля по юлианскому календарю, 28 июля по григорианскому.

Но что представлял собой славянский мир 10 веков назад? Это было одно из племен, выживавшее и только пробивавшее себе дорогу к славе. Тем не менее у этого племени, а потом у народа, в генетической, исторической и даже в литературной памяти это сохранилось, князь крестился и сказал: «Кто мне друг, тот пойдет за мной». Потому что князь Владимир в данном случае выступал как отец. Другое дело, что он не может выступать в роли отца к инородцам, для них он может быть только опекуном. Рассказывать о вере, показывать ее красоту. Однако в любом случае для славянского мира День Крещения Руси — это огромное событие.

— А для тюркского мира в целом и кряшен в частности?

— Для кряшен… В нашем случае не крещение князя Владимира имеет значение, а работы миссий, которые приходили сюда еще с VII века, во времена булгарских князей, из Антиоха (город в Древней Сирии, один из центров христианства, сейчас турецкая Антакья — прим. ред.) и из Константинополя. Причем это были официальные миссии, я не говорю о раскольниках, которые бежали от преследования, о монофелитах, монофизитах и прочих, они тоже создавали вокруг себя более или менее древние общины. Но я говорю о православных миссиях, которые имели конкретные адрес и цель — откуда они пришли, с какой задачей. И целью было не завоевание территории, а желание привести людей к богу, в данном случае к Христу. 

— Вы хотите сказать, что кряшены приняли православие раньше, чем крестили славян? Существуют две основные версии происхождения кряшен. Одни считают, что они появились после захвата Иваном Грозным Казани в 1552 году, и это татары, которые раньше были мусульманами. Другие придерживаются мнения, что кряшены приняли христианство еще при булгарах.

— Я второго мнения и придерживаюсь, потому что есть исторические книги, особенно тех специалистов, которые занимаются Востоком, Древней Сирией, сирийским православием, и в их работах все это ясно прослеживается. Если бы это было просто мое мнение, то оно ничего бы не значило, но об этом говорят крупные ученые. Да, приходили сюда на камскую землю…

Церковь не может быть не апостольской, то есть всегда должны быть те, кто проповедует идеи и ценности. У любого народа есть свои апостолы. Вот и к кряшенам вера пришла не через князя, а через миссионеров, через апостолов, через посланников. Вот церковь, допустим, кого-то рекомендует… К тем же славянам приходили, например, Кирилл и Мефодий, и к нам приходили. 

Да, у нас, может быть, растянулось на долгие века, потому что ни с кем не сравнишь деятельность Николая Ильминского (русский востоковед, педагог-миссионер — прим. ред.), который в XIХ веке со своей группой и с святителем Макарием Невским сделал для кряшен, для Казанского края в деле христианизации так много, что эта работа дала такой стержень крепкий. 

«В любом случае для славянского мира День Крещения Руси — это огромное событие» Фото: ©Игорь Онучин, РИА «Новости»

«ЕСЛИ НАШ ЯЗЫК ИЗ САКРАЛЬНОГО ПРЕВРАТИТСЯ  В БЫТОВОЙ, ПРОФАННЫЙ, ТО ОТ НЕГО НИЧЕГО НЕ ОСТАНЕТСЯ»

— Противники теории происхождения кряшен, которой придерживаетесь и вы, вспоминают что вся религиозная кряшенская терминология имеет исламскую основу. Бог — Аллах, ангелы — это  пирешта, производное от «фәрештә». 

— Аллах — ведь даже не арабское имя, оно, скорее всего, еврейское, общее Эль. Тем более Элохим — это множественное число. Потом, учитывая, что к нам это пришло из Сирии, а сирийские христиане на нашем же языке почти и говорили: «Элохим, что же ты оставил меня…» Очень похоже было, что корни-то одни, а «пирешта» — это персидское слово.

— И тем не менее отличия кряшенского языка от татарского очень незначительные. Например, «звезда» — не «йолдыз», а «жондыз»…

— Здесь не об орфографии идет речь, у нас ведь все имена под греческим даны , мы говорим: «Иисус Христос», — а не «Гайся». И не «Ибрахим», а «Авраам».

— А кряшен в принципе можно назвать религиозным народом? Что по этому поводу говорит история?

— Религиозный, религиозный. И это не я так считаю, так считают специалисты, такие как архиепископ Андрей Ухтомский — очень крупный специалист по миссионерской деятельности. Он считал, что среди поволжских народов кряшены — глубоко религиозный народ. Чичерина — известная путешественница — также отмечала в своих записях, что  религиозность кряшен на порядок выше, чем у удмуртов, например. Я сам встречался с удмуртскими батюшками, они говорили, что удмурты больше понимают по-кряшенски, чем на своем родном удмуртском языке.

— А сейчас продолжает ли православие оставаться важнейшим элементом идентичности вашего народа?

— Конечно, религия — везде. Даже возьмем грузинские племена: там в результате того, что страна находилась под властью Османской империи, образовались так называемые аджарцы. А какая разница между грузинами и аджарцами? Только религия!

«Религия — везде. А какая разница между грузинами и аджарцами? Только религия!» Фото: «БИЗНЕС Online»

— Гаяз Исхаки предсказал 100 лет назад, что через 200 лет татар может уже не быть. Кряшенам это не грозит?

— Нет таких опасений, потому что в русской православной церкви и на это обратили внимание — это многоязычная церковь, и наряду с церковнославянским здесь употребляются и языки местных племен. На Алтае, допустим, алтайский язык, якуты говорят на якутском, чуваши — на чувашском, а кряшены — на кряшенском. У нас в этом плане к тебе никто не будет лезть с вопросом: а на каком языке ты должен служить? Другое дело, если из этих народов никто не будет собираться к алтарю и не приносить свои молитвы на родном языке…

— То есть обрусение паствы все-таки чувствуется?

— Даже не обрусение, а скорее люди больше обращаются в татарскую среду. Теряют особенности нашего употребления. Если наш язык из языка сакрального превратится  в бытовой, профанный, базарный язык, то от него ничего не останется.

«ЕСЛИ БЫ БЫЛИ УСЛОВИЯ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ СВЯЩЕННИКОВ, МОЖНО БЫЛО БЫ ГОТОВИТЬ ПЕВЦОВ, ЧТЕЦОВ»

— Насколько в Татарстане созданы условия для развития кряшенской веры, культуры. Хотелось бы вам, чтобы по каким-то направлениям работа шла более интенсивно?

— Для того, чтобы мы как приход существовали, у нас все условия есть. Служить есть где, у нас больше 30 храмов, даже священников не хватает. Если бы были условия для подготовки священников, можно было бы готовить певцов, чтецов. Но надо заниматься этим, а так все есть. Каких-то особых условий ждать откуда-то не надо.

— Знаю, что есть проблема: нет священников, владеющих кряшенским церковным языком. Вынуждены в кряшенских приходах привлекать к работе попов, кто более-менее знает татарский.

— Проблема есть, конечно. Ведь любую интеллигенцию же надо воспитывать, начиная с семьи, со школы. Вот до революции была своя школа, она давала воспитанников в центральную кряшенскую школу, а оттуда они выходили либо учителями, либо священниками. А сейчас этого звена нет, по крайней мере у кряшен оно отсутствует.

— Какие у вас взаимоотношения с довольно активной кряшенской общиной Татарстана?

— Нормальные, но у нас нет общих мероприятий. Мы сами по себе проводим, они — сами по себе. В этом году, например, мы отпраздновали 150-летие нашей общины в Казани. Ей, начиная с Ильминского и отца Макария, действительно, уже полтора столетия стукнуло. Они пришли, поинтересовались, но никто не выступал. Даже не пришли из ИЯЛИ, хотя они же занимаются историей кряшен, нагайбаков…

— Нагайбаки, по-вашему, тоже кряшены?

— Кряшены, они себя и считают кряшенами, просто у них и второе имя сохранилось по месту расположения крепости. Это казачье сословие кряшен.

«Они плачутся: «Что будет, если кряшены потеряют свой татарский язык?..» А мы об этом не плачем. Просто каждый имеет свою задачу, поэтому они и считают, что Питрау — их праздник, светский» Фото: «БИЗНЕС Online»

— Как вы относитесь к Питрау, в народе больше известному как «кряшенский Сабантуй»? На днях известный артист Виталий Агапов заявил, что это светский праздник, на котором не место священнослужителям.

— У нас же два центра кряшенских, религиозный и светский, они тут рядом. Проблема в том, кто кого ведет. Они плачутся: «Что будет, если кряшены потеряют свой татарский язык?..» А мы об этом не плачем. Просто каждый имеет свою задачу, поэтому они и считают, что Питрау — их праздник, светский. Но, если в глубь посмотреть, Петров день связан все-таки с религией. Это же день смерти апостола, первого признанного ученика Иисуса Христа, поэтому и Питрау көне.

— Скоро нас ожидает всероссийская перепись населения, в Татарстане довольно распространено мнение, что выделение кряшен как отдельной этнической группы — это попытка разделения татар и уменьшения их численности. Что вы думаете об этом?

— Я придерживаюсь того, что мы все из булгар. От них отпочковались и чуваши, и кряшены, и татары. И финно-угры частично были связаны с булгарскими племенами. Что-то сохранилось, что-то не сохранилось. По языку булгары были ближе к чувашам, а по одежде, по культуре ближе к удмуртам. Это был непростой союз.

— Вы себя считает булгаром?

— Отцы наши булгары, себя мы считаем кряшенами. Мы не татары, даже такой ученый, как этнограф Николай Воробьев, который изучал кряшен в XX веке, писал, что мы стали таковыми, минуя ислам. Татар все-таки создала исламская религия, объединив вокруг Корана. Разные народы причем, ведь там и кряшены есть среди татар, целыми деревнями переходили в исламскую веру, по 30 деревень в год. И русские переходили, и мордва, а чуваши и марийцы — это вообще повально. Здесь чисто исторические вопросы.

Я рос в то время, когда и отец  у меня жив был, и мать; помню, как к нам обращались. Допустим, мы с работы идем, а там татар малае к отцу обращается: «Эй, дядяй, там». Отец остановится и говорит: «Какой я тебе дядяй, син бит татар». Если бы он еще правильно обращался, не «дядяй» сказал бы, а «агай»…. Потому что старшего ты должен звать агай, а энекәш — тот, кто меньше тебя по возрасту. 

— Но бытовых конфликтов на этой почве, национально-религиозной, не было?

— Нет, даже если человек переходил в другую веру, многие об этом даже и не знали.

«Митриполит Феофан искренний, как монах и как администратор, он ищет, как больше принести» Фото: «БИЗНЕС Online»

«…ПОТОМ ИЗ СТОРОЖА ПОЛКОВНИК СТАЛ СВЯЩЕННИКОМ: КОНЕЧНО, ЧЕЛОВЕК ЖЕ ГРАМОТНЫЙ, МОЖЕТ ПОТЯНУТЬ»

— С появлением митрополита Казанского и Татарстанского Феофана РПЦ все ярче себя проявляет в Татарстане. Владыка Феофан действительно такой крутой?

— О батюшке уж не говорят, что он «крутой»… Он искренний, как монах и как администратор, ищет, как больше принести. Это же не так просто, нужно не только быть начальником, но чтобы из этого вышла польза. Сейчас церковь как раз на это обращает внимание. Нынче время не разбрасывать, а собирать камни. Всех, кого можно объединить вокруг церкви, вокруг духовности, вокруг бога, нужно объединять. А чем можно объединить? Молитвой, любовью, добрыми делами. Я заболел, допустим, — мне помогли; кто-то заболел — тому помогли. Вот так мир идет, а церковь в этом плане свою социальную роль выполняет. Храмы, что строятся, не только за счет бюджета возводят; многие храмы — это благотворительность. Очень много меценатов и по сей день.

— Среди кряшен много меценатов?

— Есть, все наши храмы построены меценатами, кроме тех погоревших, — помните, была история с поджогами? Рустам Минниханов распорядился, чтобы эти храмы восстановить. А там из пяти пострадавших церквей большинство были кряшенские приходы.

— Среди самых известных меценатов-кряшен называют обычно главу «Ак Барс Холдинга» Ивана Егорова…

— Да, это так, но у него нет конкретного храма, а так он очень помогает. Кроме него, в селе Иванаево Рыбно-Слободского района есть один кряшен Баширов — строит церковь. В Кряш-Серде Николай Мухин был меценат, недавно умер…

— В целом, на ваш взгляд, как меняются роль и авторитет церкви в России? С одной стороны, ее традиционно называют среди тех социальных институтов, которым доверяют люди, с другой, много разговоров о роскошной жизни, которую ведут некоторые отцы церкви.

— Что там чужие деньги считать, если они есть. У кого их нет, у того их нет. Патриарх, к примеру, ведь на себя ничего не тратит: все, что он делает, — для церкви. Отец Дмитрий Смирнов говорил, что любая женская обитель хочет угодить патриарху своему тем, что шьет ему облачение и просто дарит. Что, патриарх Кирилл не должен в новом службу вести? Тем более сейчас такие возможности есть, компьютер все делает, всякие узоры на религиозную тему можно заказать…

— Охотно ли сейчас молодежь избирает церковь своим призванием?

— Я думаю, сейчас не очень охотно, сейчас нет такой героизации, что ли, когда священник был как учитель либо как такой подвижник или врач…

— В перестроечные времена многие тянулись в религию.

— Это было потому, что многих увольняли, люди стали  никому не нужны, вот они и устраивались при церкви. Был у нас полковник, он командовал в Сибири военной группировкой, их расформировали, сюда приехал — никуда на работу не берут. Он устроился простым сторожем в церковь. Потом из сторожа полковник стал священником: конечно, человек же грамотный, может потянуть. Были времена, когда церковь могла воспользоваться их знаниями. Но не все смогли остаться в церкви. 

«Сейчас нет такой героизации, что ли, когда священник был как учитель либо как такой подвижник или врач…» Фото: Сергей Елагин

«ТУДА 20 КИЛОМЕТРОВ ПЕШКОМ ИДЕШЬ, ОБРАТНО ПЕШКОМ — ТЕБЯ НИКТО НЕ ПОДБРОСИТ»

— Расскажите, как вы решили стать священником. Ведь это была эпоха развитого социализма, где для религии особого места не было.

— У нас в семье день всегда начинался с молитвы и кончался молитвой. Я себя не видел ни в какой иной роли. Помню, мы с отцом шли со службы, была Троица, или Жапрак-байрам, как у нас говорят, — участковый сделал замечание отцу, мол, ребенка к религии приобщаете, развращаете его. Отец сказал, что не считает это развращением, просто вместе в храм пошли. Туда 20 километров пешком идешь, обратно пешком — тебя никто не подбросит. Летом 10 километров из 20 можно доехать на трамвайчике водном. Мы так ходили на службу каждую субботу и воскресенье, ни одни выходные не пропускали. Ни буран, ни дождь не могли быть помехой.

— Это в назидание тем, кто, живя в Казани, жалуется, что не может к вам прийти в Старо-Татарскую слободу. Мол, далеко…

— Да, это так. А мы 20 километров ходили, считали, что это нормально, так и должно быть. Кто тебе в каждом дворе храм будет строить…

— Вы себя с детства видели именно кряшенским священником?

— Нет, в нашем приходе батюшка сам был чувашином, там и по-чувашски читали и пели, и на кряшенском, и на церковнославянском. Батюшка в этом плане был очень продвинутый. А так, что я буду кряшенским священником, таких мыслей не было. Я этого не понимал даже, а понял только, когда в семинарию поступил. Мне подарили образ Ильминского и говорят: вот, просветитель кряшен Ильминский. А я до этого даже не слышал о нем. С нами ведь никто просветительской работы не вел.

— Какой язык у вас был главным дома?

— По-русски мы даже в то время мало разговаривали. Даже с родителями. А в школу я ходил в русскую, у нас не было татарской. Я даже избегал татарской школы, мне казалось… Я всегда позиционировал себя как не татарина. Мне говорили: «Оставайся на ваш урок», — а я отвечал, что не татарин.

— Почему вы не захотели стать монахом, ведь считается, что тем самым человек больше посвящает себя богу?

— Желание было, наверное. Так сложилось, сейчас трудно сказать об этом. Потому что и обстоятельства так выстроились, и родители так хотели. У нас в семье патриархальное воспитание было. То, что скажет отец, то и выполняли.

— На какие деньги живет ваша церковь?

— Только на пожертвования — мы служим, ходим с тарелкой и собираем. Все это идет и на газ, и на содержание, на оплату. В некоторых церквях положение получше, у нас похуже.

«Наша церковь живет только на пожертвования —  мы служим, ходим с тарелкой и собираем» Фото: Сергей Елагин

— В русских церквях получше?

— Да, у нас похуже, потому что к нам только кряшены ходят. Один храм на весь город, добираться не так просто, а русские церкви ведь везде по городу. Это тоже имеет значение, не все до нас доезжают. К нам едут, скажем так, фанатичные кряшены.

— Много ли среди ваших прихожан тех, кто раньше был мусульманином, а потом принял христианство? Или, наоборот, кто-то из ваших прихожан перешел в ислам?

— Недавно мне одна кряшенская бабка про своего сына сказала, что он перешел в ислам. Что я мог ей сказать? Молись за него, он ведь крещенный человек, Ходай үзе акыл бирер, где лучше. Все-таки любой кеше өзли, где лучше. Бывают, девушки замуж за мусульман выходят. Я говорю, в этом вопросе должно быть понятие: в чем-то можно уступить, а в чем-то, наверное, не надо. Может быть, в вопросах веры нужно быть посерьезнее. Они говорят: «Нет, он меня любит». Так ведь женщины любят ушами. А потом начинается недопонимание, остается терпеть: а куда деваться? Сама же выбрала.

«ДАЖЕ ЕСЛИ ПОЛЬЗЫ ТЫ ОСОБОЙ НИКОМУ НЕ ПРИНЕС, ТО УЙТИ БЫ С МИРОМ»

— Батюшка, по-вашему, когда человек уходит из этого мира, что самое главное он оставляет после себя? И часто ли мы вспоминаем об этом в суете мирской жизни?

— Ничего не оставляет, потому что голым пришел, голым и уходишь отсюда. Если я буду думать, что моими плодами кто-то воспользуется… Хорошо, если воспользуются, а может быть, что и дети не воспользуются, а возможно, они даже пользу от этого не получат.  Говорится ведь: «Помни, последняя твоя и во веки не согрешишь» («Язык кылмас өчен, үзеңнең күчү вакытын истә гел тот»). Самый страшный грех — это грех, который разлучает нас с богом. Язык аркасында син Ходайны жугалтырга можешь.

Даже если пользы ты особой никому не принес, то уйти бы с миром. Чтобы никто бы на тебя не обижался, чтобы врагов не было, чтобы с богом было такое отношение, как с отцом небесным. А вот западная цивилизация учит нас обратному — что и смерти нет вроде, и жить надо как будто так, что умирать не надо. Умер — закопали, а для чего тогда жил, и не понял даже. Вот это плохое состояние.

«Если ты в Европе хочешь сделать карьеру, то объяви только, мол, я родился такой, у меня склонность к однополым отношениям… И тогда ты моментально взлетишь» Фото: Сергей Елагин

— На Западе сильны антиклерикальные настроения, в развитых странах число атеистов весьма высоко — скажем, в Швеции 85 процентов населения причисляют себя к безбожникам…

— Потому что западный христианский мир сейчас в глубоком кризисе. Всякие однополые браки распространены. Если ты в Европе хочешь сделать карьеру, то объяви только, мол, я родился такой — у меня склонность к однополым отношениям… И тогда ты моментально взлетишь. Всё сделают для твоего взлета, а это же против божеского закона: содомия, грех, который бог истребил через потоп, через серу. Ходай этого не терпит.

— Но ведь считается, что в странах с распространением протестантизма уровень жизни выше, чем в католических, тем более в православных странах.

— Протестанты, в отличие от православных, не признают тех, что ли, идеалов, о которых говорил Христос: «Блаженны нищие духом». «Ну, как ты можешь быть счастлив, когда у тебя ничего нет?» — думают они. Как так — ты плачешь, а счастлив… Протестантский мир этого не принимает. Само слово «протестантизм» —от «протест», это движение началось с бунта. Они взбунтовались на Библию, на Бога, на Христа и реформу провели, поэтому стараются любым методом стать успешным, добиться успеха. Но ты ведь все равно не сможешь стать успешным…

— То есть нельзя стремиться жить в хорошем доме, ездить на престижной машине?

— Стремиться можно, но это не главное.

— Владимир Познер заявил, что главной бедой России стало то, что она не выбрала протестантство. Сейчас была бы развитой страной…

— На тех, у кого бог Мамона, мы равняться не будем. Все-таки мы не должны стремиться к тому, чтобы обогащаться любыми путями — правдой или неправдой.

— Потому что за все придется держать ответ?

— Даже не потому, что за все нужно держать ответ: это ведь и опасно, не всякий человек может вынести. К примеру, скромный такой работяга — это одно состояние, а когда у меня все есть, тогда я могу сказать: «А зачем мне бог? У меня все есть, я и сам хороший». Вот к чему это все может привести. Поэтому в православии мы все-таки этого держимся: все пути, которые господь дал человеку, — это план, который мы должны реализовать. И не зря он дан. 

«Все пути, которые господь дал человеку, — это план, который мы должны реализовать. И не зря он дан» Фото: Сергей Елагин

«ИНОГДА НАС УПРЕКАЮТ ЛЮБИМЫЕ НАШИ ЖЕНЫ: «БОГ МЕНЯ ЛЮБИТ, А ТЫ МЕНЯ НЕ ЛЮБИШЬ…»

— Вы хотите сказать, что от богатства до безбожия всего один шаг?

— Да, именно так.

— А атеист может быть хорошим человеком?

— Атеист может быть порядочным человеком, но он никогда не будет святым. А что такое «святой»? С греческого переводится как внеземной, то есть не дорожит земными понятиями. Ну как Иоанн Кронштадтский — ему утром принесли облачения, какой-то бай пожалел его и решил подарить; смотрит — а уже вечером отец Иоанн опять в старом. Он уже кому-то подарил его. Вот такой должен быть человек — не прилепляться ни к чему материальному, потому что материальные вещи потом становятся твоими хозяевами. Они начинают тобой командовать. Сколько, допустим, мне ложек сахара  в чай положить — а уже рецепторы требуют повкуснее… Уже командуют, а так не должно быть.

Эго командует, а церковь как-то ограждает, ограничивает страсти, с ними борется через покаяние, через исповедь.

— А можно победить страсти?

— Своими силами нет, можно только с божьей помощью. И то это дается не всем. 

— Еще говорят, что бог отвернулся от России.

— Нет, бог никогда ни от кого не отворачивается. Ни от России, ни от Запада, даже сомалийцев бог не оставил. Одно дело, что спрос будет разный. Если у тебя религия шаманская, то что с тебя спросить-то.

— Есть у вас свой секрет счастья?

— Человеку многого не надо — нормальная семья, дети, служба, работа любимая. Вроде совсем немного надо, но это должно быть настоящее. Иногда нас упрекают любимые наши жены: «Бог меня любит, а ты меня не любишь…» А я хочу ответить: «Я больше Бога люблю, чем тебя». Ну обман же? Нет, конечно. Но любовь — это не каждый день цветы дарить. Это какой-то своей частичкой жертвовать для нее, внимание оказать, вовремя позвонить, что ты на работе задержался, сказать об этом: «Я останусь, ты не беспокойся». Из таких вот мелочей складывается счастье настоящее.

— А любить надо все-таки больше Бога?

— Да, но у нас это не получится…

— Можете назвать для себя главную проблему на данный момент?

— Проблем особых нет, а если и есть, то не считаю, что их надо озвучивать. Если же говорить о приходе, то его состояние зависит от того, какой батюшка: если он деятельный, то люди будут приходить.

(1811–1886)

Венгерский композитор, пианист, органист, дирижёр, музыкальный писатель, один из ведущих представителей позднего романтизма в музыке. Ученик К. Черни (фортепиано), А. Сальери и А. Рейхи (композиция). В 1823–35 гг. жил в Париже, в 1835–39 гг. в Швейцарии и Италии, в 1848–61 гг. в Веймаре, с 1861-го попеременно в Риме, Пеште (Будапеште) и Веймаре. С 1865 г. аббат.

Гастролировал во всех странах Европы (неоднократно бывал в России, в т.ч. в Москве в 1843 г. ). Создал новый фортепианный стиль, придав инструменту оркестровую мощь и красочность звучания, обогатил репертуар фортепиано, способствовал демократизации фортепианной игры, вывел её из салона в массовую аудиторию, в большой концертный зал. Возглавлял т.н. веймарскую школу.

В своих произведениях, многие из которых имеют литературно-сюжетную основу, стремился раскрыть внутреннюю связь музыки с поэзией. Автор ораторий («Легенда о Св. Елизавете», 1862; «Христос», 1866; легенда «Св. Цецилия», 1874 и др.), многочисленных сочинений для католической церкви (Хоральная месса, 1865; Венгерская коронационная месса, 1867; Реквием, 1868; гимн «Ave maris stella», 1865–68; хоры с органом), Симфонии к «Божественной комедии» Данте (1856), «Фауст-симфонии» по И.В. Гёте (1857), 13 одночастных симфонических поэм (создал этот жанр), 2 концертов (1856, 1861) и «Пляски смерти» (1859) для фортепиано с оркестром, песен. Им создан огромный массив фортепианных произведений: Фантазия-соната «После чтения Данте» (1839, вошла в цикл «Годы странствий», 1835–77), Соната си минор (1853), 19 венгерских рапсодий, Испанская рапсодия (1863), этюды (в т. ч. Большие этюды по каприсам Паганини, Этюды трансцендентного исполнения), вальсы (в т.ч. три «Мефисто-вальса», четыре «Забытых вальса»), вариации, многочисленные транскрипции (органной прелюдии и фуги ля минор И.С. Баха, симфоний Л. ван Бетховена, отрывков из популярных опер, в т.ч. «Марша Черномора» из оперы «Руслан и Людмила» М.И. Глинки) и др. Ему принадлежит значительный пласт сочинений для органа, среди которых Фантазия и фуга на тему хорала «Ad nos, ad salutarem undam» из оперы «Пророк» Дж. Мейербера (1850), Фантазия и фуга на тему B–A–C–H (1870). Им написано также множество литературно-публицистических сочинений о музыке и музыкантах (в т.ч. книга «Шопен»).

Ещё о русской локализации Cyberpunk

Я так или иначе перевожу игровой контент около 10 лет, поэтому хотелось бы немного разобрать локализацию Киберпанка — и возможные причины, которые привели к такой ситуации.
Сразу к делу: русская локализация плоха. Такое количество отсебятины в хорошем переводе просто недопустимо. Я изначально не стал играть с русской озвучкой, потому что у меня хорошее знание английского, но субтитры всегда оставляю родные — так привычнее. От количества мата мои глаза начали вытекать уже через пару часов. Он везде — в диалогах, в записках, в боевых фразах — и так далее. Причем и в английской озвучке русский мат, по какой-то неведомой мне причине, встречается повсеместно — то ли в Найт-Сити засилье русских иммигрантов, то ли что, но фразы в духе «Where are you, х**сос?» встречаются постоянно — и это очень странно.

С переводом ругательств вообще вышло очень любопытно — там, где их нет (и даже не предполагались) в оригинале, их полно в русской локализации. Там, где они есть, в переводе их зачастую нет.

А теперь к главному: да, в английской версии ругательств хватает, в том числе и грязных. Однако, во-первых, их там меньше в пару-тройку раз. Во-вторых слово «fuck» в английском языке гораздо менее табуированное и примерно равняется выражению «твою мать» в русском, а более грязные ругательства в духе «cunt» встречаются реже. Напихать в перевод кучу матов — это грубая некомпетентность людей, которые занимались переводом — или они недостаточно знают язык, или они сознательно занимались отсебятиной, при этом и тот, и другой вариант говорит о низком качестве итогового материала. Однако, тут есть один любопытный момент, о котором хотелось бы поговорить отдельно.

Русский язык с каждым годом становится грязнее. Мат все прочнее входит в обыденную речь абсолютно любых категорий людей в России. Его используют все — школьники, студенты, взрослые люди, женщины, мужчины — неважно, факт остается фактом. Гораздо сложнее найти человека, который не использует мат в речи, чем тех, кто его использует. «Великий и могучий» постепенно становится языком не эльфов, но орков — с огромным количеством заимствований, кучей матов и грубой речи. Да, его красоту еще можно увидеть в книгах, но в обычной речи он звучит совсем иначе.

Таким образом, локализация Киберпанка — это всего лишь продукт своего времени. Потому что на русском языке Найт-Сити звучал бы именно так, потому что русский язык в принципе сейчас используется именно так, и не среди криминальной среды, как в Найт-Сити, а среди обычных жителей нашей страны. Локализация, бесспорно, плохая. Но в то же время она *подходящая*, потому что сложно представить, что жители Найт-Сити общались бы на нашем языке иначе.

12 462 просмотров

Необычно долгая пауза, необходимая для регуляции Rho-зависимого терминатора транскрипции

Терминация транскрипции имеет решающее значение для точной экспрессии и регуляции генов. Бактерии используют два типа терминаторов транскрипции: внутренние терминаторы, которые диссоциируют комплексы транскрипции в отсутствие вспомогательных белков, и фактор-зависимые терминаторы, для которых требуется действие РНК-зависимой геликазы Rho (1). Rho ответственен за 20–50% событий терминации у Escherichia coli (2, 3) и выполняет ряд важных функций у бактерий.Помимо терминации транскрипции на концах оперонов (4), Rho направляет терминацию транскрипции в кодирующих областях, когда трансляция замедляется или останавливается, тем самым устанавливая полярность транскрипции (5), заглушает горизонтально приобретенную ДНК (3, 6), защищает хромосому от R- петли и двухцепочечные разрывы (7⇓ – 9) и подавляют всеобъемлющую антисмысловую транскрипцию (10).

Помимо этих общегеномных «домашних» функций, Rho также задействован для регуляции экспрессии специфических генов в ответ на сигналы (11).Давно установленные примеры включают Rho-зависимый терминатор, который контролирует экспрессию гена E. coli tnaA в ответ на доступность триптофана, и терминаторы, которые регулируют уровни мРНК rho в ответ на концентрацию белка Rho (12⇓⇓ – 15 ). Недавняя идентификация двух рибопереключателей и небольшой регуляторной РНК (sRNA), которые контролируют экспрессию генов путем модуляции Rho-зависимой терминации (11, 16, 17), теперь переориентировали внимание на Rho как на регуляторный фактор.Однако неясно, отличаются ли регулируемые Rho-зависимые терминаторы от тех, которые выполняют служебные функции.

Rho-зависимые терминаторы состоят из двух элементов: сайта утилизации Rho ( rut ) в формирующейся РНК и нижестоящей последовательности, которая индуцирует паузу в РНК-полимеразе (RNAP). АТФазная активность Rho стимулируется при связывании с сайтом rut , который управляет 5′-3′-транслокацией Rho вдоль РНК и тем самым позволяет Rho устанавливать взаимодействия с РНКП, которые приводят к прекращению транскрипции.Сайт паузы RNAP предоставляет Rho достаточно времени, чтобы «догнать» RNAP и прекратить транскрипцию в правильном месте (1, 18). Характеристики последовательностей обоих сайтов rut , которые имеют тенденцию быть C-богатыми, но не имеют четкой консенсусной последовательности, и сайты паузы, связанные с Rho-зависимыми терминаторами, остаются плохо определенными. Понимание регулируемых Rho-зависимых терминаторов особенно ограничено, потому что несколько Rho-зависимых терминаторов, которые были исследованы достаточно подробно, являются конститутивными терминаторами домашнего хозяйства или сильными терминаторами от бактериофагов (19⇓⇓⇓⇓-24).Кроме того, большая часть работ была сосредоточена на сайте rut , с меньшим вниманием к молекулярным детерминантам паузы RNAP в контексте Rho-зависимой терминации. Здесь мы анализируем компоненты последовательности, которые способствуют необычной паузе, необходимой для регулируемого Rho-зависимого события терминации.

Экспрессия гена-транспортера Mg ²⁺ mgtA из серовара Salmonella enterica Typhimurium регулируется рибопереключателем, чувствительным к Mg ²⁺ , который функционирует, модулируя активность Rho (17, 25).5′-лидерная область мРНК mgtA отвечает на внутриклеточные уровни Mg ²⁺ , принимая одну из двух взаимоисключающих конформаций (25) (рис. 1 A ). Высокое содержание Mg ²⁺ способствует конформации РНК (т. Е. Стержневым петлям A + B), которая позволяет Rho взаимодействовать с формирующейся РНК и прекращать транскрипцию в лидере mgtA . Напротив, в конформере, созданном в условиях с низким содержанием Mg ²⁺ (т. Е. Стебель-петля C), последовательности, необходимые для связывания Rho, изолированы, что предотвращает завершение транскрипции Rho и позволяет транскрипции продолжаться в кодирующей области mgtA . (17).Таким образом, рибопереключатель mgtA отличается от ранее описанных транскрипционно действующих рибопереключателей, которые обычно отвечают на связывание лиганда, формируя внутренний терминатор транскрипции (26).

Как и другие Rho-зависимые терминаторы, Rho способствует терминации транскрипции в сайте паузы RNAP в лидере mgtA (17). Теперь мы сообщаем, что эта пауза отличается от любой паузы, описанной на сегодняшний день, тем, что ( i ) она чрезвычайно долгожительна как in vitro, так и in vivo, и ( ii ) ее продолжительность больше при высоком содержании Mg ²⁺ условий, чем в условиях с низким содержанием Mg ²⁺ in vitro.Мы определили элементы последовательности, которые необходимы для длительной паузы, чувствительной к Mg ²⁺ , и показали, что длительная пауза необходима для высокого уровня Mg ²⁺ , чтобы способствовать Rho-зависимой терминации транскрипции в лидерной области mgtA in vivo. Наши результаты устанавливают ранее не идентифицированные молекулярные особенности, которые играют центральную роль в обеспечении регуляции генов через Rho-зависимую терминацию.

Результаты и обсуждение

RNAP делает паузы на необычно долгое время в

mgtA Leader in Vivo.

Rho-зависимая терминация транскрипции происходит в сайте лидера mgtA , где RNAP останавливается в отсутствие Rho (17). Исследования in vitro показали, что эта пауза расположена примерно на 220 нуклеотидов ниже места старта транскрипции и является нетипично долгоживущей (17). Чтобы определить, останавливается ли RNAP в этом месте in vivo, мы провели эксперименты по выявлению следов KMnO ₄ в WT Salmonella , несущую плазмидное слияние лидера mgtA с кодирующей областью lacZ под действием конститутивного p lac _1–6 промотор (27).Мы выбрали эту конструкцию, потому что она была широко охарактеризована in vivo (17, 25) и потому, что Mg ²⁺ не регулирует промотор p lac _1–6 .

KMnO ₄ позволяет обнаруживать ДНК, расплавленную внутри пузыря транскрипции, поскольку она преимущественно модифицирует нуклеотиды (особенно Т-остатки) в одноцепочечных областях ДНК. Такие модификации легче наблюдать, когда RNAP приостановлен, что дает дополнительное время для реакции расплавленной ДНК с KMnO ₄ (28).Мы обнаружили модификацию T212, T213, T218 и G219 в неэлементной цепи лидерной ДНК mgtA после обработки KMnO ₄ in vivo (рис. 2). Эти результаты согласуются с локализацией паузы, определенной in vitro (17, 25). Через 2 мин после лечения рифампицином, антибиотиком, ингибирующим повторную инициацию транскрипции, все еще обнаруживался сильный сигнал паузы. Напротив, у бактерий, несущих плазмиду с ap lac _1–6 -управляемое слияние последовательности паузы his с последовательностью паузы his , вокруг хорошо охарактеризованного сайта паузы his (29) не наблюдалась реакционная способность без промоторного гена lacZ (рис.2). Это отсутствие реактивности KMnO ₄ вероятно потому, что пауза his слишком коротка, чтобы ее можно было обнаружить с помощью этого анализа in vivo. Наши данные показывают, что продолжительность паузы mgtA намного больше, чем продолжительность паузы , его и, насколько нам известно, других естественных бактериальных пауз, обнаруженных in vivo (30–33).

Рис. 2.

Лидер mgtA содержит необычно долгоживущую паузу, которая может быть обнаружена in vivo. Анализ удлинения праймера плазмидной ДНК, экстрагированной из KMnO ₄ -обработанных WT Salmonella 14028s, несущих плазмиду с plac _1–6 -управляемое слияние либо WT mgtA лидера (pYS1010), либо лидера C196A. мутантный лидер mgtA (pYS10120) или последовательность паузы his (pYS10138) для гена lacZ без промотора.Бактерии обрабатывали KMnO ₄ в указанные моменты времени после добавления рифампицина для ингибирования повторной инициации транскрипции. Дорожки «CTAG» представляют реакции секвенирования ДНК, генерируемые с использованием того же праймера и плазмиды pYS1010 ( mgtA ) или pYS10138 ( his ) в качестве матрицы. Положения последовательностей пронумерованы относительно первого нуклеотида, транскрибируемого с p lac _1–6 (обозначено +1). Стрелки указывают расположение сайтов паузы mgtA и his , обнаруженных in vitro (рис.3 B и C ).

High Mg

²⁺ Увеличивает продолжительность долгой паузы в лидере mgtA .

Для количественной оценки кинетических параметров паузы mgtA мы провели однократные анализы транскрипции in vitro с использованием ДНК-матрицы, соответствующей лидеру mgtA , клонированному ниже конститутивного промотора λ P _R и C- меньше исходной транскрибируемой последовательности (ИТС) (рис. 3 , А ).Эта стратегия, которая широко использовалась для изучения транскрипционных пауз in vitro (29), позволила нам синхронизировать транскрипцию через лидер mgtA .

Рис. 3.

High Mg ²⁺ увеличивает продолжительность длительной паузы в лидере mgtA . ( A ) Схема ДНК-матриц, используемых для синхронизации комплексов элонгации транскрипции (ЭК) для анализов паузы in vitro. Лидер mgtA или последовательность паузы his клонировали ниже конститутивного промотора λ P _R (синий) и ITS из 26 нуклеотидов, в котором отсутствуют остатки C (зеленый).Инициация транскрипции в отсутствие CTP генерирует EC, остановившиеся после ITS (EC26), и последующее добавление всех четырех NTP позволяет транскрипции продолжаться в нижестоящей последовательности. Сайт начала транскрипции (+1) обозначен красной стрелкой. Показаны последовательности промотора λ P _R (с промоторными элементами -10 и -35, выделенными синим цветом) и ITS без C. ( B ) Транскрипция in vitro производных матрицы ДНК, представленной в A , содержащей либо полноразмерный лидер mgtA , либо нуклеотиды 126–264 лидера mgtA .Транскрипты анализировали через 0,5, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 30 и 60 мин после добавления всех четырех NTP к EC26. Гели калибровали с использованием реакций секвенирования РНК (GAUC). Черные стрелки указывают положения длинной паузы, чувствительной к Mg ²⁺ , в момент T218 и считываемого транскрипта. Серые стрелки указывают на более короткие паузы, нечувствительные к Mg ²⁺ , перед паузой T218. Период полураспада и эффективность паузы в позиции T218 показаны для каждого условия. ( C ) Транскрипция in vitro производных матрицы ДНК, показанной в A , содержащей либо лидерную последовательность mgtA из положений +126 до +264, либо последовательность паузы his .Транскрипты анализировали через 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 5, 7, 10 и 45 минут после добавления всех четырех NTP к EC26. Период полураспада и эффективность паузы в позиции T218 показаны для каждого условия.

Мы наблюдали долгоживущую паузу в положении T218 в лидере mgtA (рис. 1 A и 3 B ), что соответствует сайту, где транскрипция заканчивается в присутствии Rho (17). Этот результат согласуется с нашей предыдущей оценкой остановки RNAP около позиции 220 (17, 25).То, что пауза дает единственный сайт терминации транскрипции (17), является уникальной особенностью Rho-зависимой терминации в лидере mgtA , потому что Rho обычно прекращает транскрипцию в кластерах сайтов тандемной паузы для генерации продуктов РНК с гетерогенными 3′-концами (34 , 35).

Примечательно, что высокое содержание Mg ²⁺ увеличивало период полураспада паузы при T218: он был вдвое дольше в реакциях, проводимых при 3,5 мМ Mg ²⁺ , чем в реакциях, проводимых при 0,35 мМ Mg ²⁺ (Рисунок.3 В ). Это удлинение паузы особенно поразительно с учетом того, что Mg ²⁺ необходим для того, чтобы РНКП катализировала добавление нуклеотидов. Следовательно, можно было бы ожидать, что высокое содержание Mg ²⁺ будет иметь противоположный эффект, то есть способствовать более быстрому выходу из состояния паузы, а не фактическому увеличению продолжительности паузы. Влияние Mg ²⁺ на паузу РНКП отличается от его влияния на альтернативный фолдинг лидерной РНК mgtA , поскольку пауза, регулируемая Mg ²⁺ , все еще наблюдалась на матрице, в которой нуклеотиды 1–125 из Лидер mgtA был удален (рис.3 В ). Это усеченное производное лидера mgtA неспособно переключаться между конформерами стебель-петля A + B и стебель-петля C (25). Этот конформационный переключатель необходим для Mg ²⁺ , чтобы регулировать загрузку Rho на РНК (17) (Fig. 1 A ).

Большая продолжительность и чувствительность к Mg ²⁺ являются отличительными характеристиками паузы mgtA в позиции T218, поскольку период полураспада хорошо охарактеризованной паузы his был в 11 и 19 раз короче, чем у mgtA. пауза в низком и высоком Mg ²⁺ соответственно, и поскольку пауза his не реагировала на Mg ²⁺ в тех же условиях анализа (рис.3 С ). Кроме того, Mg ²⁺ не влиял на продолжительность ряда более коротких пауз, наблюдаемых у лидера mgtA (рис. 3 B ). В отличие от своего влияния на продолжительность паузы, Mg ²⁺ оказал лишь незначительное влияние на эффективность паузы T218 (то есть на долю молекул RNAP, которые переходят в состояние паузы), что было аналогично эффекту Mg ²⁺ от КПД его паузы (рис. 3 B и C ).

Взятые вместе, эти данные показывают, что лидер mgtA содержит паузу, которая отличается тем, что ( i ) она необычно долгоживущая, ( ii ) ее продолжительность увеличивается при высоком содержании Mg ²⁺ , и ( iii ) он обеспечивает единственный сайт терминации транскрипции в присутствии Rho.

РНК-последовательностей> 50 нуклеотидов перед T218 необходимы для высокого содержания Mg

²⁺ для продления паузы в лидере mgtA .

Пауза происходит, когда комплекс элонгации транскрипции претерпевает конформационные изменения, которые нарушают нормальный цикл добавления нуклеотидов.Пауза может быть вызвана элементами последовательности в матрице ДНК, зарождающимся транскриптом РНК и / или регуляторными белками, которые контактируют с комплексом элонгации (36). Поскольку длинная, чувствительная к Mg ²⁺ пауза в лидере mgtA может быть обнаружена в отсутствие вспомогательных белков in vitro (рис. 3 B ), она должна стимулироваться последовательностями ДНК или РНК в лидере. сам. Таким образом, мы стремились идентифицировать детерминанты последовательности, ответственные за эту необычную паузу.

Мы начали с серии делеций в начале лидера mgtA , чтобы выяснить, влияют ли вышестоящие последовательности на паузу (рис.1 А ). На паузу in vitro не повлияла делеция нуклеотидов 1–125 (фиг. 3 B и 4 A ). Однако делеция нуклеотидов 1–160 сокращала период полужизни паузы в 2,5 раза при высоком содержании Mg ²⁺ , но имела небольшой эффект при низком содержании Mg ²⁺ , что приводило к аналогичному периоду полужизни как при низком, так и при высоком содержании. Mg ²⁺ условия (рис. 4 A и рис. S1 A ). Делеция нуклеотидов 1–187 приводила к небольшому дополнительному уменьшению длительности паузы (рис.4 A и рис. S1 A ). Эти результаты предполагают, что некоторая последовательность между положениями 126 и 160 необходима для чувствительной к Mg ²⁺ паузы в лидере mgtA . Эта область несет последовательность, которая, как было показано ранее, принимает стебель-петлю РНК (стебель-петля B) в условиях высокого содержания Mg ²⁺ (25) (фиг. 1 A ). Мы определили, что стебель-петля B требуется для высокого уровня Mg ²⁺ , чтобы способствовать длительной паузе в лидере mgtA , потому что замена G138C, по прогнозам, разрушает стебель-петлю B, вдвое сокращает период полураспада паузы при высоком содержании Mg ²⁺ в условиях низкого содержания Mg ²⁺ (рис.4 B и рис. S1 B ). Более того, включение компенсаторной мутации C157G, которая восстанавливает способность образовывать «стебель-петля» B, восстанавливает долгоживущую паузу в условиях высокого Mg ²⁺ (рис. 4 B и рис. S1 B ). Мутации в стебле-петле B влияли на паузу T218, в частности, потому что они мало влияли на более короткие Mg ²⁺ -нечувствительные паузы ранее в лидере mgtA (Fig. S1 B ).

Фиг.4. Последовательности

РНК в лидере mgtA необходимы для длительной, чувствительной к Mg ²⁺ паузы. ( A ) Относительный период полужизни паузы T218, измеренный после транскрипции in vitro матриц ДНК, содержащих нуклеотиды 1-264, 126-264, 161-264 или 188-264 лидера mgtA при низком уровне (L, 0,35 мМ) или высокий (H, 3,5 мМ) MgCl ₂ . Периоды полураспада были нормализованы к периоду полураспада, измеренному с использованием нуклеотидной матрицы 126–264 при высоком содержании Mg ²⁺ .Данные представляют собой средние значения по крайней мере из трех независимых экспериментов, а столбцы ошибок показывают стандартное отклонение. Типичный гель из этих экспериментов показан на рис. S1 A . ( B ) Относительный период полужизни паузы T218, измеренный после транскрипции in vitro матриц ДНК, содержащих нуклеотиды 126–264 либо лидера WT mgtA , либо лидера mgtA , несущего указанные замены в стебле-петле B при низкий (0,35 мМ) или высокий (3,5 мМ) MgCl ₂ . Периоды полураспада в паузе были нормализованы к периоду полураспада, измеренному с использованием шаблона WT при высоком содержании Mg ²⁺ .Данные представляют собой средние значения по крайней мере из трех независимых экспериментов, а столбцы ошибок показывают стандартное отклонение. Типичный гель из этих экспериментов показан на рис. S1 B . ( C ) Относительный период полужизни паузы T218, измеренный после транскрипции in vitro матриц ДНК, содержащих либо полноразмерный лидер WT mgtA , либо производные, несущие указанные замены в шпильке P, при низком (0,35 мМ) или высоком (3,5 мМ) MgCl ₂ . Периоды полураспада в паузе были нормализованы к периоду полураспада, измеренному с использованием шаблона WT при высоком содержании Mg ²⁺ .Данные представляют собой средние значения трех независимых экспериментов, а полосы ошибок показывают стандартное отклонение. Типичный гель из этих экспериментов показан на рис. S1 C . ( D ) Относительный период полужизни паузы T218, измеренный после транскрипции in vitro матриц ДНК, содержащих нуклеотиды 126–264 либо лидера WT mgtA , либо производного, в котором шпилька P была заменена соответствующей шпилькой из его пауза. Периоды полураспада в паузе были нормализованы к периоду полураспада, измеренному с использованием шаблона WT при высоком содержании Mg ²⁺ .Данные представляют собой средние значения трех независимых экспериментов, а полосы ошибок показывают стандартное отклонение. Типичный гель из этих экспериментов показан на рис. S1 D .

Эти данные показывают, что стебель-петля B и, возможно, другие последовательности> 57 нуклеотидов выше сайта паузы способствуют длительной паузе в лидере mgtA при высоком содержании Mg ²⁺ . Насколько нам известно, это первый раз, когда было обнаружено, что РНК так далеко вверх по течению стимулирует паузу. Было показано, что элементы РНК в транскрипте putL бактериофага HK022 связывают РНКП и влияют на ее свойства удлинения.Однако в этом случае возникающая РНК подавляет, а не способствует, паузу в нижележащем сайте (37, 38). Примечательно, что в случае putL образование стебель-петли также необходимо для того, чтобы возникающая РНК влияла на паузу.

Последовательности после

mgtA Pause необходимы для перехода в состояние паузы.

Первый шаг в паузе включает перестройку активного сайта RNAP в конформацию, называемую «состоянием элементарной паузы», в котором затруднено включение поступающего нуклеотида в 3′-конец транскрипта (36, 39–41).Поскольку последовательности, расположенные ниже сайта паузы, могут оказывать влияние на вход в состояние элементарной паузы (42–44), мы проанализировали влияние мутаций ниже T218 на паузу в лидере mgtA in vitro. В соответствии с этой областью, способствующей переходу в состояние паузы, мутация последовательности GCCTG из положений 219–223, которая поразительно консервативна среди лидерных областей mgtA различных энтеробактерий (рис. 1 B ), практически устранила паузу в T218. (Рисунок.5). Эффект этих мутаций, по-видимому, обусловлен прежде всего заменой G-to-C в положении 219, потому что одной замены G219C было достаточно, чтобы резко снизить эффективность паузы in vitro (рис. 5). Этот результат согласуется с предыдущими открытиями в других местах паузы, где идентичность поступающего нуклеотида является важным детерминантом входа в состояние элементарной паузы (40, 45).

Рис. 5.

Последовательности после паузы необходимы для перехода в состояние паузы.Транскрипция in vitro производных матриц ДНК, содержащих либо полноразмерный лидер WT mgtA , либо производные с последовательностью GCCTG от +219 до +223, мутированные в CGGAC, или с одной заменой G-to-C в положении 219. Транскрипты были проанализированы через 0,5, 1, 2, 3, 5, 7, 10 и 45 мин после добавления всех четырех NTP к EC26. Стрелки указывают положения чувствительной к Mg ²⁺ паузы в T218 и считываемого транскрипта. Эффективность паузы в позиции T218 показана для каждого условия вместе с периодом полураспада паузы для шаблона WT.н / д, не применимо.

Шпилька РНК необходима для стабилизации приостановленной РНКП как при низком, так и при высоком содержании Mg

²⁺ .

Как только RNAP переходит в состояние элементарной паузы, комплекс элонгации транскрипции может подвергаться дополнительной реорганизации, чтобы генерировать более стабильные паузы (36). Одним из способов стабилизации этой паузы является образование шпильки в формирующейся РНК (45–49). Мы заметили, что лидерная РНК mgtA может образовывать шпильку со стеблем из 5 пар оснований, расположенным на 11 нуклеотидов выше сайта паузы T218 (рис.1 B и C ). Более того, способность образовывать шпильку в этой области лидерной РНК mgtA является консервативной среди других энтеробактерий (рис. 1 B и C ). Мы назвали эту шпильку «шпилькой П.».

Чтобы изучить роль шпильки P, мы отслеживали эффект нуклеотидных замен, которые, как ожидается, нарушат ее образование. Предполагается, что нуклеотид C196 будет образовывать пару оснований с G204 в стержне шпильки P (фиг. 1 A ). Замена C196A нарушает паузу на T218 in vivo, поскольку у мутанта C196A теряется реактивность KMnO ₄ в положениях T212, T213, T218 и G219 (рис.2). In vitro замена C196A уменьшала период полужизни паузы T218 в два раза при низком Mg ²⁺ и в три раза при высоком содержании Mg ²⁺ , тогда как мутация G204T уменьшала период полужизни в два и четыре раза при низком и высоком содержании Mg. Mg ²⁺ соответственно (рис. 4 C и рис. S1 C ). В обоих мутантах C196A и G204T высокий Mg ²⁺ не смог увеличить продолжительность паузы (фиг. 4 C и фиг. S1 C ). Чувствительная к Mg ²⁺ пауза была восстановлена ​​у двойного мутанта C196A G204T, который восстановил способность образовывать шпильку P (рис.4 C и рис. S1 C ). Мутации C196A и G204T (индивидуально и в комбинации) препятствовали паузе на T218, в частности, потому что они не влияли на короткую паузу ранее в лидере mgtA (рис. S1 C ). Эти результаты показывают, что образование шпильки P требуется для стабилизации паузы как при низком, так и при высоком содержании Mg ²⁺ , а также при высоком содержании Mg ²⁺ для увеличения продолжительности паузы.

Конфигурация последовательности пауз mgtA напоминает конфигурацию других хорошо охарактеризованных пауз, стабилизированных шпилькой (45–49).В частности, он поразительно похож на паузу his , которая также состоит из 5-нуклеотидной шпильки, расположенной на 11 нуклеотидов выше места паузы (46–48). Учитывая это сходство, мы исследовали, могут ли необычные свойства паузы mgtA зависеть от конкретных характеристик шпильки P или можно ли заменить шпильку P другой шпилькой для паузы. Следовательно, мы контролировали транскрипцию с использованием шаблонов ДНК, в которых нуклеотиды, определяющие шпильку P, были заменены нуклеотидами, кодирующими шпильку с паузой his .Замена шпильки P шпилькой his pause уменьшила период полураспада паузы в условиях высокого содержания Mg ²⁺ , но не оказала никакого эффекта в условиях низкого содержания Mg ²⁺ (рис. 4 D и рис. S1 ). D ). Этот результат показывает, что для продления паузы в лидере mgtA требуется некоторая отличительная особенность шпильки P, а не просто шпилька, стабилизирующая паузу, для высокого Mg ²⁺ .

A Модель для продолжительной, Mg

²⁺ — чувствительной паузы в mgtA Leader.

Мы предполагаем, что элонгация транскрипции через лидерную область mgtA нарушается входом комплекса элонгации транскрипции в состояние элементарной паузы, которое затем стабилизируется за счет образования шпильки P в формирующейся РНК (Рис. 6). Эти события, вероятно, происходят при низком и высоком Mg ²⁺ , потому что пауза имеет место и столь же стабильна, как и другие стабилизированные шпилькой паузы в обоих условиях (Рис. 3 C ). В этом отношении начальные стадии паузы в лидере mgtA аналогичны таковым, описанным для других пауз, стабилизированных шпилькой (36).Однако пауза mgtA , по-видимому, способна достичь еще более продолжительного состояния, которое мы называем «гиперстабильной» паузой (рис. 6). Это состояние не представляет собой «арестованный» транскрипционный комплекс, потому что RNAP может в конечном итоге выйти из состояния паузы и возобновить удлинение транскрипта в отсутствие других белковых факторов (фиг. 3 B ). Гиперстабильное состояние паузы, по-видимому, легче достигается при высоком уровне Mg ²⁺ , что приводит к удивительно долгой паузе (рис. 6).

Рис. 6.

Модель механизма пролонгированной Mg ²⁺ -чувствительной паузы в лидере mgtA . Во время элонгации транскрипции включение нуклеотида в 3′-конец растущей РНК сопровождается транслокацией вниз по течению РНКП, чтобы освободить активный центр для добавления следующего нуклеотида. Пауза происходит, когда комплекс элонгации транскрипции (TEC) претерпевает конформационные изменения, которые нарушают этот нормальный цикл добавления нуклеотидов. В лидере mgtA расположенные ниже последовательности ДНК вызывают конформационные изменения в TEC, которые ингибируют добавление нуклеотидов, заставляя RNAP входить в состояние «элементарной паузы» в положении T218.Это состояние элементарной паузы затем стабилизируется за счет образования шпильки P в формирующейся РНК. Формирование элементарных и стабилизированных шпилькой состояний паузы, по-видимому, происходит как в условиях с низким, так и с высоким содержанием Mg ²⁺ и аналогично другим паузам, стабилизированным шпилькой. Однако в условиях с высоким содержанием Mg ²⁺ последовательности РНК, расположенные выше по течению (включая, но, возможно, не ограничиваясь ими, стебель-петля B), способствуют уникальной «гиперстабильной» паузе в лидере mgtA , которая значительно дольше, чем любая пауза. описано ранее.Здесь показано, что стебель-петля B взаимодействует напрямую с RNAP, но она также может стабилизировать паузу, взаимодействуя с другими последовательностями РНК, участвующими в паузе. В соответствии с данными Weixlbaumer et al. (41).

Наши данные предполагают, что отдельные области лидерной последовательности mgtA обеспечивают различные стадии этого пути паузы (Рис. 6). Как и другие сайты паузы (40, 45), последовательность непосредственно ниже T218 (особенно G в положении 219), по-видимому, способствует вхождению RNAP в элементарное состояние паузы, поскольку мутации, которые изменяют эту последовательность, по существу отменяют паузу в T218 (Рис. .5). Образование шпильки P в формирующейся РНК способствует начальной стабилизации паузы, поскольку мутации, нарушающие шпильку P, сокращают общую продолжительность паузы как в условиях низкого, так и высокого уровня Mg ²⁺ (рис. 4 C и рис. S1 C ). ). Этот результат также перекликается с ролью шпилек РНК в других паузах, стабилизированных шпилькой, например, в лидерных областях оперонов Salmonella his , E. coli trp и Bacillus subtilis trp , где мутации, нарушающие шпильку, формирование также сокращает продолжительность паузы (45, 48, 49).Однако, в отличие от этих других пауз, последовательности РНК перед шпилькой P (особенно стебель-петля B), по-видимому, приводят к гиперстаблизации паузы mgtA в условиях с высоким содержанием Mg ²⁺ , потому что мутации, которые разрушают стебель-петлю B, предотвращают высокую Mg ²⁺ от увеличения продолжительности паузы, но не оказал никакого эффекта при низком содержании Mg ²⁺ (фиг. 4 B и фиг. S1 B ). Гиперстабилизация также, по-видимому, требует определенных последовательностей в шпильке P, поскольку замена этой шпильки шпилькой из паузы his специально уменьшала паузу при высоком содержании Mg ²⁺ (рис.4 D и рис. S1 D ).

Стебель-петля B и шпилька P могут вызывать гиперстабилизацию паузы при высоком содержании Mg ²⁺ множеством неисключающих друг друга способов. Например, Mg ²⁺ может влиять на способность этих элементов РНК взаимодействовать с РНКП способами, которые стабилизируют паузу. Альтернативно или дополнительно, Mg ²⁺ может контролировать способность этих последовательностей РНК взаимодействовать друг с другом и / или с другими сигналами, вызывающими паузу, в РНК.В любом из этих сценариев Mg ²⁺ может действовать либо путем стабилизации взаимодействий РНК-белок или РНК-РНК напрямую, либо путем изменения конформационного состояния РНК, чтобы способствовать или препятствовать таким контактам. Эти конформационные изменения будут отличаться от переключения стебель-петля A + B по сравнению с переключением стебель-петля C, ранее задействованным в контроле загрузки Rho (17), потому что пауза остается Mg ²⁺ -чувствительной даже в шаблонах, где этот переход не может иметь место ( Рис.3 B ).

Один из способов, с помощью которых стебель-петля B и шпилька P могут гиперстабилизировать паузу, — это взаимодействие «поцелуй» между их соответствующими петлями.Действительно, исследование лидерной последовательности Salmonella mgtA предполагает потенциальные взаимодействия при спаривании оснований, которые могут происходить между петлями стебель-петля B и шпилька P (Fig. S2 A ). Однако такое взаимодействие вряд ли может объяснить длительную, чувствительную к Mg ²⁺ паузу в лидере mgtA , поскольку предполагаемое взаимодействие не консервативно у других энтеробактерий (25) (рис. 1 B ), а также из-за мутаций в петлях стебель-петля B или шпилька P, которые, как предполагается, нарушают такое взаимодействие, мало влияют на транскрипцию (рис.S2 B и C ). Т.о., альтернативные взаимодействия РНК-белок или РНК-РНК, вероятно, необходимы для достижения гиперстабильной паузы в лидере mgtA .

Длительная пауза требуется для высокого содержания Mg

²⁺ , чтобы способствовать Rho-зависимому завершению в области лидера mgtA in Vivo.

Поскольку пауза T218 точно соответствует сайту, где транскрипция заканчивается в присутствии Rho, и поскольку Rho-зависимая терминация на этом сайте контролируется рибосвитчем, чувствительным к Mg ²⁺ (17), мы предположили, что необычный особенности этой паузы могут способствовать способности рибопереключателя mgtA контролировать элонгацию транскрипции в ассоциированную кодирующую область.Чтобы проверить это представление, мы исследовали влияние мутаций, которые нарушают паузу, на активность β-gal, экспрессируемую WT Salmonella , несущую плазмидное транскрипционное слияние между полноразмерным лидером mgtA и lacZ (управляемым p lac _{1–6 промотор} ) после роста при высоком или низком Mg ²⁺ в отсутствие или в присутствии Rho-специфического ингибитора бицикломицина (BCM) (50).

Во-первых, мутации ниже сайта паузы, препятствующие переходу в состояние паузы (рис.5) 10-кратное усиление активности β-gal при высоком содержании Mg ²⁺ , состояние, которое подавляет элонгацию транскрипции через лидер WT mgtA (фиг. 7 A ). Эффект этих мутаций наиболее выражен в клетках, выращенных в условиях с высоким содержанием Mg ²⁺ , потому что они проявляли меньший (менее чем трехкратный) эффект дерепрессии в условиях с низким содержанием Mg ²⁺ (фиг. 7 A ). Более того, он зависит от функционального белка Rho, поскольку мутации приводили только к примерно двукратной дерепрессии, когда бактерии выращивали в присутствии BCM (рис.7 А ). [Обратите внимание, что необходимо было использовать концентрацию BCM, которая допускала некоторую ограниченную Rho-зависимую терминацию транскрипции, потому что полное ингибирование Rho является летальным (51).] Эти данные показывают, что пауза сама по себе требуется для высокого Mg ²⁺ для стимулирования Rho-зависимая терминация в лидере mgtA .

Рис. 7.

Долгоживущая пауза необходима для высокого уровня Mg ²⁺ , чтобы способствовать Rho-зависимой терминации в лидере mgtA in vivo.( A ) Активность β-Gal, экспрессируемая WT Salmonella 14028s, несущая плазмиду с ap lac _1–6 -управляемое слияние лидера mgtA с без промоторного гена lacZ (pYS1010) или его производных pYS1010 с последовательностью GCCTG от +219 до +223, мутированной в CGGAC («пауза d / s»; pYS10150), замена C196A (pYS10120), шпилька паузы mgtA заменена шпилькой из his pause (« his шпилька »; pYS10176) или мутации в области« R1 »(pYS10116).Бактерии выращивали в N-минимальной среде с 10 мкМ (L) или 10 мМ (H) MgCl ₂ в отсутствие или в присутствии BCM. Показанные данные представляют собой средние значения по крайней мере из трех независимых экспериментов, а полосы ошибок представляют собой стандартное отклонение. ( B ) Активность β-Gal, выраженная WT Salmonella 14028s, несущая плазмиду с ap lac _1–6 -управляемое слияние лидера mgtA с lacZ (pYS1010) или производными, содержащими pYS10 мутации в области R1 (pYS10116), замены C196A (pYS10120) или того и другого (pYS10128).Термин «нет» соответствует данным для бактерий, несущих контрольную плазмиду pYS1000, которая содержит слияние lacZ , управляемое p lac _1–6 , без лидера mgtA . Бактерии выращивали на N-минимальной среде с 10 мМ MgCl ₂ . Показанные данные представляют собой средние значения из четырех независимых экспериментов, а столбцы ошибок представляют собой стандартное отклонение.

Примечательно, что эффект дерепрессии, вызванный мутациями, препятствующими вхождению в паузу, по крайней мере так же велик, как эффект мутаций в «области R1» (рис.1 A и 7 A ), которые снижают способность РНК взаимодействовать с Rho, но не влияют на паузу (17). Таким образом, пауза, по-видимому, так же критична, как и загрузка Rho для Rho для прекращения транскрипции в лидере mgtA .

Во-вторых, мутация C196A, которая сокращает продолжительность паузы как при низком, так и при высоком Mg ²⁺ (рис. 4 C ), увеличивала активность β-гал в 4,5 раза по сравнению с лидером WT mgtA , когда бактерии были выращены в условиях с высоким содержанием Mg ²⁺ , но оказывали меньший (примерно в два раза) эффект в условиях с низким содержанием Mg ²⁺ и / или когда Rho ингибировался обработкой BCM (рис.7 А ). Эти результаты показывают, что C196A специфически предотвращает высокое содержание Mg ²⁺ в стимулировании Rho-зависимой терминации в лидере mgtA . Вероятно, эффект замены C196A можно было бы приписать влиянию на способность РНК взаимодействовать с Rho, но это не так, потому что лидерная РНК mgtA с заменой C196A сохранила способность WT стимулировать АТФазу Rho. активность in vitro (рис. S3). Это мнение дополнительно подтверждается открытием того факта, что замена C196A действует синергетически с мутациями в области R1 [которые препятствуют загрузке Rho, но не влияют на паузу (16)], тем самым отменяя терминацию в лидере mgtA с высоким содержанием Mg. ²⁺ (рис.7 В ).

Наконец, замена шпильки P шпилькой из паузы his , которая предотвращает гиперстабилизацию паузы при высоком содержании Mg ²⁺ in vitro (рис. 4 D ), не повлияла на транскрипцию через лидер mgtA in vivo в тестируемых условиях (фиг. 7 A ). Этот результат свидетельствует о том, что, хотя длительная пауза требуется для высокого Mg ²⁺ , чтобы способствовать Rho-зависимой терминации в лидере mgtA , дополнительной гиперстабилизации паузы с помощью высокого Mg ²⁺ нет.Однако остается возможным, что восприятие Mg ²⁺ посредством паузы влияет на экспрессию генов в условиях, отличных от тех, которые были протестированы здесь.

Заключительные замечания.

Большинство Rho-зависимых терминаторов, охарактеризованных на сегодняшний день, либо завершают транскрипцию на концах оперонов и, следовательно, являются конститутивно активными (например, терминатор trp t ‘ниже оперона trp E. coli), либо участвуют в развитии бактериофага. и, таким образом, действовать по принципу «все или ничего» (e.g., терминатор tR1 от фага лямбда) (19⇓⇓⇓⇓ – 24). Напротив, для Rho-зависимых терминаторов, чтобы регулировать экспрессию генов в ответ на сигналы, их активность должна быть «тонко настроена» в ответ на колебания уровней сигналов. Таким образом, они, вероятно, полагаются на молекулярные детерминанты, отличные от детерминант, описанных для конститутивных Rho-зависимых терминаторов. Мы провели то, что, насколько нам известно, является первым детальным молекулярным вскрытием сайта паузы, который участвует в регулируемом Rho-зависимом событии терминации.Мы установили, что эта пауза является чрезвычайно продолжительной и что необычайная продолжительность паузы требуется для высокого Mg ²⁺ , чтобы способствовать Rho-зависимой терминации в лидерной области mgtA .

Почему регулирование Rho-зависимой терминации в лидере mgtA должно полагаться на такую ​​длительную паузу? По-видимому, это не является требованием, налагаемым регуляцией Rho-зависимой терминации с помощью рибопереключателя как такового, поскольку нет свидетельств такой длительной паузы в 5′-лидерной области E.coli ribB , который содержит флавин-мононуклеотид-чувствительный рибопереключатель, который также действует на Rho-зависимую терминацию (17). Вместо этого мы предполагаем несколько не исключающих друг друга объяснений. Во-первых, длительная пауза может предоставить дополнительное время для восприятия Mg ²⁺ аптамером рибопереключателя mgtA . Таким образом, рибопереключатель mgtA потенциально может управляться термодинамически (то есть за счет сродства РНК рибопереключателя к Mg ²⁺ ). Этот потенциал термодинамической регуляции отличается от большинства транскрипционно действующих рибопереключателей, которые, как правило, управляются кинетической конкуренцией между скоростью связывания лиганда и элонгацией транскрипции (52, 53).Во-вторых, длительная пауза может предоставить Rho дополнительное время для загрузки на лидерную РНК mgtA . Эта РНК, вероятно, является субоптимальным субстратом для Rho, потому что она высокоструктурирована, тогда как Rho обычно связывается с РНК, которые являются довольно одноцепочечными (1, 18). Таким образом, обеспечивая более длительное временное окно, в течение которого РНК может воспринимать Mg ²⁺ , и можно модулировать загрузку Rho на РНК, длинная пауза может действовать вместе с медленной загрузкой Rho, обеспечивая точную регуляцию Rho-зависимой терминации.

В-третьих, длительная пауза может дать время для восприятия дополнительных сигналов лидерной РНК mgtA . Например, лидер mgtA содержит короткую, богатую кодонами пролина ORF, названную mgtL , трансляция которой приводит к терминации транскрипции в лидере mgtA , способствуя образованию стебля-петли B (и, таким образом, предположительно способствует загрузке Rho) (54, 55). Считается, что ограничение пролина вызывает остановку рибосом в кодонах пролина в mgtL , что благоприятствует стебель-петле C и разрешает удлинение транскрипции в кодирующую область mgtA .Сигналы Mg ²⁺ и пролина действуют синергетически на лидерную РНК mgtA (54) и, по-видимому, влияют на одно и то же Rho-зависимое событие терминации, даже если трансляция mgtL будет перекрывать последовательности, необходимые для восприятия Mg ²⁺ . рибопереключателем (25). Длительная пауза может дать время для завершения трансляции mgtL , тем самым высвобождая РНК рибопереключателя для обнаружения внутриклеточных уровней Mg ²⁺ до того, как должно быть принято решение о прекращении транскрипции.

Необычайная долговечность паузы mgtA также может быть ответственной за то, что Rho направляет терминацию транскрипции в одном сайте. Это неортодоксальное поведение контрастирует с Rho-зависимыми терминаторами, описанными ранее, где терминация обычно происходит в серии более слабых сайтов паузы, разбросанных по области до ~ 100 нт (34, 35). Возможное объяснение единственного Rho-зависимого сайта терминации в лидере mgtA вызвано открытием того факта, что усеченная РНК, генерируемая посредством терминации транскрипции, управляемой рибосвитчем, может функционировать в транс- как мРНК (56).Таким образом, если продукт терминации транскрипции в лидере mgtA должен был действовать как мРНК (52), это могло бы потребовать, чтобы терминация генерировала единственный, определенный продукт РНК, а не набор молекул РНК с гетерогенными 3′-концами.

Материалы и методы

Бактериальные штаммы, плазмиды и условия роста.

Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице S1, а олигонуклеотидные праймеры перечислены в таблице S2. Детали плазмидных конструкций описаны в SI Materials and Methods .Бактерии выращивали либо в N-минимальной среде (pH 7,4) (57) с добавлением 0,1% казаминовых кислот, 38 мМ глицерина и указанной концентрации MgCl ₂ , либо в среде M9 (58), содержащей указанную концентрацию MgSO. ₄ . Хлорамфеникол (20 мкг / мл) добавляли для роста штаммов, содержащих производные плазмиды pYS1000.

In Vivo KMnO

₄ След.

In vivo KMnO ₄ footprinting проводили в соответствии с опубликованным протоколом (28) с некоторыми модификациями.Бактерии выращивали в течение ночи в среде M9, содержащей 1 мМ MgSO ₄ , дважды промывали средой M9 без MgSO ₄ и инокулировали 1: 100 в свежую среду M9, содержащую 10 мкМ MgSO ₄ . (Обратите внимание, что бактерии выращивали в среде M9 вместо N-минимальной среды, поскольку N-минимальная среда подавляла перманганат.) Культуры инкубировали в течение 3 часов при 37 ° C (OD ₆₀₀ ∼ 0,4) и образцы объемом 12 мл. затем обрабатывали 10 мМ KMnO ₄ в течение 2 минут при 37 ° C.Для контроля длительности паузы культуры инкубировали с рифампицином в дозе 0,2 мг / мл в течение указанного времени (0,5–5 мин) перед добавлением KMnO ₄ . После обработки KMnO ₄ культуры немедленно переносили в предварительно охлажденные центрифужные пробирки и помещали на лед. Клетки собирали центрифугированием, промывали 0,9% NaCl и снова осаждали. Плазмидную ДНК выделяли из осадка клеток методом кипячения (59). После осаждения изопропанолом осадки ДНК ресуспендировали в 600 мкл буфера Tris-EDTA (TE) и обрабатывали 1 мкл 20 мг / мл РНКазы A (Life Technologies) в течение 20 мин при 37 ° C.Затем плазмидную ДНК экстрагировали один раз фенолом, три-четыре раза фенолом / хлороформом / изоамиловым спиртом [25: 24: 1 (объем / объем / объем)] и один раз хлороформом / изоамиловым спиртом [24: 1 (объем / объем). )] перед осаждением этанолом и ресуспендированием в 30 мкл буфера ТЕ.

Для обнаружения модификаций KMnO ₄ реакции удлинения праймеров проводили с использованием 2 мкг плазмидной ДНК и 0,3–0,5 × 10 ⁶ имп / мин ³² P праймера 12901, меченного по концам, как описано (28).После осаждения этанолом продукты удлинения праймера ресуспендировали в 7 мкл нагружающего гель красителя [50 мМ ЭДТА, 80% (об. / Об.) Деионизированного формамида, 0,1% бромфенолового синего и 0,1% ксилолцианола FF]. Образцы нагревали в течение 2 минут при 90 ° C, а затем анализировали на денатурирующих 6% (об. / Об.) Полиакриламидных гелях для секвенирования (Ureagel; National Diagnostics). Гели калибровали с использованием реакций секвенирования ДНК, полученных с использованием праймера 12901 и набора для секвенирования ДНК Sequenase 2.0 (Affymetrix), в соответствии с инструкциями производителя.

Транскрипция in vitro.

Чтобы изучить паузу, мы адаптировали ранее описанные однократные тесты транскрипции in vitro (29). Были созданы линейные ДНК-матрицы, содержащие промотор λ P _R и 26-нуклеотидную ITS, клонированную перед WT или мутантными производными лидера mgtA или последовательности паузы his (рис. 3 A ). с помощью ПЦР с использованием праймеров W174 и W175 и плазмиды pKh200 или производных, несущих мутации в лидерной области mgtA (таблица S1).Мы использовали ранее описанные методы для очистки ядерных РНКП E. coli (60) и σ ⁷⁰ (61). Холофермент RNAP восстанавливали путем смешивания основного RNAP с двукратным молярным избытком σ ⁷⁰ и инкубирования в течение 20 минут при комнатной температуре. Комплексы элонгации транскрипции, остановившиеся в конце ITS (EC26), получали путем инкубации 50 нМ матричной ДНК, 60 нМ холофермента РНКП, 5 мкМ АТФ, 5 мкМ UTP, 1 мкМ GTP, 0,1 мкМ праймера РНК ApU и 0,2 мкКи / мкл. α ³² P-GTP в буфере для транскрипции [100 мМ KCl и 10 мМ Tris⋅HCl (pH 7.9)], содержащий 5 мМ MgCl ₂ и 1 ед. / Мкл SUPERaseIn (Life Technologies) в течение 15 мин при 37 ° C. Реакционные смеси очищали с использованием колонок Sephadex G-50, предварительно уравновешенных транскрипционным буфером, не содержащим MgCl ₂ , затем концентрацию MgCl ₂ доводили до 0,35 или 3,5 мМ. Транскрипцию инициировали добавлением всех четырех NTP до конечной концентрации 50 мкМ и рифампицина до 8 мкг / мл с последующей инкубацией при 37 ° C. Образцы отбирали в различные моменты времени и смешивали с равным объемом стоп-раствора [50 мМ ЭДТА, 80% (об. / Об.) Деионизированного формамида, 0.1% бромфенолового синего и 0,1% ксилолцианола FF]. Образцы ДНК анализировали на денатурирующих 6% (об. / Об.) Полиакриламидных гелях для секвенирования (Ureagel; National Diagostics) вместе с реакциями секвенирования РНК, приготовленными, как описано (62). Показанные гели представляют не менее трех независимых экспериментов. Период полураспада и эффективность паузы оценивали, как описано (29).

Анализ β-Gal.

Анализ

β-gal проводили, как описано (17).

Анализ АТФазы Rho.

РНК

, соответствующая WT или мутантным производным лидера mgtA , была синтезирована с помощью набора Megascript T7 (Ambion) в соответствии с инструкциями производителя с использованием шаблонов, управляемых промотором T7, созданных с помощью ПЦР с праймерами 6712 и 11882 и плазмиды pYS1010 (WT ), pYS10120 (C196A) или pYS10116 (мутант R1) в качестве матрицы.Активность Rho-АТФазы в присутствии различных РНК-субстратов измеряли, как описано (17).

Ученые разработали инструмент для наблюдения за транскрибированием отдельного гена в живой клетке

Сводка

Впервые исследователи SKI нашли способ заглянуть внутрь живых клеток и наблюдать транскрипцию генов, процесс, посредством которого ДНК копируется в информационную РНК.

Картинка стоит тысячи слов, по крайней мере, как говорится. Но сделать снимок чего-то настолько крошечного, что в масштабе отдельных молекул может быть довольно непросто.

Область структурной биологии предназначена для построения изображений очень и очень маленьких вещей. Но большинство методов, используемых структурными биологами для получения этих изображений, требуют, чтобы молекулы были заморожены в одном положении. Это затрудняет наблюдение за динамичными, меняющимися процессами, которые необходимы для жизни.

Впервые исследователи из Института Слоана Кеттеринга нашли способ заглянуть внутрь живых клеток и наблюдать транскрипцию генов. Это процесс, с помощью которого ДНК копируется в информационную РНК (мРНК), которая затем определяет, как создается белок.

«Транскрипция генов — один из самых фундаментальных процессов во всей биологии», — говорит структурный биолог SKI Александрос Перцинидис, старший автор исследования, опубликованного в Cell . «Мы знаем, что это строго регулируется и использует сложный молекулярный механизм. Возможность наблюдать за этим процессом — важный шаг вперед в понимании того, что происходит внутри клеток ».

По рецепту

Если вы думаете о генетическом коде как об универсальной кулинарной книге, содержащей все инструкции, необходимые для создания каждой части живого организма, вы можете думать о различных типах клеток как о разных ресторанах.- объясняет Перцинидис. «Французские рестораны следуют французским рецептам при приготовлении французских блюд, а итальянские рестораны следуют итальянским рецептам при приготовлении итальянских блюд», — говорит он. «Таким же образом клетки мозга производят белки, необходимые клеткам мозга для функционирования, а клетки печени производят белки для функционирования печени».

Транскрипция генов — один из самых фундаментальных процессов во всей биологии. Возможность наблюдать за этим процессом — важный шаг вперед в понимании того, что происходит внутри клеток.

Александрос Перцинидис структурный биолог

Семейство ферментов, называемых РНК-полимеразами, и большой набор связанных с ними факторов регулируют транскрипцию отдельных генов и контролируют характеристики, которые проявляют клетки. «Взаимодействие между РНК-полимеразами и регуляторными факторами помогает определить, какие гены включаются и выключаются в конкретных клетках», — говорит он. «Они также контролируют, как клетки реагируют на внешние сигналы, которые могут влиять на их деятельность.”

До сих пор функция РНК-полимераз и связанных с ними регуляторных факторов изучалась косвенно, посредством биохимических реакций: клетки вскрываются в пробирке и очищаются на отдельные части. Добавляя или удаляя компоненты и измеряя результаты, ученые смогли определить определенные молекулярные активности. Однако как машина в целом работает внутри ячеек, остается неясным.

«На протяжении 50 лет сотни исследователей по всему миру изучали эти реакции», — сказал д-р.- говорит Перцинидис. «Но проблема заключалась в том, что никто не мог напрямую наблюдать, как транскрипция генов происходит внутри живой клетки».

Вернуться наверх

Увеличение одного гена

В ходе исследования исследователи использовали высокоспециализированный оптический микроскоп, чтобы изучить активность одной РНК-полимеразы, называемой РНК-полимеразой II, когда она взаимодействует с генами и синтезирует мРНК. Новый метод, разработанный лабораторией доктора Перцинидиса, называется наноскопией одиночных молекул.

Программа структурной биологии

Наши исследователи посвящены пониманию биологии на структурном и механистическом уровнях, а также содействию разработке новых методов лечения рака.

Учить больше

Чтобы увидеть отдельные части клеток, исследователи маркируют молекулы флуоресцентной меткой, которая заставляет их светиться под микроскопом. «Но камера очень переполнена, и одновременно происходит множество реакций», — сказал доктор.- говорит Перцинидис. «Если вы пометите все полимеразы в клетке, все ядро ​​будет просто большим свечением.

«Новым в этой технологии является сверхчувствительная интегрированная система, которая позволяет нам увеличивать масштаб одного помеченного гена, даже когда ядро ​​клетки движется, а конкретное хромосомное местоположение колеблется из-за случайного микроскопического движения», — говорит он. «В то же время система подавляет сигналы от других происходящих реакций, отбрасывая их на задний план.Это позволяет нам извлечь сигнал только для интересующего гена и увеличить его ».

Организация и динамика РНК-полимеразы II в ядре были предметом интенсивных исследований в течение последних нескольких десятилетий. «Здесь мы непосредственно наблюдали активность этой молекулы и то, как она функционирует в ядре живых клеток», — говорит доктор Перцинидис. «Возможность увидеть, как он взаимодействует с другими регулирующими факторами, раскрыла сложные иерархии и взаимозависимости этих различных факторов.Эти идеи позволяют нам получить более подробную и полную картину транскрипции в живых клетках ».

Вернуться наверх

Расширение до других сотовых процессов

Исследователи надеются, что их инструмент будет широко использоваться для изучения сложных реакций внутри живых клеток.

«В нашей статье достаточно подробностей, чтобы другие лаборатории могли подобрать и внедрить технологию», — говорит д-р Перцинидис. «У нас также есть лаборатории как внутри, так и за пределами MSK, которые заинтересованы в сотрудничестве с нами по конкретным проектам.

Он добавляет, что, хотя он сосредоточен на понимании транскрипции генов, инструменты, разработанные его командой, можно использовать для изучения деталей других жизненно важных биологических процессов, таких как восстановление ДНК и синтез белка.

Вернуться наверх

Стенд для арахиса [текстовая транскрипция].

Библиотеке Конгресса не известно о защите авторских прав в США (см. Раздел 17, U.S.C.) или каких-либо других ограничениях на материалы в этой коллекции, за исключением случаев, указанных ниже.Пользователи должны помнить, что Библиотека Конгресса США предоставляет доступ к этим материалам исключительно в образовательных и исследовательских целях. Письменное разрешение владельцев авторских прав и / или других правообладателей (таких как права на гласность и / или неприкосновенность частной жизни) требуется для распространения, воспроизведения или иного использования защищенных объектов сверх разрешенного добросовестным использованием или других установленных законом исключений. Ответственность за проведение независимой юридической оценки предмета и получение всех необходимых разрешений в конечном итоге лежит на лицах, желающих использовать предмет.Дополнительную информацию и ограничения см. В наших Юридических уведомлениях и Правах на конфиденциальность и гласность.

Американский центр народной жизни и профессиональные работники на местах, выполняющие эти проекты, чувствуют серьезную этическую ответственность перед людьми, которых они посетили и которые согласились задокументировать свою жизнь для исторической записи. Центр просит исследователей подходить к материалам этой коллекции с уважением к культуре и чувствам людей, чьи жизни, идеи и творчество задокументированы здесь.Исследователям также напоминаем, что права на неприкосновенность частной жизни и гласность могут относиться к определенным видам использования этого материала.

Звукозаписи были собраны полевым исследователем, нанятым правительством США под эгидой WPA с 1938 по 1940 год (официальный проект Администрации хода работ, номер 665-08-3-30, блок A25). Транскрипции звукозаписей были подготовлены служащими правительства США. Вообще говоря, произведения, созданные государственными служащими США, не подпадают под защиту авторских прав в Соединенных Штатах.Однако обратите внимание, что опрошенные лица или лица, чьи слова были расшифрованы, не были служащими правительства США. Могут применяться права на конфиденциальность и гласность. Хотя Библиотека не осведомлена об авторских правах на материалы в этой коллекции, пользователи должны быть осведомлены о возможных правах, особенно в отношении основных произведений в звукозаписях.

Библиотека хотела бы услышать от людей или организаций, которые имеют информацию об этих материалах или дополнительную информацию об их истории.

Исследователи или другие лица, желающие в дальнейшем использовать эти коллекционные материалы, должны обратиться за помощью в Читальный зал народной жизни.

Кредитная линия

W.P.A. Коллекция Калифорнийского проекта народной музыки (AFC 1940/001), Американский центр народной жизни, Библиотека Конгресса

Быть долгожителем или недолговечным?

Гены часто представляют как бинарные акторы: включенные или выключенные.Однако такая простая точка зрения игнорирует тот факт, что активность генов, проявляемая их соответствующими белками, может варьироваться от едва заметного до нечеткого. Этот реостат-подобный диапазон частично связан с молекулярным контролем, который определяет, как долго инструкции по производству белка для любого данного гена — известные как информационная РНК (мРНК) — могут сохраняться до того, как будут уничтожены.

Теперь, в паре статей, опубликованных в Интернете в Molecular Cell , , член Института Уайтхеда Дэвид Бартель и его коллеги глубоко и систематически рассматривают динамику распада мРНК в тысячах генов.Их анализ — самый обширный на сегодняшний день — обнаруживает удивительную вариабельность в скорости, с которой концы (или «хвосты») мРНК укорачиваются. Кроме того, исследователи обнаружили связь между скоростью укорочения и тем, как быстро распадаются короткохвостые мРНК.

«В конечном счете, эта динамика отвечает за определение того, сколько мРНК присутствует для каждого гена, и это, конечно, действительно важно для определения идентичности клетки — например, является ли клетка злокачественной или нормальной, здоровой клеткой», — говорит Бартель, который также является профессором биологии Массачусетского технологического института и исследователем в Медицинском институте Говарда Хьюза.«Существует тысячекратная разница в том, как долго хранятся мРНК. Это очень сильно влияет на количество вырабатываемого белка ».

К глобальному взгляду на деградацию мРНК

Анатомия типичной мРНК состоит из трех ключевых частей: тела, которое содержит инструкции по производству белка; на одном конце цепочка из повторяющихся букв А, известная как поли (А) хвост; а на другом конце защитный биохимический колпачок.

До исследований Molecular Cell было известно, что будущее мРНК связано с длиной ее поли (А) хвоста — чем длиннее цепочка А, тем дольше мРНК имеет тенденцию сохраняться.Однако скорость, с которой хвосты укорачиваются с возрастом, а скорость, с которой мРНК распадаются, когда их хвосты становятся короткими, была известна лишь по горстке мРНК.

Чтобы получить более глобальную картину, Бартель и его команда, последней из которых руководил аспирант Тимоти Эйзен, объединили набор методов высокопроизводительного анализа мРНК. К ним относятся метод химической модификации мРНК по мере их производства, чтобы отличать вновь синтезированные мРНК от более старых, а также подходы на основе секвенирования для измерения как длины поли (A) хвостов, так и количества мРНК, которые был сделан недавно.Кроме того, Эйзен использовал вычислительные методы, чтобы моделировать собранные данные и делать прогнозы относительно них.

«Вся работа в этих статьях включает время как ось», — говорит Эйзен. «Сила нашего подхода в том, что он позволил нам построить график и визуализировать, как вещи меняются с течением времени, и сделать вывод для мРНК из тысяч генов, с какой скоростью укорачивается хвост и с какой скоростью разрушается мРНК».

Хвост виляет мРНК

Используя эти методы, Бартель, Эйзен и их коллеги исследовали динамику мРНК для тысяч генов.Одним из ключевых наблюдений является то, что мРНК проникают в цитоплазму с поли (A) хвостами различной длины. Эта изменчивость охватывает не только мРНК из разных генов, но даже те, которые соответствуют одному и тому же гену.

«Раньше не было никаких оснований полагать, что будут какие-либо различия, поэтому люди просто предполагали, что начальная длина хвостов будет одинаковой», — говорит Бартель. «Но оказывается, что здесь довольно много различий».

Команда Уайтхеда также обнаружила поразительное количество вариаций в скорости, с которой укорачиваются поли (А) хвосты.У некоторых мРНК хвост укорачивается со скоростью около 30 нуклеотидов в минуту. При средней длине хвоста около 200 нуклеотидов это соответствует длине хвоста всего несколько минут. Другие мРНК имеют гораздо более прочные хвосты со скоростью укорочения всего на один-два нуклеотида в час.

«Это разница в тысячу раз», — говорит Эйзен. Ранее исследователи показали, что скорость укорачивания хвоста может варьироваться, но они наблюдали только 60-кратную разницу.

Бартель и его коллеги также обнаружили некоторые поразительные различия между мРНК, когда их поли (A) хвосты стали короткими.«Если мы рассмотрим только те молекулы мРНК, которые имеют хвосты всего из 20 нуклеотидов, то молекулы, которые происходят от определенных генов, исчезают намного быстрее, чем те, которые происходят от других генов — опять же, охватывая тысячу раз», — говорит Бартель.

Это открытие ставит под сомнение устоявшиеся представления о стабильности мРНК, поскольку обычно считалось, что короткие хвосты равняются короткой жизни, и что все мРНК, хвосты которых были укорочены, распадаются с одинаковой скоростью. Но оказывается, что оба процесса важны: скорость, с которой хвосты мРНК укорачиваются (процесс, известный как деаденилирование), и скорость, с которой мРНК распадаются после этого укорочения.Более того, Бартель и его коллеги обнаружили, что эти два процесса взаимосвязаны — более быстро деаденилированные мРНК также быстрее деградируют, если у них есть короткие хвосты.

«Эта связь между скоростью распада мРНК с коротким хвостом и скоростью деаденилирования важна, потому что она предотвращает большое накопление короткохвостых версий мРНК, которые подверглись быстрому деаденилированию», — говорит Бартель. «Поскольку эти версии с коротким хвостом не накапливаются, наблюдаемая нами тысячекратная разница в скоростях деаденилирования может привести к тысячекратной разнице в стабильности мРНК.”

Прозрачный свет на микроРНК

MicroRNA — это небольшие регуляторные молекулы РНК, которые играют важную роль в биологии человека. Их основная задача — задействовать молекулярный механизм, который укорачивает поли (A) хвосты мРНК, тем самым ускоряя деградацию мРНК, что снижает активность генов.

Но что удивительно, когда Эйзен и его коллеги использовали свою элегантную систему для изучения активности микроРНК, оказалось, что эти регуляторные РНК полностью не изменяли хвосты своих мишеней — несмотря на то, что эти мРНК деградировали быстрее.

«Это заставило нас почесать головы в недоумении:« Как такое могло быть? »- добавляет Эйзен. «Уже довольно давно известно, что микроРНК действуют, влияя на длину поли (А) хвоста».

Команда решила посмотреть на динамику этого процесса, сосредоточив внимание на вновь сгенерированных мРНК. В этом контексте они заметили, что микроРНК ускоряют как укорочение хвоста мРНК-мишени, так и последующий распад этих мРНК, когда их хвосты становятся короткими. «Этот второй аспект активности микроРНК раньше не оценивался», — говорит Бартель.«Но это важная часть истории, потому что она помогает объяснить, почему мы не видим накопления короткохвостых мРНК».

Эти результаты, а также другие результаты, описанные здесь, значительно расширяют то, что известно о распаде мРНК и факторах, которые могут на него повлиять. Обладая этими расширенными знаниями, Бартель и его коллеги вместе с другими исследовательскими группами могут работать над раскрытием молекулярных компонентов и клеточного контекста, которые заставляют мРНК иметь такие радикально разные времена жизни.

***

Цитатов:

Eisen T, et al. Динамика метаболизма цитоплазматической мРНК. Молекулярная ячейка. Опубликовано онлайн 2 января 2020 г.

Eisen T, et al. МикроРНК вызывают ускоренный распад мРНК-мишеней с коротким хвостом. Молекулярная ячейка . Опубликовано онлайн 2 января 2020 г.

Утрачено при переводе и транскрипции | Виртуальные этнографические методы

Контекст

Для этого задания я взял интервью у своей бабушки, которую называли «Н», и спросил ее о ее / нашей семейной истории.Поскольку она говорит только по-русски, все интервью проводилось на русском языке (с некоторыми разбросанными по английски, которые мы оба понимали). Этот выбранный отрывок происходит через 50 минут после начала интервью. Текст в квадратных скобках используется для предоставления полезного контекста для того, о чем идет речь, а выделенные курсивом части текста — это комментарии моего партнера (Ионы), которые были предоставлены до того, как я объяснил свои отношения с моим информатором.

---

Интервью

K: Знаете ли вы слово [* по-английски *] «традиция»?

(Кристина разъясняет общий смысл центральной темы интервью, прежде чем продолжить.Мне интересно, что она спросила по-английски — возможно, английское слово передает определенное значение, которого нет в первом языке.)

N: Традиции?

K: Ваша семья больше чтит корейские традиции или больше советских / русских традиций?

(Хотя это закрытый вопрос, он все же имеет большую глубину. Хотя интервьюер мог просто ответить «корейский или советский / русский», они знали, как дополнительно объяснить ситуацию.Я думаю, что это был хороший начальный вопрос, чтобы задать здесь, потому что даже если бы собеседник ответил «корейский или советский / русский», Кристина могла бы легко задать дополнительные вопросы об обстоятельствах традиций.)

N: Произошло то, что мои родители уехали обратно в Россию. Поэтому, когда мы вернулись туда, мы жили среди русских. В России, где мы жили, корейцев было очень мало. Так что в нашей семье больше было русских традиций. Мы отличались от других наших родственников.Только отец решил вернуться в Россию. Все остальные члены моей большой семьи остались в Узбекистане. И когда людей одной национальности много, эти традиции остаются живыми. Как в Нью-Йорке, если вы поедете в Чайнатаун ​​- что там?

K: Это как Брайтон-Бич. [преимущественно русский / советский район в Бруклине; близко к тому месту, где мы будем]

(Хотя это всего лишь небольшой комментарий, Кристина проявляет внимание к разговору и помогает интервьюируемому уточнить их сравнение между своей семьей и другими людьми.)

N: Да, например, Брайтон-Бич или районы здесь, где есть группы узбеков или армян. Когда многие из них живут вместе, они продолжают придерживаться своих традиций. Но в нашей семье, поскольку мы жили изолированно, мы на самом деле этого не делали — вот почему мы не знаем языка [корейский] или чего-то еще * смеется *

K: Это напоминает мне о том, как мы живем в Америке сейчас, но мы все еще придерживаемся небольших традиций, например, когда мы отправляемся в путешествие, мы всегда садимся вместе прямо перед этим — понимаете?

(Кристина использует этот общий опыт для общения с интервьюируемым, и ее вклад делает интервью более похожим на естественный разговор.Однако одна проблема могла заключаться в том, что с этим комментарием Кристина отошла от темы семейной истории интервьюируемого и переключилась на настоящее. Возможно, можно было бы получить больше информации, если бы спросили больше о семейном анамнезе.)

N: Да. Но это потому, что, даже живя здесь, мы живем среди множества русских. А мы как русские дети.

K: Да, но мы с ними особо не разговариваем, и они не сидят с нами.Делаем сами…

(Здесь Кристина в некотором роде не согласна с интервьюируемым, что мне кажется интересным. Не соглашаясь, Кристина предлагает интервьюируемому высказать свое мнение о том, к какой культуре он больше причастен. Вопрос Кристины также указывает на более широкий вопрос: вы причастны культуры, если вы соблюдаете ее традиции, но не взаимодействуете с другими участниками этой культуры?)

N: Нет-нет, смотрите. Но мы по-прежнему соблюдаем русские традиции, вот в чем разница.Если бы мы жили в Узбекистане, как сестра моей матери и ее семья — они придерживались корейских традиций. Например, первые дни рождения. Или свадьбы. Для тех, у них есть корейская письменность и символы во время церемоний.

K: И они знают язык.

(Кристина подтверждает то, что ранее сказала собеседница, и с помощью этого небольшого комментария она может сместить линию мысли собеседника с традиций на язык, еще одну важную часть культуры.В общем, тема разговора постоянно менялась.)

N: Да, и они знают язык. Понимать? Все они разговаривают вместе, и хотя они могут не читать и не писать по-корейски, они говорят на нем.

K: А вы имеете в виду Олю [сестру моей матери]?

N: Ну, и она тоже. А в целом…

K: У мамы только одна сестра — Ой! Вы имеете в виду , сестру вашей матери ?

(Интересно, что Кристина использует слово «мама» для интервьюируемого и показывает, что она близка к двум.)

---

Отражение

Я нашел невероятно полезным выполнение этого упражнения с партнером и возможность обсудить их отзывы со мной. Иона указал на несколько вещей, о которых я не знал, например, когда я не соглашался (или, скорее, пытался прояснить ее точку зрения, возражая) с тем, что моя бабушка. Очевидно, я не думал об этом, пока мы с ней разговаривали. Я понял, что природа наших близких отношений сыграла огромную роль в моем общении с ней.Если бы я брал интервью у кого-то, с кем не был так близок или просто встречался, я бы больше осознавал свою речь и комфорт. Тот факт, что у меня и у моей бабушки схожая этническая и культурная история, я начал разговор, поделившись своим собственным опытом / пониманием некоторых вопросов, которые я был готов ей задать. Но Иона также отметил, что, по его мнению, мое удобство в общении с собеседником таким образом имело смысл и хорошо сработало для цели интервью. В конце концов, я считаю, что моя личная интуиция провела меня через большую часть интервью.Зная этого человека всю свою жизнь, я определенно чувствовал меньшее давление, чтобы задать изысканный вопрос или волноваться в ее присутствии.

Переписать это не только из речи в текст, но и с русского на английский было непросто. Когда я переводил, я знал, что не улавливаю ее голос в полной мере. Даже когда это был прямой перевод, словарный запас на двух языках неизменно имел разный вес. Например, когда моя бабушка говорит «Понятно?», Это очень разговорный тон, тогда как услышать, что говорят по-английски, кажется гораздо более жестким или даже немного снисходительным, в зависимости от того, как вы это читаете.

И последнее, что я хотел отметить, — это сбалансированность разговоров. Я выбрал эту часть интервью отчасти потому, что говорю немного больше, хотя даже тогда я говорю только для того, чтобы добавить детали или пояснения, а не вопросы, и я хотел показать это в целях этого упражнения с моим партнером. Во многих других частях, однако, моя бабушка берет бразды правления в свои руки и направляет повествование так, как ей нравится. Но я совсем не возражал! Одно из моих любимых качеств в ней — то, насколько она прекрасна рассказчиком (поверьте мне, когда я говорю, что ее слова звучат на ее русском языке лучше, чем на английском, я перевел их на ха-ха).Я обнаружил, что в течение полуторачасового одностороннего разговора мы ответили только на 4 из 13 подготовленных мною вопросов. Но все ее ответы были богаты деталями и предлагали новые подробности, о которых я даже представить не мог. Поэтому я могу утверждать, что глубина и актуальность информации, которую вы получаете во время интервью, в значительной степени зависят от вашего информатора. Хотя хорошо продуманные вопросы могут точно направлять беседу, я никогда не забуду задать бабушке закрытый вопрос, а затем получить сравнительный анализ дней рождения и метафору вождения в нетрезвом виде, которую однажды сказал ей начальник.И мой первоначальный вопрос, который не касался ни того, ни другого, все же получил прекрасный ответ и объяснение посреди всего этого.

Это вода Дэвида Фостера Уоллеса (Полная стенограмма и аудио)

Уоллес обращает внимание на нашу потребность управлять, а не устранять наши основные зашитые человеческие инстинкты.

Вот ссылки на исходное аудио, за которым следует вся речь.

«Приветствую родителей и поздравляю Кеньона с выпускным классом 2005 года. Эти две молодые рыбки плывут рядом, и они случайно встречают рыбу постарше, плывущую в другую сторону, которая кивает им и говорит:« Доброе утро, мальчики.Как вода? И две молодые рыбы плывут немного, а затем, в конце концов, одна из них смотрит на другую и спрашивает: «Что, черт возьми, такое вода?»

Это стандартное требование вступительных речей в США, использование небольших поучительных рассказов-притч. Сюжетная история оказывается одним из лучших, менее фиговых условностей жанра, но если вы беспокоитесь, что я планирую представить себя здесь как мудрую старую рыбу, объясняющую, что такое вода для вас, более молодая рыба, пожалуйста, не делайте этого. быть.Я не старая мудрая рыба. Суть истории о рыбах просто в том, что наиболее очевидные и важные реальности часто являются теми, которые труднее всего увидеть и о которых труднее всего говорить. Выражение в виде английского предложения, конечно, просто банальная банальность, но факт в том, что в повседневных окопах взрослого существования банальные банальности могут иметь значение жизни или смерти, по крайней мере, я хочу предложить вам в это сухое и прекрасное утро.

Конечно, главное требование к подобным выступлениям — это то, что я должен говорить о значении вашего гуманитарного образования, чтобы попытаться объяснить, почему степень, которую вы собираетесь получить, имеет реальную человеческую ценность, а не просто материальную выгоду.Итак, давайте поговорим о единственном наиболее распространенном клише в жанре вступительной речи: гуманитарное образование — это не столько наполнение вас знаниями, сколько «научить вас думать». Если вы похожи на меня в студенческие годы, вам никогда не нравилось это слышать, и вы, как правило, чувствуете себя немного оскорбленным заявлением о том, что вам нужен кто-то, чтобы научить вас думать, поскольку тот факт, что вас даже приняли в Такой хороший колледж кажется доказательством того, что ты уже умеешь думать.Но я собираюсь заявить вам, что клише гуманитарных наук оказывается вовсе не оскорбительным, потому что действительно важное мышление, которое мы должны получить в таком месте, на самом деле не связано со способностью думайте, а скорее о выборе того, о чем думать. Если ваша полная свобода выбора относительно того, о чем думать, кажется слишком очевидной, чтобы тратить время на ее обсуждение, я прошу вас подумать о рыбе и воде и всего на несколько минут отбросить ваш скептицизм по поводу ценности совершенно очевидного.

Вот еще одна поучительная история. Эти два парня сидят вместе в баре в отдаленной пустыне Аляски. Один из парней религиозен, другой атеист, и двое спорят о существовании Бога с той особой силой, которая возникает после четвертого пива. А атеист говорит: «Послушайте, у меня нет реальных причин не верить в Бога. Не то чтобы я никогда не экспериментировал с Богом и молитвой целиком. Буквально в прошлом месяце я попал в ту ужасную метель вдали от лагеря, я совершенно потерялся и ничего не увидел, а было 50 ниже, и я попробовал: я упал на колени в снег и воскликнул: «О, Боже, если есть Бог, я потеряюсь в этой метели и умру, если ты мне не поможешь.’И теперь в баре религиозный парень озадаченно смотрит на атеиста. «Что ж, тогда ты должен сейчас верить, — говорит он, — в конце концов, вот ты здесь, жив». Атеист просто закатывает глаза. «Нет, дружище, это всего лишь пара эскимосов, которая случайно прошла мимо и указала мне дорогу обратно в лагерь».

Легко провести эту историю с помощью своего рода стандартного гуманитарного анализа: один и тот же опыт может означать две совершенно разные вещи для двух разных людей, учитывая два разных шаблона убеждений этих людей и два разных способа конструирования смысла на основе опыта.Поскольку мы ценим терпимость и разнообразие убеждений, нигде в нашем гуманитарном анализе мы не хотим утверждать, что интерпретация одного человека верна, а другого — ложной или плохой. И это нормально, за исключением того, что мы также никогда не говорим о том, откуда берутся эти отдельные шаблоны и убеждения. То есть, откуда они, ВНУТРИ двух парней. Как будто основная ориентация человека на мир и смысл его опыта каким-то образом жестко запрограммированы, например, рост или размер обуви; или автоматически поглощается культурой, как язык.Как будто то, как мы конструируем смысл, на самом деле не было делом личного, преднамеренного выбора. К тому же здесь все дело в высокомерии. Нерелигиозный парень совершенно уверен в том, что отвергает возможность того, что проходящие мимо эскимосы имели какое-либо отношение к его молитве о помощи. Конечно, есть много религиозных людей, которые тоже кажутся высокомерными и уверенными в своих интерпретациях. Они, вероятно, даже более отвратительны, чем атеисты, по крайней мере, для большинства из нас. Но проблема религиозных догматиков в точности такая же, как и у неверующих в этой истории: слепая уверенность, ограниченность взглядов, которая равносильна тюремному заключению настолько тотальному, что заключенный даже не подозревает, что он взаперти.

Дело здесь в том, что я думаю, это одна из частей того, что на самом деле должно означать обучение меня мыслить. Чтобы быть чуть менее высокомерным. Чтобы иметь хоть немного критического осознания себя и своих убеждений. Потому что огромный процент вещей, в которых я склонен автоматически быть уверен, оказывается, совершенно неправильным и заблуждающимся. Я усвоил это на собственном горьком опыте, как и предсказываю, что вы, выпускники, тоже.

Вот лишь один пример полной неправильности того, в чем я склонен автоматически быть уверенным: все в моем непосредственном опыте поддерживает мою глубокую веру в то, что я являюсь абсолютным центром вселенной; самый настоящий, самый яркий и важный человек на свете.Мы редко задумываемся о подобном естественном эгоцентризме, потому что это отвратительно в социальном плане. Но это почти то же самое для всех нас. Это наша настройка по умолчанию, встроенная в наши платы при рождении. Подумайте об этом: нет никакого опыта, в котором вы не были бы абсолютным центром. Мир, каким вы его воспринимаете, находится перед ВАМИ или за ВАМИ, слева или справа от ВАС, на ВАШЕМ телевизоре или на ВАШЕМ мониторе. И так далее. Мысли и чувства других людей должны каким-то образом сообщаться вам, но ваши собственные настолько непосредственны, актуальны, реальны.

Пожалуйста, не беспокойтесь, что я собираюсь читать вам лекцию о сострадании или ином направлении или обо всех так называемых добродетелях. Это не вопрос добродетели. Это вопрос моего выбора — каким-то образом изменить или освободиться от моих естественных, жестко запрограммированных настроек по умолчанию, которые заключаются в том, чтобы быть глубоко и буквально эгоцентричным и видеть и интерпретировать все через эту призму себя. Людей, которые могут таким образом отрегулировать свои естественные настройки по умолчанию, часто называют «хорошо приспособленными», что, как я полагаю, не случайно.

Принимая во внимание триумфальную академическую обстановку здесь, возникает очевидный вопрос, какая часть этой работы по корректировке наших настроек по умолчанию связана с реальными знаниями или интеллектом. Этот вопрос становится очень сложным. Вероятно, самая опасная вещь в академическом образовании — по крайней мере в моем случае — это то, что оно дает мне возможность чрезмерно интеллектуализировать вещи, теряться в абстрактных спорах в моей голове вместо того, чтобы просто обращать внимание на то, что происходит прямо сейчас. передо мной, обращая внимание на то, что происходит внутри меня.

Как я уверен, вы, ребята, уже знаете, чрезвычайно трудно оставаться бдительным и внимательным, вместо того, чтобы быть загипнотизированным постоянным монологом в вашей собственной голове (который может происходить прямо сейчас). Спустя двадцать лет после своего выпуска я постепенно пришел к пониманию, что клише гуманитарных наук о том, как научить вас думать, на самом деле является сокращением для гораздо более глубокой и серьезной идеи: научиться думать на самом деле означает научиться в некоторой степени контролировать то, как и что ты думаешь.Это означает быть достаточно сознательными и осознанными, чтобы выбирать, на что обращать внимание, и выбирать, как вы конструируете смысл из опыта. Потому что, если вы не сможете осуществить такой выбор во взрослой жизни, вы окажетесь в полном изнеможении. Подумайте о старом клише о том, что «ум — отличный слуга, но ужасный хозяин».

Это, как и многие клише, такие неубедительные и неинтересные на первый взгляд, на самом деле выражают великую и ужасную правду. Совершенно не случайно взрослые, которые совершают самоубийство с применением огнестрельного оружия, почти всегда стреляют себе: в голову.Они стреляют в ужасного мастера. И правда в том, что большинство этих самоубийц на самом деле мертвы задолго до того, как нажмут на курок.

И я утверждаю, что это то, в чем должна заключаться настоящая, без всякой чуши ценность вашего гуманитарного образования: как удержаться от того, чтобы прожить свою комфортную, благополучную, респектабельную взрослую жизнь мертвым, бессознательным, рабом своей головы и ваша естественная установка по умолчанию — быть уникальным, полностью, имперски одиноким изо дня в день. Это может звучать как преувеличение или абстрактная чепуха.Давайте конкретизируем. Очевидный факт в том, что вы, выпускники старшего возраста, еще не понимаете, что на самом деле означает «день за днем». Так случилось, что есть целые, большие части взрослой американской жизни, о которых никто не говорит в вступительных речах. Одна из таких составляющих включает скуку, рутину и мелкое разочарование. Родители и пожилые люди здесь слишком хорошо знают, о чем я говорю.

В качестве примера предположим, что это обычный взрослый день, и вы встаете утром, идете на свою сложную работу белого воротничка, выпускника колледжа, и вы усердно работаете восемь или десять часов, а в конце дня вы устали и несколько нервничаете, и все, что вам нужно, это пойти домой, хорошо поужинать и, возможно, расслабиться в течение часа, а затем рано ложиться, потому что, конечно, вам нужно встать на следующий день и сделай все это снова.Но потом вы вспоминаете, что дома нет еды. У вас не было времени на покупки на этой неделе из-за сложной работы, поэтому теперь после работы вам нужно сесть в машину и поехать в супермаркет. Рабочий день подошел к концу, и пробок, скорее всего, будет: очень плохим. Так что добираться до магазина нужно дольше, чем следовало бы, и когда вы, наконец, добираетесь туда, супермаркет очень переполнен, потому что, конечно же, это время суток, когда все другие люди с работой также пытаются втиснуться в продуктовые магазины.Магазин ужасно освещен и наполнен убивающей душу музыкой или корпоративной поп-музыкой, и это в значительной степени последнее место, где вы хотите быть, но вы не можете просто войти и быстро выйти; вы должны бродить по запутанным проходам огромного, слишком освещенного магазина, чтобы найти то, что вам нужно, и вы должны маневрировать своей мусорной тележкой через всех этих усталых, торопливых людей с тележками (и так далее, и так далее, вырезая вещи, потому что это долгая церемония), и в конце концов вы получите все свои запасы для ужина, но теперь оказывается, что открытых касс не хватает, даже несмотря на то, что сейчас спешка в конце дня.Так что очередь у кассы невероятно длинная, что глупо и приводит в бешенство. Но вы не можете вынести свое разочарование из-за неистовой женщины, работающей в регистратуре, которая перегружена работой, ежедневная скучность и бессмысленность которой превосходит воображение любого из нас здесь, в престижном колледже.

Но в любом случае вы, наконец, дойдете до очереди к кассе, заплатите за еду, и вам скажут: «Хорошего дня» голосом, который является абсолютным голосом смерти. Затем вы должны забрать свои жуткие, хрупкие, пластиковые пакеты с продуктами в тележку с одним сумасшедшим колесом, которое безумно тянет влево, всю дорогу через переполненную, ухабистую, замусоренную парковку, а затем вам придется проехать всю путь домой через медленное, тяжелое, интенсивное движение внедорожников в часы пик и т. д. и т. д.

Конечно, все здесь сделали это. Но это еще не было частью повседневной жизни выпускников, день за неделей, месяц за годом.

Но будет. И еще много унылых, надоедливых, казалось бы, бессмысленных рутинных действий. Но дело не в этом. Дело в том, что такая мелкая, досадная чушь, как эта, как раз то, где нужно работать над выбором. Потому что пробки, многолюдные проходы и длинные очереди у кассы дают мне время подумать, и если я не приму осознанное решение о том, как думать и на что обращать внимание, я буду зол и несчастен каждый раз, когда мне придется делать покупки.Потому что моя естественная установка по умолчанию — это уверенность в том, что подобные ситуации действительно связаны со мной. О МОЕЙ голоде, МОЕЙ усталости и МОИМ желании просто вернуться домой, и всему миру будет казаться, что все остальные просто мешают мне. И кто все эти люди на моем пути? И посмотрите, насколько отталкивающими являются большинство из них, и насколько глупыми, коровьими, мертвыми и нечеловеческими они кажутся в очереди к кассе, или насколько раздражающим и грубым является то, что люди громко разговаривают по мобильным телефонам посреди зала. линия.И посмотрите, насколько это глубоко и лично несправедливо.

Или, конечно, если я в более социально сознательной форме гуманитарных наук по умолчанию, я могу проводить время в пробке в конце дня, испытывая отвращение ко всем огромным, глупым внедорожникам, блокирующим полосы движения. и Хаммеры и пикапы V-12, сжигающие свои расточительные, эгоистичные, 40-галлонные баки с бензином, и я могу остановиться на том факте, что патриотические или религиозные наклейки на бамперы всегда кажутся на самых больших и отвратительно эгоистичных автомобилях управляемые самыми уродливыми [отвечая здесь на громкие аплодисменты] — хотя это пример того, как НЕ думать — самые отвратительно эгоистичные автомобили, управляемые самыми уродливыми, самыми невнимательными и агрессивными водителями.И я могу думать о том, как дети наших детей будут презирать нас за то, что мы тратим впустую все топливо будущего и, возможно, испортили климат, и насколько мы все испорчены, глупы, эгоистичны и отвратительны, и как современное общество потребления просто отстой и т. и так далее.

Вы уловили идею.

Если я решу так думать в магазине и на автостраде, хорошо. Многие из нас так делают. За исключением того, что такое мышление обычно настолько легкое и автоматическое, что это не обязательно должно быть выбором. Это моя естественная настройка по умолчанию.Это автоматический способ, которым я переживаю скучные, разочаровывающие, переполненные части взрослой жизни, когда я действую на автоматическом, бессознательном убеждении, что я являюсь центром мира и что мои непосредственные потребности и чувства — вот что должно определять мир. приоритеты.

Дело в том, что, конечно, есть совершенно разные способы думать о подобных ситуациях. В этом потоке все эти автомобили остановились и остановились на моем пути, не исключено, что некоторые из этих людей во внедорожниках в прошлом попадали в ужасные автомобильные аварии, а теперь находят вождение настолько ужасным, что их терапевт почти приказал им огромный, тяжелый внедорожник, поэтому они могут чувствовать себя в достаточной безопасности за рулем.Или что Хаммер, который только что меня подрезал, может быть за рулем отца, чей маленький ребенок ранен или заболел на сиденье рядом с ним, и он пытается доставить этого ребенка в больницу, и он более и более законно спешит. чем я: на самом деле это Я ЕГО.

Или я могу заставить себя учитывать вероятность того, что всем остальным в очереди в кассу супермаркета так же скучно и расстроено, как и мне, и что у некоторых из этих людей, вероятно, более тяжелая, утомительная и болезненная жизнь, чем у меня.

Опять же, пожалуйста, не думайте, что я даю вам моральный совет, или что я говорю, что вы должны так думать, или что кто-то ожидает, что вы будете делать это автоматически. Потому что это сложно. Это требует воли и усилий, и если вы похожи на меня, в некоторые дни вы не сможете это сделать или просто категорически не захотите.

Но в большинстве случаев, если вы достаточно осведомлены, чтобы дать себе выбор, вы можете по-другому взглянуть на эту толстую, с мертвыми глазами, накрашенную даму, которая только что кричала на своего ребенка в очереди к кассе.Может, она обычно не такая. Может, она три ночи подряд не спала, держа за руку умирающего от рака костей мужа. Или, может быть, эта женщина — низкооплачиваемый клерк в автомобильном отделе, которая буквально вчера помогла вашей супруге решить ужасную, приводящую в ярость бюрократическую проблему с помощью небольшого акта бюрократической доброты. Конечно, все это маловероятно, но и возможно. Все зависит от того, что вы хотите учесть. Если вы автоматически уверены, что знаете, что такое реальность, и действуете со своими настройками по умолчанию, тогда вы, как и я, вероятно, не будете рассматривать возможности, которые не раздражают и не жалки.Но если вы действительно научитесь обращать внимание, тогда вы узнаете, что есть и другие варианты. На самом деле в ваших силах испытать переполненную, горячую, медленную ситуацию типа потребительского ада как не только значимую, но и священную, горящую той же силой, которая сотворила звезды: любовь, общение, мистическое единство всего сущего. в глубине души.

Не то чтобы эта мистика всегда была правдой. Единственное, что написано с заглавной буквы «Истина», — это то, что вы сами решаете, как вы собираетесь это увидеть.

Это, я полагаю, свобода настоящего образования, обучения тому, как быть хорошо приспособленным. Вы должны сознательно решать, что имеет значение, а что нет. Вы сами решаете, чему поклоняться.

Потому что есть еще кое-что странное, но верное: в повседневных окопах взрослой жизни на самом деле нет такой вещи, как атеизм. Нет такой вещи, как непоклонение. Все поклоняются. Единственный выбор, который мы получаем, — это чему поклоняться. И веская причина, по которой можно выбрать для поклонения какого-то бога или духовного существа — будь то JC или Аллах, будь то ЯХВЕ, или Викканская Богиня-Мать, или Четыре Благородные Истины, или какой-то нерушимый набор этических принципов — заключается в том, что почти все, чему вы поклоняетесь, съест вас заживо.Если вы поклоняетесь деньгам и вещам, если они являются тем местом, где вы обнаруживаете настоящий смысл жизни, тогда вам никогда не будет достаточно, никогда не почувствуете, что вам достаточно. Это правда. Поклоняйтесь своему телу, красоте и сексуальной привлекательности, и вы всегда будете чувствовать себя уродливо. И когда время и возраст начнут показываться, вы умрете миллионами смертей, прежде чем они наконец огорчат вас. С одной стороны, мы все это уже знаем. Это было систематизировано как мифы, пословицы, клише, эпиграммы, притчи; скелет каждой великой истории. Вся уловка заключается в том, чтобы держать истину в ежедневном сознании.

Поклоняйтесь силе, вы в конечном итоге почувствуете себя слабым и испуганным, и вам понадобится еще больше власти над другими, чтобы притупить собственный страх. Поклоняйтесь своему интеллекту, будучи умным, вы в конечном итоге почувствуете себя глупым, обманщиком, всегда находящимся на грани обнаружения. Но коварство этих форм поклонения не в том, что они злые или греховные, а в том, что они бессознательны. Это настройки по умолчанию.

Это вид поклонения, к которому вы постепенно, день за днем, постепенно погружаетесь, становясь все более и более избирательным в отношении того, что вы видите и как вы оцениваете ценность, даже не осознавая того, что именно вы делаете.

И так называемый реальный мир не помешает вам работать с настройками по умолчанию, потому что так называемый реальный мир людей, денег и власти весело гудит в луже страха, гнева, разочарования, страстного желания и поклонения самому себе. . Наша собственная нынешняя культура использовала эти силы способами, которые привели к необычайному богатству, комфорту и личной свободе. Свобода быть повелителями наших крошечных королевств размером с череп, в одиночку в центре всего творения. Такого рода свободу можно порекомендовать.Но, конечно, есть разные виды свободы, и о том, что наиболее ценно, вы не услышите много разговоров в большом внешнем мире желаний и достижений … Действительно важный вид свободы включает в себя внимание, осознанность и дисциплину, а также способность по-настоящему заботиться о других людях и каждый день жертвовать ради них бесчисленным множеством мелких, несексуальных поступков.

Это настоящая свобода. Это образование и понимание того, как думать. Альтернатива — бессознательное состояние, установка по умолчанию, крысиные бега, постоянное мучительное чувство того, что что-то было или потеряно, что-то бесконечное.

Я знаю, что этот материал, вероятно, не звучит весело, свежо или грандиозно вдохновляюще, как должна звучать вступительная речь. Насколько я понимаю, это правда с заглавной буквы «Т», в которой отброшено множество риторических тонкостей. Вы, конечно, можете думать об этом как хотите. Но, пожалуйста, не отвергайте это как просто занудную проповедь доктора Лауры. На самом деле все это не касается морали, религии, догм или больших причудливых вопросов о жизни после смерти.

Заглавная буква T Истина о жизни ПЕРЕД смертью.

Речь идет о реальной ценности настоящего образования, которое почти не имеет ничего общего со знаниями, а все связано с простым осознанием; осознание того, что так реально и важно, так скрыто у всех вокруг нас, все время, что мы должны постоянно напоминать себе:

«Это вода».

«Это вода».

Невообразимо трудно сделать это, оставаться в сознании и жить в мире взрослых изо дня в день.А это значит, что еще одно грандиозное клише оказывается верным: ваше образование — это действительно работа всей жизни. И это начинается: сейчас.

Желаю больше, чем удачи.

Слушайте стихи | Поэзия вслух

Этот аудиогид содержит выдающихся актеров и поэтов, читающих и говорящих о стихах. Слушайте эти треки, чтобы помочь вам или вашим ученикам овладеть искусством декламации.

«Jenny Kiss’d Me» BY LEIGH HUNT
Прочитано Кей Райан
Транскрипция

«Озерный остров Иннисфри» УИЛЬЯМ БАТЛЕР ЙИТС
Прочитано Энтони Хопкинсом
Транскрипция

«Мы носим маску» ПОЛ ЛОРЕНС ДАНБАР
Прочитано Ритой Дав
Транскрипция

«Пламя и лед» РОБЕРТ ФРОСТ
Прочитано Н.Скотт Момадей
Транскрипция

«Доброе утро» ДЖОН ДОНН
Прочитано Дэвидом Мейсоном
Транскрипция

«кто-нибудь жил в красивом городке» Э. Э. КАММИНГС
Прочитано Дэвидом Мейсоном
Транскрипция

«Пестрая красавица» Джерард Мэнли Хопкинс
Прочитано Кей Райан
Транскрипция

«Не уходи мягко в эту спокойную ночь» ДИЛАН ТОМАС
Прочитано Альфредом Молиной
Транскрипция

«С нами слишком много мира» УИЛЬЯМ ВОРДСВОРТ
Прочитано Анжелой Лэнсбери
Транскрипция

«Ферн-Хилл» ДИЛАН ТОМАС
Прочитано Энтони Хопкинсом
Транскрипция

«Озимандиас» ПЕРСИ БИШЕ ШЕЛЛИ
Прочитано Н.Скотт Момадей
Транскрипция

«Надежда — вещь с перьями» ЭМИЛИ ДИКИНСОН
Прочитано Дэвидом Генри Хвангом
Транскрипция

«В старости» УИЛЬЯМ БАТЛЕР ЙИТС
Прочитано Дайан Тиль
Транскрипция

«Дорога не пройдена» РОБЕРТ ФРОСТ
Прочитано Даной Джойа
Транскрипция

«Сонет 55» УИЛЬЯМ ШЕЙКСПИР
Прочитано Джеймсом Эрлом Джонсом
Транскрипция

«Когда я боюсь» ДЖОН КИТС
Прочитано Ритой Дов e
Транскрипция

«Дорогому и любящему мужу» ЭНН БРЭДСТРИТ
Прочитано Алиссой Милано
Транскрипция

«Думаю, я должен был полюбить тебя сейчас» ПО EDNA ST.ВИНСЕНТ МИЛЛЕЙ
Прочитано Алиссой Милано
Транскрипция

«Отложенная мечта (Гарлем)» ПО ЛЭНГСТОНУ ХЬЮЗУ
Прочитано Khandi Alexande r
Транскрипция

«Я слышу, как Америка поет» УОЛТ УИТМАН
Прочитано Ричардом Родригесом
Транскрипция

От «Аннабель Ли» ЭДГАР АЛЛАН ПОЭ
Прочитано Ханди Александр
Транскрипция

«Неизвестный гражданин» Автор W.H. AUDEN
Прочитано Альфредом Молиной
Транскрипция

«Минивер Чиви» ЭДВИН АРЛИНГТОН РОБИНСОН
Прочитано Дэвидом Мейсоном
Транскрипция

«Моя последняя герцогиня» РОБЕРТ БРАУНИНГ
Прочитано Альфредом Молиной
Транскрипция

«Пляж Дувра» МЭТЬЮ АРНОЛЬД
Прочитано Анжелой Лэнсбери
Транскрипция

«Тринадцать способов взглянуть на дрозда» УОЛЛЕС СТИВЕНС
Прочитано Н.