Слово болезнь разобрать по составу: Страница не найдена

Содержание

Слова «болезнь» морфологический и фонетический разбор

1. заболевание

2. бесплодие

3. ячмень

4. рак

5. гастрит

6. гепатит

7. грипп

8. депрессия

9. запор

10. ожог

11. перелом

12. язва

13. свищ

14. шпат

15. диабет

16. интоксикация

17. колит

18. невроз

19. нефрит

20. ожирение

21. оспа

22. остит

23. отек

24. отит

25. паралич

26. перикардит

27. плеврит

28. пневмония

29. полиомиелит

30. сепсис

31. сифилис

32. скарлатина

33. склероз

34. скорбут

35. спид

36. столбняк

37. табес

38. тахикардия

39. тиф

40. трахеит

41. трахома

42. тромбоз

43. тромбофлебит

44. туберкулез

45. туляремия

46. уретрит

47. фарингит

48. флебит

49. фурункулез

50. хлороз

51. цистит

52. шизофрения

53. экзема

54. энцефалит

55. эпилепсия

56. импотенция

57. акрофобия

58. абсцесс

59. амнезия

60. ангина

61. анурия

62. астма

63. близорукость

64. дерматофитоз

65. квартана

66. паратонзиллит

67. биссиноз

68. кардиомиопатия

69. ринит

70. дисбаризм

71. аэроэмболия

72. дисфазия

73. холера

74. актиномикоз

75. бластомикоз

76. дальнозоркость

77. кровоизлияние

78. неврит

79. недомогание

80. плоскостопие

81. пневмокониоз

82. пневмосклероз

83. пневмоторакс

84. психоневроз

85. радикулит

86. рахит

87. силикоз

88. слабоумие

89. эндартериит

90. энтероколит

91. эпидермофития

92. гиалит

93. тимпанит

94. рвота

95. нездоровье

96. эмболия

97. эмфизема

98. эндокардит

99. энтерит

100. энзоотия

101. гемофилия

102. саркома

103. атеросклероз

104. сколиоз

105. дизентерия

106. тетанус

107. тетания

108. насморк

109. склеродермия

110. анемия

111. хондрит

112. эпифитотия

113. астигматизм

114. кома

115. лепра

116. отолит

117. лимфогранулематоз

118. гломерулонефрит

119. спондилоартрит

120. зоб

121. зуд

122. сап

123. ирит

124. корь

125. круп

126. рожа

127. спру

128. угри

129. ушиб

130. чума

131. ящур

132. вывих

133. грыжа

134. икота

135. ищиас

136. киста

137. проказа

138. лишай

139. микоз

140. миома

141. озена

142. парез

143. парша

144. понос

145. хорея

146. цинга

147. абулия

148. апатия

149. артрит

150. атония

151. афазия

152. диатез

153. ишемия

154. кашель

155. коклюш

156. лейкоз

157. липома

158. мастит

159. миопия

160. пиелит

161. психоз

162. сепсиз

163. энурез

164. цирроз

165. агнозия

166. астения

167. бронхит

168. вагинит

169. водянка

170. гонорея

171. желтуха

172. инсульт

173. инфаркт

174. истерия

175. кератит

176. коллапс

177. кольпит

178. малярия

179. миалгия

180. мигрень

181. обморок

182. оофорит

183. опухоль

184. орнитоз

185. паратиф

186. перхоть

187. подагра

188. проктит

189. псориаз

190. себоррея

191. синовит

192. чесотка

193. аллергия

194. алопеция

195. облысение

196. блефарит

197. витилиго

198. гайморит

199. гангрена

200. гематома

201. геморрой

202. гингивит

203. глаукома

204. дерматит

205. дифтерия

206. дуоденит

207. заикание

208. импитиго

209. кандидоз

210. краснуха

211. ларингит

212. лямблиоз

213. меланома

214. менингит

215. миелемия

216. паранойя

217. пеллагра

218. почесуха

219. стоматит

220. судорога

221. токсикоз

222. флегмона

223. аневризма

224. бешенство

225. бруцеллез

226. гипотония

227. диспепсия

228. дистрофия

229. катаракта

230. кретинизм

231. лихорадка

232. миастения

233. молочница

234. невралгия

235. панариций

236. папиллома

237. перитонит

238. пиодермия

239. пролежень

240. пролежни

241. простатит

242. ревматизм

243. тонзиллит

244. авитаминоз

245. алкоголизм

246. аппендицит

247. бессонница

248. гельминтоз

249. гемикрания

250. гипертония

251. дискинезия

252. ипохондрия

253. косоглазие

254. крапивница

255. лейкопения

256. лейшманиоз

257. лимфаденит

258. панкреатит

259. пародонтоз

260. периартрит

261. холецистит

262. контрактура

263. конъюнктивит

264. лимфолейкоз

265. нарколепсия

266. неврастения

267. олигофрения

268. остеомиелит

269. пиелонефрит

270. пилороспазм

271. спазмофилия

272. стенокардия

273. тромбангиит

274. галлюцинация

275. дисбактериоз

276. паркинсонизм

277. трихомонадоз

278. гиповитаминоз

279. головокружение

280. головня

281. пинта

282. психастения

283. пиемия

284. пиорея

285. наркомания

286. дифтерит

287. золотуха

288. короста

289. лейкемия

290. недуг

291. полиартрит

292. слоновость

293. типун

294. триппер

295. трихиноз

296. финноз

297. шанкр

298. эпизоотия

299. бронхоэктаз

300. меркулиализм

301. эктима

302. бронхоэктазия

303. дерматоз

304. акромегалия

305. аэрофобия

306. акинезия

307. алексия

308. сидероз

309. холемия

310. клаустрофобия

311. септицемия

312. вертячка

313. параплегия

314. антракс

315. афония

316. апоневроз

317. каталепсия

318. кататония

319. антракоз

320. кала-азар

321. фолликулит

322. абазия

323. агорафобия

324. акрокефалия

325. акроцефалия

326. амебиаз

327. аменорея

328. аметропия

329. анкилоз

330. анкилостомоз

331. аноплоцефалоз

332. аноплокефалоз

333. аносмия

334. аортит

335. арахноидит

336. артериит

337. артериосклероз

338. артритизм

339. аскаридоз

340. астазия

341. асцит

342. атаксия

343. ахилия

344. бери-бери

345. блекрот

346. бленнорея

347. ботриомикоз

348. бронхоаденит

349. везикулит

350. лимфогрануломатоз

351. гоноррея

352. гастроэнтерит

353. аменция

354. глоссит

355. гонит

356. зооноз

357. инвазия

358. ихтиоз

359. кардиосклероз

360. коксит

361. кокцидиоз

362. коллагеноз

363. белокровие

364. лептоспироз

365. лимфангит

366. лимфангоит

367. люпус

368. волчанка

369. люэс

370. мастоидит

371. миаз

372. миелит

373. милдью

374. миозит

375. невропатия

376. нефроз

377. нефролитиаз

378. нефросклероз

379. нозематоз

380. нома

381. оидиум

382. онихия

383. ногтоеда

384. остеомаляция

385. отосклероз

386. пандемия

387. панзоотия

388. паннус

389. параметрит

390. паранефрит

391. парестезия

392. паротит

393. пахидермия

394. пебрина

395. педикулез

396. пемфигус

397. периостит

398. пиоррея

399. пироплазмоз

400. плевропневмония

401. полиневрит

402. полиоэнцефалит

403. пресбиопия

404. птоз

405. пульпит

406. риккетсиоз

407. риносклерома

408. склерома

409. сальпингит

410. цынга

411. скрофулез

412. спондилит

413. тимпиания

414. тифлит

415. тифоид

416. трипаносомиаз

417. трихинеллез

418. трихофития

419. трофоневроз

420. уртикария

421. фитофтора

422. фронтит

423. немочь

424. циклотимия

425. цистицеркоз

426. экзантема

427. эклампсия

428. элефантиаз

429. энантема

430. эндометрит

431. энтероптоз

432. эпидидимит

433. амавроз

434. амебоз

435. амфиартроз

436. анасарка

437. аспергиллез

438. столбур

439. брадзот

440. гнилец

441. ценуроз

442. строфулус

443. гидрартроз

444. гидроцефалия

445. гидроторакс

446. акариоз

447. паратуберкулез

448. лордоз

449. никталопия

450. омфалит

451. орхит

452. остеоартрит

453. остеопатия

454. остеосаркома

455. бугорчатка

456. периневрит

457. перозис

458. колтун

459. трипанозомоз

460. уретерит

461. ревмокардит

462. альгодисменорея

463. вагинизм

464. вагодиния

465. вульвизм

466. гидраденит

467. метрит

468. парапроктит

469. парасифилис

470. пердунец

471. фимоз

472. виброболезнь

473. немощь

474. хворь

475. хворость

476. лейкоцитоз

477. парадонтоз

478. пародонтит

479. флеботромбоз

480. брадикардия

481. жемчужница

482. куриная слепота

483. пуллороз

484. хвороба

485. кавернит

486. свинка

487. простуда

488. табопаралич

489. чумка

490. ихтиофтириоз

491. кампилобактериоз

492. кила

493. кетоз

494. кладоспориоз

495. клястероспориоз

496. криптококкоз

497. мелофагоз

498. метастронгилез

499. миксоматоз

500. мыт

501. мониезиоз

502. монилиоз

503. нигроспороз

504. некробактериоз

505. параскаридоз

506. парафиляриоз

507. пассалуроз

508. пастереллез

509. периодонтит

510. пероноспороз

511. пирикуляриоз

512. пироплазмидоз

513. полиморфоз

514. полиспороз

515. псевдочума

516. протозооз

517. психогения

518. псороптоз

519. пуллороз-тиф

520. ржавчина

521. ризоктониоз

522. ретинопатия

523. ринопневмония

524. розеточность

525. рябуха

526. сапролегниоз

527. сенториоз

528. сетариоз

529. сикоз

530. кахексия

531. склерит

532. склеротиниоз

533. сингамоз

534. скрейпи

535. боррелиоз

536. стрик

537. спирохетоз

538. стафилококкоз

539. стрептококкоз

540. телязиоз

541. тениидоз

542. тизаниезиоз

543. тиреотоксикоз

544. токсаскаридоз

545. токсокароз

546. фузариоз

547. фасциолез

548. фитофтороз

549. фомоз

550. фавус

551. трахеобактериоз

552. трахеомикоз

553. трематодоз

554. триходиноз

555. трихостронгилез

556. трихоцефалез

557. фикомикоз

558. филиколлез

559. церкоспороз

560. хориоптоз

561. цестодоз

562. цитоспороз

563. шарка

564. шютте

565. эпидермофитоз

566. энтеробиоз

567. энтомоз

568. эска

569. запал

570. испанка

571. карликовость

572. костоеда

573. невросклероз

574. падучая

575. пневмоплеврит

576. пневмоцирроз

577. пневмофиброз

578. порча

579. процесс

580. снежная слепота

581. спорынья

582. сухотка

583. токсикомания

584. акариазис

585. антракноз

586. арахноз

587. бактериоз

588. блек-рот

589. гемералопия

590. гатина

591. гипопаратиреоз

592. гипопитуитаризм

593. зооантропоноз

594. коккомикоз

595. лигулез

596. лимфаденоз

597. макракантаринхоз

598. мальсекко

599. меланоз

600. метагонимоз

601. микоплазмоз

602. мильдью

603. мускардина

604. нутталлиоз

605. озониоз

606. плазмоцитома

607. псора

608. септориоз

609. себорея

610. склофулодерма

611. хирагра

612. хроматопсия

613. эндокринопатия

614. эстроз

615. аллергодерматоз

616. артрозоартрит

617. аскаридиоз

618. бель

619. болесть

620. бронхопневмония

621. гепатохолецистит

622. гуммоз

623. ку-лихорадка

624. менингомиелит

625. менингоэнцефалит

626. нефрозонефрит

627. пендинская язва

628. утин

629. трахеобронхит

630. сосновый вертун

631. винилин

632. гипертиреоз

633. хламидиоз

634. гастродуоденит

635. орви

636. оксиуроз

637. анкилостомидоз

638. эписклерит

639. муковисцидоз

640. некатороз

641. ишальгия

642. иридоциклид

643. неспецифический язвенный колит

644. дизурия

645. трихомониаз

646. полиневропатия

647. ангионевропатия

648. болезнь рейно

649. поллипоз

650. кристаллурия

651. герпес

652. аддисона болезнь

653. анацидный гастрит

654. гингивостоматит

655. гонартроз

656. коксартроз

657. рефлюкс-эзофагит

658. сурра

659. сыпной тиф

660. болячка

661. болезненное состояние

662. кондратий

663. ветряная оспа

664. чернота

665. амблиопия

666. алекситимия

667. целлюлит

668. агалактия

669. акродерматит

670. акропарэстезия

671. актинобациллез

672. алкалоз

673. аменоррея

674. су-ауру

675. амилоидоз

676. антрит

677. асбестоз

678. ауески

679. артоз

680. атеротромбоз

681. аэроперитонеум

682. аэросаккулит

683. аэроцистит

684. бароотит

685. белоколосица

686. ламинит

687. блекота

688. блекот

689. варикоз

690. эпизотия

691. васкулит

692. вольфартиоз

693. вульвовагинит

694. гепатоптоз

695. гепатоз

696. гипогликемия

697. гиперпаратиреоз

698. гиподерматоз

699. гипохолестеринемия

700. герпангина

701. волк

702. лейкоплакия

703. глоссальгия

704. дентиногенез

705. парадонтит

706. пародонтолиз

707. пемфигоид

708. сиалоаденит

709. гнилокровие

710. гноекровие

711. гноевица

712. денге

713. евстахиит

714. дыховец

715. тубоотит

716. забоина

717. боб

718. бубрежник

719. вилота

720. выпадок

721. глазница

722. далак

723. железница

724. заволосица

725. закопытница

726. занедуга

727. хиль

Морфологический разбор слова «болезнь»

Часть речи: Существительное

БОЛЕЗНЬ — неодушевленное

Начальная форма слова: «БОЛЕЗНЬ»


Слово Морфологические признаки
БОЛЕЗНЬ
  1. Единственное число;
  2. Женский род;
  3. Именительный падеж;
  4. Неодушевленное;
БОЛЕЗНЬ
  1. Винительный падеж;
  2. Единственное число;
  3. Женский род;
  4. Неодушевленное;
Все формы слова БОЛЕЗНЬ

БОЛЕЗНЬ, БОЛЕЗНИ, БОЛЕЗНЬЮ, БОЛЕЗНЕЙ, БОЛЕЗНЯМ, БОЛЕЗНЯМИ, БОЛЕЗНЯХ

Разбор слова по составу болезнь

Основа слова болезнь
Корень бол
Суффикс е
Суффикс знь
Нулевое окончание

Разобрать другие слова

Разбор слова в тексте или предложении

Если вы хотите разобрать слово «БОЛЕЗНЬ» в конкретном предложении или тексте, то лучше использовать

морфологический разбор текста.

Найти
синонимы к слову «болезнь»

Примеры предложений со словом «болезнь»



1

Это не болезнь воли, как алкоголизм, а просто болезнь, болезнь души и сознания.

Все могу (сборник), Инна Харитонова, 2014г.



2

Болезнь дай-то Бог, чтобы это была только болезнь, – от болезни она скоро избавится, она снова расцветет».

Волхвы, Всеволод Соловьев



3

«Итак, все это только болезнь, все это „высшее“ одна болезнь, и больше ничего!» – язвительно восклицал он иногда про себя.

Вечный муж, Федор Достоевский, 1870г.



4

Болезнь это, ребята, жуткая болезнь

Царь-рыба, Виктор Астафьев, 1976г.



5

Уж там болезнь не болезнь, а не попадайся он мне на глаза – убью! 

Полное собрание сочинений. Том 9–12. Война и мир, Лев Толстой, 1863-1869, 1873г.


Найти еще примеры предложений со словом БОЛЕЗНЬ

Целлюлит / Новости общества Красноярска и Красноярского края / Newslab.Ru

Сегодня мы поговорим об одной из самых впечатляющих медицинских мистификаций — о целлюлите.

Если разбирать это слово по составу, то суффикс «ит», изначально присутствующий в термине, указывает на воспалительный характер процесса. Буквальное значение слова — «воспаление подкожно-жировой клетчатки», однако то явление, которое вот уже несколько десятков лет сводит с ума женщин всех развитых стран, представляет собой процесс совсем другой природы. Таким образом, мы снова имеем дело с путаницей терминов.

Целлюлит истинный

Целлюлит как заболевание действительно существует. Он представляет собой глубокое воспалительное поражение кожи и подкожной клетчатки, сопровождающееся покраснением, отеком и болью. Целлюлит обычно вызывается бактериальной флорой — стрептококками группы А и присоединившимся золотистым стафилококком.

Патологический процесс чаще всего поражает ноги (хотя он может затронуть и другие участки тела). Обычно ему предшествуют травмы, изъязвления кожи, микоз стоп или дерматит, а также отек любой этиологии. Целлюлит может развиваться на месте рубцов после операций по поводу варикозного расширения вен, особенно при наличии микоза стоп. Иногда подобное воспаление наблюдается и на неповрежденной коже (такая разновидность целлюлита называется «рожа»). После обследования для лечения врач может назначить антибиотики, а в серьезных случаях — даже дать направление на госпитализацию.

Целлюлит ложный

А вот то состояние, которое повсюду известно как целлюлит, на самом деле имеет сложное название «гиноидная липодистрофия» («гиноидная» — означает «по женскому типу», то есть в нижней половине тела).

Механизм ее развития таков. В подкожно-жировой клетчатке имеются специальные клетки — адипоциты, которые накапливают в себе жиры (процесс синтеза и накопления жиров сам по себе нормален для человека). При потребности организма в энергии жиры проходят процесс расщепления, а затем резерв снова пополняется за счет синтеза жиров после очередного приема пищи.

Количество адипоцитов во взрослом возрасте остается постоянным; они способны к делению только у детей. Плохое питание, гиподинамия, генетическая предрасположенность или гормональные нарушения могут привести к тому, что количество жира в адипоцитах увеличится непропорционально его расходованию, а в подкожно-жировой клетчатке нарушится кровоснабжение и лимфоотток.

На более поздних стадиях адипоциты начинают группироваться в узлы, провоцируя фиброз (уплотнение) тканей. По мере увеличения узлов, а также уплотнения и затвердевания фиброзных тканей, поверхность кожи становится неровной, словно покрытой бугорками.

Подобный процесс может развиться и по другим причинам — например, из-за ношения тесной одежды, курения или каких-то хронических заболеваний, при которых нарушается кровоснабжение тканей (например, при сахарном диабете). «Целлюлит» в той или иной степени присутствует практически у всех женщин, однако, в отличие от ожирения (избыточного накопления жировой ткани), сам по себе он заболеванием не считается и значимой угрозы здоровью не несет. Таким образом, лечение его — по большей части вопрос эстетики.

Методы «лечения»

Гиноидная липодистрофия наблюдалась у женщин во все времена, однако до конца XX века особого значения ей не придавали, считая попросту возрастным изменением кожи (что, по большему счету, верно). Однако стоило владельцам косметических салонов сгустить краски насчет серьезности «целлюлита», описав страшные «бугры» на коже и предложив «действенные» методы лечения (диеты, крема, косметические процедуры и др.), женщины по всему миру активно принялись выискивать на бедрах «апельсиновую корку» и пробовать все новые и новые методы избавления от липодистрофии. От некоторых из них волосы на голове встают дыбом, только вдумайтесь (цитирую информацию с косметических Интернет-порталов):

«Методы борьбы с целлюлитом — кишечное орошение: Бороться с целлюлитом нужно на всех уровнях — как извне, так и изнутри. Поэтому без кишечного орошения — многократного очищения кишечника — не обойтись. Во время процедуры в кишечник вводится озон, который обогащает кислородом органы и ткани и обладает антибактериальным действием…»

«…Методы борьбы с целлюлитом — мезотерапия: Эта инъекционная методика — новинка в лечении целлюлита. Под кожу проблемной зоны вводится очень тонкой и короткой иглой специальный антицеллюлитный коктейль (10-20 кубиков)… Эффект достигается за счет того, что микродозы препарата создают так называемые депо, и в этих кладовых лекарственные вещества остаются в течение длительного времени…

Список препаратов, которые входят в состав вводимого коктейля, весьма солиден: здесь и витамины, и антисептики, и микроэлементы (Zn, Co, Mg, P, S, Se, К), и органические кислоты (гликолевая, пировиноградная), и экстракты целебных растений (гинкго билоба, гамамелис, донник, артишок). Многие клиники используют продукты высоких технологий (ДНК, плацентекс, гиалуроновая кислота), экстракты животного происхождения (коллаген, эластин, хондроитин сульфат). Преимущество мезотерапии в том, что, помимо уменьшения объема тела и подтяжки кожи, одновременно происходит питание всего организма — полезные вещества распространяются по кровеносным сосудам…»

Осторожно!

Знание механизма развития липодистрофии позволяет предположить, что большинство предлагаемых в косметических салонах методик не только бесполезны, но и вредны. Жутко думать, как отреагирует организм на подкожное введение «волшебного коктейля», описываемого выше (до сих пор гадаю, зачем подкожно вводить антисептики и чем может помочь против липодистрофии какая-то высокотехнологичная ДНК и хондроитинсульфат — компонент хрящевой ткани)…

Или, например, известно, что столь популярный «антицеллюлитный» массаж направлен на механический разрыв скоплений жировых клеток, что, в свою очередь, приводит не только к травматизации тканей, но и к последующему накоплению освободившегося жира в уцелевших адипоцитах. Потому эффект от таких процедур, заметный в первые несколько дней, — всего лишь период перераспределения высвобожденного жира между другими клетками.

Полезными можно признавать лишь те методы, которые способны эффективно восстановить трофику (процесс клеточного питания) тканей, практически выключенных из общего обмена веществ. Для достижения этой цели хорошо подходит локальное, правильно организованное тепловое воздействие, контрастные ванны, душ Шарко и другие методы, направленные на организацию притока крови к местам воздействия. Именно эти методы были прописаны в рекомендациях по лечению гиноидной липодистрофии, утвержденных еще в 1981 году в СССР.

Если же липодистрофия доставляет вам реальное беспокойство — обратитесь к врачу-дерматологу или к врачу-физиотерапевту: в решении данной проблемы вполне можно довериться официальным медицинским методикам.

Ольга Дарсавелидзе

2.Разобрать по составу следующие слова: сохранились, привлекаемая( 1вариант) считался, прошедших( 2 вариант) 3.Произвести синтаксический разбор предложения: Древние люди лазили за гусеницами, служившими им пищей

КОНТРОЛЬНЫЙ ДИКТАНТ ПО РУССКОМУ ЯЗЫКУ
( 7 класс, 1 четверть)

Мёд известен человеку с давно прошедших времён. Вероятно, это была первая сласть, которой можно было полакомиться. Древние люди лазили за гусеницами, служившими им пищей, и в дуплах старых деревьев видели соты, заполненные ароматным веществом. Мёд! Впоследствии многие народы добывали в лесу мёд. В Древнем Египте он считался продуктом питания, исцеляющим многие болезни. Сохранились египетские рисунки, свидетельствующие о хранении и использовании мёда.
Как же образуется мёд? Известно, что «сырьём» для него служит цветочный нектар. Нектар – это сладкий сок, выделяемый растениями. Привлекаемая ароматом и яркой окраской цветка, пчела зачерпывает капельку нектара и заполняет им свой медовый зобик. Сотни тысяч цветков должна посетить не знающая усталости пчела, чтобы набрать нектара.
Когда в сотах созревание мёда заканчивается, пчёлы наглухо закрывают ячейки сотов тонкими восковыми крышечками. Мёд готов.

( 121 слово). ( По И. Волперу)
Задание:
1.Сделать фонетический разбор слов: первая, ячейки( по варианатам).
2.Разобрать по составу следующие слова: сохранились, привлекаемая( 1вариант)
считался, прошедших( 2 вариант)
3.Произвести синтаксический разбор предложения: Древние люди лазили за гусеницами, служившими им пищей, и в дуплах старых деревьев видели соты, заполненные ароматным веществом.

КОНТРОЛЬНЫЙ ДИКТАНТ ПО РУССКОМУ ЯЗЫКУ
( 7 класс, 1 четверть)

Мёд известен человеку с давно прошедших времён. Вероятно, это была первая сласть, которой можно было полакомиться. Древние люди лазили за гусеницами, служившими им пищей, и в дуплах старых деревьев видели соты, заполненные ароматным веществом. Мёд! Впоследствии многие народы добывали в лесу мёд. В Древнем Египте он считался продуктом питания, исцеляющим многие болезни. Сохранились египетские рисунки, свидетельствующие о хранении и использовании мёда.
Как же образуется мёд? Известно, что «сырьём» для него служит цветочный нектар. Нектар – это сладкий сок, выделяемый растениями. Привлекаемая ароматом и яркой окраской цветка, пчела зачерпывает капельку нектара и заполняет им свой медовый зобик. Сотни тысяч цветков должна посетить не знающая усталости пчела, чтобы набрать нектара.
Когда в сотах созревание мёда заканчивается, пчёлы наглухо закрывают ячейки сотов тонкими восковыми крышечками. Мёд готов.

( 121 слово). ( По И. Волперу)
Задание:
1.Сделать фонетический разбор слов: первая, ячейки( по варианатам).
2.Разобрать по составу следующие слова: сохранились, привлекаемая( 1вариант)
считался, прошедших( 2 вариант)
3.Произвести синтаксический разбор предложения: Древние люди лазили за гусеницами, служившими им пищей, и в дуплах старых деревьев видели соты, заполненные ароматным веществом.

15

Приложенные файлы

  • 117469
    Размер файла: 28 kB Загрузок: 0

«Косыгина сломил не Брежнев, его сломила болезнь» – Власть – Коммерсантъ

Алексей Косыгин руководил правительством СССР дольше всех советских премьеров — 16 лет. И все это время его ближайшим сотрудником оставался управляющий делами Совета министров СССР Михаил Смиртюков, который рассказал о самом неулыбчивом советском премьере обозревателю «Власти» Евгению Жирнову.

«Всем коньякам он предпочитал дагестанский»

На протяжении многих лет вы были одним из ближайших сотрудников Алексея Николаевича Косыгина. Во многих воспоминаниях его описывают человеком жестким, суровым, почти нелюдимым. Это соответствует действительности?

Улыбался он действительно нечасто. Если был доволен, чуть сдвинет в улыбке уголок рта — и все. А сколько раз он смеялся, я могу пересчитать по пальцам. Но не это в нем было главным. Алексей Николаевич был профессионалом хозяйственником до мозга костей. А если вспоминать о его личных качествах, без малейшего преувеличения можно сказать, что он поражал окружающих своей скромностью и кристальной честностью. Причем в этом не было никакой рисовки или показухи. Расскажу вам такую вещь. Мы с ним оба были заядлыми рыбаками. И делились друг с другом профессиональными секретами: где лучше ловится, что и на что. Как-то я заприметил, что маршалы Жуков и Малиновский повадились ловить рыбу с Рублевской плотины. Интересно то, что они никогда не рыбачили там вместе. Жуков подъезжает — Малиновский сворачивает удочки. И наоборот. Видимо, крепко не любили друг друга. Так вот, попробовал поудить там и я. Судак, жерех клевали отлично. И от Москвы, и от наших дач — рукой подать. Рассказываю об этом Косыгину. Через пару недель, в воскресенье, рыбачу там, смотрю — со стороны Архангельского, где была дача Алексея Николаевича, идет моторка. Причаливают, подходит он, здоровается. Потом выбрал место, закинул спиннинг и буквально сразу поймал крупного жереха. Один из его охранников, стоявший внизу у плотины, рыбу с крючка снял и приносит ему. Он посмотрел на жереха, улыбнулся и давай прощаться. «А как же рыбалка?» — спрашиваю. «Так все,— говорит.— Моей семье этой рыбины вполне достаточно».

Скромность объясняется происхождением? Он вам рассказывал о родителях, о своем детстве?

Интересная штука! Мы с ним говорили почти ежедневно на протяжении почти двух десятков лет, а такая тема в наших беседах не возникала ни разу. О его детстве я знал только то, что было написано в официальных документах: что родился он в 1904 году в Петербурге в рабочей семье, что в 15 лет вступил добровольцем в Красную армию. А вот о том, что было дальше, он рассказывал часто. Говорил о том, как работал после окончания кооперативного техникума в Сибири. Об учебе в текстильном институте, о работе на ткацко-прядильной фабрике, где он вырос от мастера до директора. Собственно, там, на этой фабрике в Ленинграде, мы с ним и познакомились.

Когда это произошло?

В 1937 году меня назначили начальником сектора легкой, пищевой и местной промышленности Экономсовета Совнаркома СССР. И 19 февраля 1938 года меня командировали в Ленинград на слет передовиков хлопчатобумажной промышленности. Приехал я туда утром, а слет начинался в четыре часа дня. Поэтому я попросил встречавшего представителя Ленсовета отвезти меня на текстильную фабрику. Приехали мы на фабрику, где директором был Косыгин. Встретил меня высокий, стройный человек в прекрасно сшитом сером костюме. Это сразу бросилось в глаза, поскольку большинство руководителей ходили в полувоенных френчах, подражая Сталину. И мы часа три ходили по фабрике. Меня поразил и порядок в цехах, и то, с каким уважением говорили с ним работницы. Чисто, аккуратно и опрятно было и в заводском общежитии, где Косыгин предложил мне остановиться. Толковым было и его выступление на слете. Он перебрал регламент, но, поскольку говорил исключительно по делу, его никто не останавливал. Вернулся я в Москву, написал записку об увиденном. А через некоторое время узнал, что Косыгина назначили заведующим промышленно-транспортным отделом обкома партии, а затем избрали председателем Ленинградского горисполкома.

Ваша записка сыграла в этом какую-то роль?

Скорее всего, она оказалась только одним из многих положительных отзывов о работе Алексея Николаевича, которые Микоян доложил Сталину, и это изменило судьбу Косыгина. В 1939 году его назначили наркомом текстильной промышленности. Причем все было организовано чисто по-сталински. Косыгина, как он мне рассказывал, без всякого объяснения причин вызвали в Москву. Он приехал, на вокзале купил «Правду» и из нее узнал о назначении. Тогда в отличие от нынешнего времени существовал особый порядок приема-передачи дел руководителями отраслей. Создавалась специальная комиссия с участием представителей Совнаркома и Комиссии советского контроля. И так получилось, что представлять Совнарком назначили меня, а от контрольного органа в комиссию вошла знаменитая большевичка Розалия Землячка. Боялись ее, нужно сказать, все страшно — и не без оснований. Мне рассказывали, что однажды она, будучи в Горьком, пришла в управление речного порта. Не понравилось ей, что посреди Волги долго стоит и гудит пароход. Речной начальник, к которому она вошла, был в запарке и не заметил, что у пришедшей к нему женщины на лацкане костюма орден Ленина, очень редкая по тем временам награда. Ну мечется, кричит и вдруг видит ее. «А вам,— говорит,— дамочка, чего здесь надо?» В общем, тот речник вспоминал об этой встрече много лет. Не знаю, сколько их всего ему дали.

А в комиссии по приему-передаче дел она свирепствовала?

Нет. Мне показалось, что ей пришлись по душе собранность и деловитость Косыгина. По заведенному порядку новому наркому в присутствии прежнего начальники управлений наркомата докладывали обо всех успехах и нерешенных вопросах. Так что после десяти дней работы комиссии Алексей Николаевич получил достаточно полную информацию о текстильной промышленности страны.

«Мы с ним говорили почти ежедневно на протяжении почти двух десятков лет, а о его детстве я знал только то, что было написано в официальных документах»

Фото: Росинформ, Коммерсантъ

А каким он оказался наркомом?

По долгу службы я часто бывал у него на коллегиях наркомата. И на меня произвела приятное впечатление его манера говорить с подчиненными: без нажима, спокойно, аргументированно. Даже не было заметно, что у него есть проблемы. Не очень здорово сложились у Косыгина отношения с транспортниками. Железнодорожники неритмично подвозили сырье и вывозили готовую продукцию с текстильных предприятий. Косыгин решил прибегнуть к помощи председателя Совнаркома Молотова. Попросил принять и начал рассказывать об этих трудностях. Молотов выслушал его и спрашивает: «А от меня чего вы хотите?» Косыгин попросил поднажать на путейцев. А Молотов снова спрашивает: «А вы кто? Кем вы у нас работаете?» «Наркомом»,— отвечает Косыгин. «Так вот,— говорит Молотов,— идите и работайте наркомом. А я за вас вашу работу делать не буду». Косыгин, как он мне рассказывал, сначала обиделся. А потом не раз рассказывал о той встрече с Молотовым тем подчиненным, которые хотели перевалить на него свои заботы. И с работой начал справляться настолько успешно, что уже в апреле 1940 года его назначили зампредом Совнаркома.

А как проявил себя Косыгин во время войны?

На третий день после нападения немцев его назначили заместителем председателя Совета по эвакуации при Совнаркоме. И фактически он руководил всей работой по вывозу предприятий и миллионов людей с территорий, которые вот-вот должен был занять враг.

Вы встречались с ним в это время?

Косыгину, не снимая с него других обязанностей, поручили руководить вывозом людей из окруженного врагом Ленинграда, а я по приказу Микояна отвечал за снабжение ленинградцев продовольствием. Мы нередко были в Ленинграде одновременно. А вот после снятия блокады наши пути несколько разошлись. Сначала Алексея Николаевича назначили председателем Совнаркома РСФСР. Затем он сменил еще несколько постов, был даже министром финансов, и мы виделись лишь тогда, когда требовалось согласовать какие-либо вопросы. Особенно часто с места на место его стали перебрасывать в хрущевские времена.

Почему?

«Дорогой Никита Сергеевич» с его вечным административным зудом безостановочно менял структуру правительства. То объединял министерства, то разъединял, пока вовсе не решил их ликвидировать. Косыгин то работал в Госэкономкомиссии, то возглавлял Госплан. Только в мае 1960 года он занял пост, который давно заслуживал,— первого заместителя председателя Совмина СССР. Я тогда был только заместителем управляющего делами, но Алексей Николаевич предпочитал все вопросы обсуждать и решать со мной, а не с управляющим делами Степановым. И несколько раз приглашал меня с собой в поездки. Как-то позвонил, попросил зайти и говорит: «А знаете что?» Это было его любимое присловье, с которого он обычно начинал беседу. И продолжил: «Не хотите поехать со мной в Казахстан?» Он не любил долгих сборов, и через час мы уже вылетели из Внуково в Алма-Ату. Мы проехали почти по всем областям Казахстана, и везде Алексей Николаевич с обычным для него любопытством вникал в дела предприятий. А его рекомендации по улучшению работы потом легли в основу пятилетнего плана развития Казахстана. Во время этой поездки мне довелось видеть, как в Усть-Каменогорске он говорит с возбужденной толпой. Мы приехали туда, чтобы посмотреть, как идут дела на ГРЭС, на которой директорствовал сосланный туда Маленков.

«О самом Косыгине члены Политбюро распускали разные сплетни. Алексея Николаевича, тяжело переживавшего смерть жены, эта болтовня, без преувеличения, ранила»

Фото: РГАКФД/Росинформ, Коммерсантъ

Но ведь встреча действующего руководителя с опальным могла кончиться для обоих очень плачевно.

Маленков все это понимал и на это время уехал куда-то — якобы по делам. А через некоторое время после нашего приезда в Усть-Каменогорск Косыгину доложили, что собралась большая толпа женщин, которые требуют встречи с ним. Среди казахских руководителей началась легкая паника. А Алексей Николаевич, не говоря ни слова, встал и пошел на площадь. После того как он спокойно поздоровался с женщинами, шум и крики в толпе утихли. Оказалось, что в построенном городке у женщин не было никакой работы. Проектировщики ГРЭС не предусмотрели. Косыгин выслушал всех и так же спокойно сказал: «А знаете что? Мы обязательно что-нибудь придумаем». И народ разошелся. А Косыгин, вернувшись в кабинет, тут же позвонил атомному министру Ефиму Павловичу Славскому, обрисовал ситуацию и спросил: «Нет ли у вас нужды в каком-либо производстве, на котором могли бы быть заняты в основном женщины?» И к нашему возвращению в Москву Славский подготовил предложения о строительстве там фабрики по выпуску респираторов. А еще через полтора года она заработала.

А как принимали Косыгина региональные руководители?

По их понятиям — по высшему разряду. В Усть-Каменогорске нас поселили в особняке приемов обкома. Утром спускаемся к завтраку, а там стол ломится от еды: накрыто человек на тридцать. А нас семеро: Косыгин, два его помощника, я, председатель Совмина Казахстана Кунаев, второй секретарь казахского ЦК Соломенцев и хозяин — секретарь обкома. На подобные приемы и угощения тратились, а еще чаще списывались огромные деньги. Я помню, мне как-то принесли для оплаты счет за отдых на госдаче в Пицунде министра угольной промышленности Засядько. Сумма указывалась какая-то совершенно немыслимая, а в раскладе продуктов было написано, что за месяц на него израсходовали 2600 яиц! А он мне как-то говорил, что с детства не переносит ни яичницы, ни вареных яиц.

Косыгина это тоже возмущало?

Конечно. Но особенно там, в Усть-Каменогорске, его возмутило предложение секретаря обкома выпить за завтраком водки. «Если хотите,— говорит Косыгин,— пейте сами». А тот, ничуть не смущаясь, ответил: «Да мы и так каждый день пьем. А вы у нас гость, вот и хотели вас уважить».

Косыгин был убежденным трезвенником?

Ну что вы. В праздники, на отдыхе он был не прочь посидеть за коньячком. Всем другим коньякам, кстати, он предпочитал дагестанский.

«В аппарат Совета министров ЦК постоянно направлял своих людей, и не всегда от этих назначенцев удавалось отбиться»

«Захожу в комнату, а там Брежнев брови укладывает»

А как складывались его отношения с Хрущевым?

Неровно они относились друг к другу. Хрущев много раз обвинял Косыгина в том, что он лезет в сельхозвопросы, в которых будто бы ничего не понимает. А Косыгин недолюбливал Хрущева за непомерную говорливость. Он вообще всю жизнь не любил пустых болтунов.

В разных источниках по-разному описывается роль Косыгина в антихрущевском заговоре. Большинство историков и мемуаристов утверждают, что Косыгина не посвящали в существо дела. Это так?

Конечно, нет. В 1964 году я предложил ему провести небольшую реконструкцию Свердловского зала в Казаковском корпусе Кремля. Там вот в чем была штука: аппаратурой, усиливающей звук, тогда не пользовались, а акустика в этом зале была неважной. Разбирается вопрос, человека ругают, а он сидит себе и ничего не слышит. Кончается заседание, он выходит и улыбается. А те, кто сидел поближе, спрашивают: «Ты чего радуешься? Тебе же только что выговор влепили». Стали разбираться, и оказалось, что первоначально потолки в зале были высокими, но в первые годы советской власти, чтобы сделать его менее парадным и более уютным, соорудили низкий фальшпотолок. Когда за несколько месяцев до отправки на пенсию Хрущев в очередной раз уехал из Москвы, я предложил Косыгину восстановить зал в первоначальном виде. «А если Никита Сергеевич будет недоволен,— говорю,— свалим все на меня». Косыгин даже обиделся: «Почему же? Решаем вместе — и отвечать вместе будем». И добавил: «Если будет перед кем». Я смекнул, что трон под Хрущевым уже зашатался. Потом мне рассказывали, что Косыгин перед октябрьским пленумом ЦК вел подготовительные разговоры с другими зампредами Совмина и министрами.

И как они реагировали?

Председатель Госснаба Дымшиц, когда услышал от Косыгина, что есть мнение снять Хрущева, побагровел и, ни слова не говоря, попятился к двери. Были и такие члены правительства, которые срочно заболели. В кремлевской больнице на Грановского проблем с коечным фондом никогда не было, так что все, у кого воспалилась осторожность, спокойно переждали там смену власти.

А как прошло назначение Косыгина премьером?

Без сучка и задоринки. Я был на том пленуме. После своего избрания Брежнев спросил у зала: «А кого назначим председателем Совета министров?» И сразу со всех сторон закричали: «Косыгина, Косыгина». Проголосовали за него единогласно. Все знали его как профессионала высшего уровня. Хрущев ведь поэтому, хоть и не любил Косыгина, не убирал его из правительства.

Он сразу назначил вас управляющим делами Совмина?

Нет. Мы продолжали работать так, будто ничего не произошло. Еще несколько дней управляющим делами оставался выдвиженец Хрущева Степанов. Затем Косыгин говорит: «А знаете что? Примите у Степанова дела». И снова работаем, как работали. А в декабре я получил красный пакет, в котором обычно присылали решения Политбюро. Я был назначен управляющим делами. Степанова Косыгин, кстати, тоже не обидел. До пенсии он работал заместителем министра электростанций.

А как складывались отношения Косыгина с Брежневым?

Вначале они прекрасно ладили друг с другом. Хотя людьми были абсолютно разными. Косыгин в отличие от Брежнева никогда не принимал никаких подношений. Помню, один наш дипломат принес ему ружье и сказал, что такие же ружья подарил Брежневу и Подгорному. Тогда ведь к власти пришел триумвират: Брежнев — главный в ЦК, Косыгин — в правительстве, Подгорный — в Верховном совете. Но Косыгин приказал догнать дарителя и вернуть ему ружье. Все подарки, полученные от иностранцев, он обязательно сдавал в госфонд. И очень расстраивался, когда подарок оказывался не таким ценным, как ему представлялось. После поездки в Ливию, например, показывает он мне саблю и говорит: «Из чистого золота, Каддафи подарил». Я говорю: «Алексей Николаевич, не может сабля быть из чистого золота». Он начал со мной спорить. Пригласили экспертов. Оказалось, что клинок стальной, но позолоченный. Он расстроился так, будто нанес недостаточной ценностью сданной вещи ущерб родной стране. Даже мелочь иностранную, которая оставалась у него после поездок за рубеж, он аккуратно сдавал нам, в управление делами. И еще его отличала от Брежнева и Подгорного подчеркнутая нелюбовь ко всякого рода пьяным встречам и охотам. Косыгин ведь даже на отдыхе предпочитал жить скромно — в обычном двухкомнатном номере санатория, хотя на любом курорте были госдачи для членов Политбюро.

«Мне как-то принесли для оплаты счет за отдых на госдаче в Пицунде министра угольной промышленности Засядько (на фото — слева). В раскладе продуктов было написано, что за месяц на него израсходовали 2600 яиц!»

Фото: Росинформ, Коммерсантъ

Брежнева раздражало это его «чистоплюйство»?

Конечно. Но к развалу правящего триумвирата привело другое: Брежнев с самого начала хотел быть первым среди равных и все время стремился показать, что он все-таки главнее Косыгина и Подгорного. Например, захотел иметь кабинет не только на Старой площади, но и в Кремле. И нам пришлось освободить и отремонтировать для него и его аппарата третий этаж Казаковского корпуса. Перед окончанием ремонта я пошел посмотреть, все ли сделано как надо. Захожу в комнату отдыха за кабинетом, предназначенным для Брежнева, а там уже сам Леонид Ильич. Стоит перед зеркалом, брови укладывает. Здороваюсь, а он отвечает: «Привет!» И продолжает расческой работать. Неудобно, черт! Рабочие же кругом ходят, а ему хоть бы хны.

А когда монолитное единство трех руководителей рухнуло?

Оно рушилось постепенно, на протяжении нескольких лет. Брежневу нужно было время, чтобы посадить на все значительные партийные посты своих людей. В смысле подбора и расстановки кадров ему равных не было и нет. И только затем он занялся другими органами власти. Но ревниво следить за всем, что делает Косыгин, он начал вскоре после прихода к власти. Собственно, к конфронтации с Алексеем Николаевичем его подталкивал и партаппарат. Главной заботой Косыгина было проведение экономической реформы. Он считал, что предприятиям и отраслям нужно предоставить больше самостоятельности. И первыми восстали против этого партийные чиновники на местах. Они почувствовали, что вскоре не смогут давать указания директорам заводов, что, понятно, не могло им понравиться. А Брежнев очень чутко прислушивался к настроениям руководящих партийных масс. С помощью Минфина товарищи из ЦК начали душить реформу, а самого Косыгина Брежнев (чаще всего без всякого повода) начал критиковать на Политбюро.

Как же без повода? Ведь известно, к примеру, что Косыгин без согласования с Брежневым разрешил уехать за границу дочери Сталина Светлане Аллилуевой.

Я, между прочим, хорошо помню этот день. Я, как обычно, утром пришел к Алексею Николаевичу с «почтой» — документами, требовавшими его подписи. А дежурные в приемной извиняются, что не успели позвонить: на прием попросилась Аллилуева, и Косыгин сейчас с ней беседует. Пробыла она у него минут пятнадцать. Вхожу. Он рассказывает, что Светлана попросила по семейным делам выпустить ее за границу и что дала слово вернуться. Косыгин ведь сам был человеком слова и как-то не задумался о том, что, даже дав слово, она может его подвести. «А если все-таки не вернется?» — спрашиваю. Он задумался и, в свою очередь, спросил: «А чем она может навредить, если останется там? Будет рассказывать что-то о Сталине? Так культ личности мы и сами разоблачили». Но когда она все-таки не вернулась, на Политбюро против Косыгина подняли большую волну. Но гораздо больше его отношениям с Брежневым навредила встреча с премьером КНР Чжоу Эньлаем. Алексей Николаевич летел из Вьетнама над территорией Китая, с которым в тот момент отношения по вине Хрущева были испорчены. И Косыгин с борта самолета направил приветственную телеграмму китайскому народу и его премьеру. А через десять минут пришла ответная телеграмма от Чжоу Эньлая с предложением приземлиться в Пекине и провести переговоры. Прошли они успешно, но когда я решил поздравить Алексея Николаевича с этим, он только горько усмехнулся. Оказалось, что сразу после возвращения ему позвонил Брежнев и, не поинтересовавшись результатом встречи в Пекине, спросил: «Кто разрешил показывать твою встречу с Чжоу по нашему телевидению?» После этого, насколько я знаю, Брежнев установил пропорцию: сколько в программе «Время» нужно показывать его и во сколько раз меньше — Косыгина.

Вы считаете, что, соглашаясь на встречу в Пекине, Косыгин не думал о том, что успех придаст ему дополнительный политический вес?

Он всегда думал прежде всего о деле. В нашей стране, чтобы завоевать и удерживать власть, нужно иметь хорошие отношения с региональными лидерами, как бы они ни назывались — секретарями обкомов или губернаторами. А Косыгин никогда не пытался выстраивать с ними какие-то особые связи. Помню, при мне ему позвонил из Узбекистана Рашидов: «Алексей Николаевич! Республика начала добывать для страны золото!» А Косыгин-то знал, что золото добывает не республика, а союзное атомное министерство. И что себестоимость его довольно высока. Он спрашивает Рашидова: «А во сколько обходится стране грамм золота?» Тот то ли не знал, то ли понял, что уловка не удалась, и закруглил разговор. И больше Косыгину не звонил. Разве так ведут себя те, кто рвется на вершину власти? А настоящей, дельной популярности и в народе, и среди настоящих хозяйственников Алексею Николаевичу было не занимать. И Брежнев это знал и страшно ревновал его.

Эта политическая ревность как-то сказывалась на работе правительства?

Непосредственно на работе аппарата — нет. Алексей Николаевич принял предложенную мной схему работы. Перед каждым заседанием президиума Совмина мы собирали сотрудников аппарата, готовивших вопросы, и они докладывали Косыгину все нюансы проблемы. Выслушивал он всех — и очень внимательно, не глядя, что перед ним простой референт. Нередко спорил и не соглашался с докладчиками, но на следующий день, все обдумав, на заседании президиума в спорах с зампредами и министрами начинал отстаивать позицию, предложенную ему аппаратом. А вот по крупным, принципиальным вопросам ему приходилось труднее. Они ведь предварительно обсуждались на Политбюро. Вначале Косыгина поддерживали там зампред Совмина СССР Мазуров и глава правительства РСФСР Воронов. Мазуров выступал помягче, а Воронов был мужик резкий и говорил Брежневу в глаза все, что думал. Он и рыбаком, кстати, был таким же резким и, можно сказать, опасным. Как приедем рыбачить, не успокоится, пока не набьет целый мешок рыбой. Но их Брежнев потихоньку из Политбюро убрал, и Косыгину нередко приходилось противостоять всей этой партийной братии практически в одиночку.

Война шла в основном на заседаниях Политбюро?

Да где там. Борьба шла по всем правилам ведения дворцовых интриг. У Брежнева среди зампредов Совмина были свои люди, которые после заседаний правительства чуть ли не бегом бежали к телефонам, чтобы доложить генсеку о том, что у нас говорилось. В аппарат Совета министров ЦК постоянно направлял своих людей, и не всегда от этих назначенцев удавалось отбиться. В ходу были и более тонкие интриги. Например, как-то я увидел, что Косыгин недоволен мной. Оказалось, что зампред Совмина и член Политбюро Полянский сказал Косыгину, что я был вместе с ним и Громыко на охоте. А Алексей Николаевич не терпел, когда так поступают близкие ему люди. «Так я там и не был,— говорю.— Полянский меня несколько раз звал, но я не поехал». И о самом Косыгине члены Политбюро распускали разные сплетни.

Вы имеете в виду разговоры о его близости с Людмилой Зыкиной?

Чистейшая была клевета. Но Алексея Николаевича, тяжело переживавшего смерть жены, эта болтовня, без преувеличения, ранила. Как-то мы сидим с ним с документами, вдруг звонок. Косыгин, когда услышал голос члена Политбюро Кулакова, даже изменился в лице. «Хорошо, что вы позвонили,— говорит.— А то я сам собирался вам звонить. Если вы не прекратите распускать обо мне грязные слухи, я буду вынужден поставить этот вопрос на Политбюро». И положил трубку. Кулаков ему больше не звонил и как-то присмирел.

«Брежнев установил пропорцию, сколько в программе «Время» нужно показывать его и во сколько раз меньше — Косыгина»

«Ты зачем у себя в ЦК все эти промышленные отделы развел?»

А Брежнев во всем этом участвовал?

Своеобразно. Как-то мне позвонил дежурный из его приемной: «Вас ждут в столовой Политбюро». «Зачем?» — спрашиваю. «Ждут, и все». Поднимаюсь, вхожу. Все сидят за накрытым столом с выпивкой. А друг напротив друга стоят Брежнев и Косыгин с рюмками в руках, видно, что уже не с первыми, и громко спорят друг с другом. Должен сказать, что Косыгин никогда ничего дурного о Брежневе за глаза не говорил, и тот об этом знал. Но в лицо все высказывал открыто. И вот стоят они, и Косыгин говорит: «Ты зачем у себя в ЦК все эти промышленные отделы развел? Центральному комитету больше нечем заниматься, кроме как дублировать правительство? Зачем тебе такой огромный аппарат?» Брежнев кивнул в мою сторону: «А ему зачем такой аппарат?» Косыгин продолжал горячиться: «У нас в аппарате каждый человек занят конкретным делом!» Брежневу совсем не хотелось продолжать спор, и он потребовал налить мне штрафную за опоздание. Кто-то, кажется Полянский, подскочил ко мне с большим фужером коньяку. Пришлось выпить.

А обслуживающему персоналу на высочайшей выпивке быть не полагалось?

Не знаю. Я на таком мероприятии был первый и предпоследний раз. Откуда-то потом подошли две здоровенные красивые девахи в фартуках и спросили, всем ли все довольны и не нужно ли подать что-нибудь еще. Брежнев быстро вскочил, подошел к ним, с аппетитом расцеловал обеих и сказал, что сегодня они могут отдыхать. Потом он прошелся вдоль стола. По-моему, дело было вскоре после его возвращения из отпуска, и до него явно дошли слухи о том, как вели себя соратники без него.

Судя по всему, до вас они тоже дошли. Значит, и у вас в аппарате ЦК были верные люди?

На войне как на войне. Были достойные товарищи, предупреждавшие нас о готовившихся неприятностях. А в принципе многое я видел и сам: на заседания в ЦК на касающиеся правительства вопросы меня, как правило, приглашали.

Так и как же вели себя соратники в отсутствие Брежнева?

Когда он уезжал, Суслов, который обычно вел заседания секретариата ЦК, начинал вести Политбюро. А Кириленко вел заседания секретариата. Причем как полный хозяин: снимал пиджак, разваливался в кресле. Так вот, Брежнев подходит к нему и говорит: «Андрей Павлович, ты запомни, что кроме тебя в ЦК еще и Брежнев есть». Потом подошел к Суслову. Тот обычно пытался в его отсутствие протащить через Политбюро решения, которые при генсеке бы точно не прошли. Потрепал его по голове и говорит: «Эх, Миша!» И на этом все. Начали расходиться.

И в чем был глубокий политический смысл этого мероприятия?

Я сам об этом тогда думал. Я-то зачем ему понадобился? А потом узнал, что это обычное дело. Так Брежнев всем, включая приглашенных, показывал, кто в доме хозяин.

И в случае с Косыгиным Брежневу действительно удалось доказать, что хозяин именно он.

Косыгина сломил не Брежнев, его сломила болезнь. Он ведь был человеком крепким, спортивным. Много ходил пешком, занимался греблей. И в 1976 году во время катания на байдарке он перевернулся и, называя вещи своими именами, утонул. Его откачали, но клиническая смерть подорвала и его организм, и его дух. Эх, если бы охрана подоспела вовремя.

Учитывая его отношения с Брежневым, можно ли считать опоздание охраны случайностью?

В этом отношении все было чисто. Врачи говорили, что у него случился микроинсульт и из-за этого он потерял равновесие. А в охране Алексея Николаевича работали преданные ему люди. Но сам он не любил, когда охрана окружает его. И нередко он отрывался от них. Я помню, в Юрмале прикрепленные к нему ребята зазевались, а он сел на велосипед — и на пляж. Надо было видеть, как они сломя голову неслись за ним вслед. Думаю, что и в случае с байдаркой он решил показать, что сила у него есть, и оторвался от ребят, плывших за ним на обычной весельной лодке.

После этого несчастного случая он возвращался к работе?

Да, но ненадолго и работал не в полную силу. Один за другим у него случились два тяжелых инфаркта. А добили его брежневские ребята, когда позвонили ему в больницу и предложили написать заявление об отставке. Этого он не перенес.

Результаты занятий по «Словообразованию» на средства Фонда президентских грантов — Я понимаю

Глухих школьников было в общей сложности 12 человек, остальные 6 учащихся — слабослышащие школьники. Большинство учащихся отметили, что считают себя билингвами или носителями русского жестового языка (17 человек из 20 учащихся).

Вся информация на занятиях подавалась преподавателем в виде:

— презентаций, письменных заданий на листочках — на русском языке;

— видеороликов на русском жестовом языке, содержащих субтитры на русском языке;

— лекций, объяснений преподавателя — на русском жестовом языке.

Цель занятий:

1) дать основные знания по морфемике (составу слова) и по словообразованию (способах образования слов) в русском языке — на русском жестовом языке и на русском языке (в письменной форме)

2) проверить эффективность метода (выяснить, насколько понятно для глухих учащихся воспринимать учебную информацию данным способом).

Перед первым занятием проводилось первичное тестирование (15 минут), после второго занятия — заключительное тестирование (15 минут).

До начала занятий выяснилось, что учащиеся:

1) плохо различали термины, смешивали понятия «часть слова» и «часть речи», а также «однокоренные слова» и «однородные члены предложения». Например, 1/4 часть учащихся (5 человек) вместо того, чтобы перечислить части слова, перечислили части речи. Далее, 1/5 часть учащихся (4 человека) перепутали однокоренные слова с однородными членами предложения.

2) плохо знали названия частей слова. Например, обнаружилось, что не знают/не помнят ни одной части слова — 8 учащихся из 20 учащихся, 1-2 части слова назвали 2 учащихся из 20 учащихся, 3-5 частей слова правильно назвали лишь 10 учащихся из 20 учащихся (1/2 часть от всех участников эксперимента).

3) плохо выполняли разбор слова по составу (иногда даже не видели корень в слове). Например, ни одного слова из пяти предложенных не смогли разобрать 6 учащихся из 20 учащихся, все слова (все пять слов) из предложенных правильно разобрать по составу не смог никто.

После изучения курса результаты были значительно лучше, в частности, учащиеся:

1) научились различать термины «часть слова» и «часть речи», а также «однокоренные слова» и «однородные члены предложения». Один раз ошибся на заключительном тестировании лишь один учащийся.

2) уточнили или узнали названия частей слова. Например, на заключительном тестировании обнаружилось, что 5 частей слова правильно назвали 17 учащихся из 20 учащихся.

3) научились хорошо выполнять разбор слова по составу, научились видеть корень в слове. Например, все слова (все пять слов) из предложенных правильно разобрали по составу 9 человек, 3 слова из пяти предложенных смогли разобрать 7 учащихся из 20 учащихся.

4) узнали способы словообразования. Например, 3-5 способов словообразования смогли назвать 13 учащихся (против 2 учащихся до начала курса)

5) смогли выполнить несколько сложных заданий по данному разделу науки о языке.

Вывод: обучение устным методом не решает проблему низкого уровня грамотности глухих, слабослышащих и кохлеарно имплантированных школьников. При обучении русскому языку необходимо делать упор на развитие грамматики, понимание правил русского языка, используя при этом все средства коммуникации (жестовый язык, дактилология, устная и письменная речь). Работа над произношением и развитием слуха не должна препятствовать усвоению учебного материала, идти в отдельное время.

лечение хронического простатита самые эффективные методы лечения

лечение хронического простатита самые эффективные методы лечения

лечение хронического простатита самые эффективные методы лечения








>>>ПЕРЕЙТИ НА ОФИЦИАЛЬНЫЙ САЙТ >>>

Что такое лечение хронического простатита самые эффективные методы лечения?

Уротрин – это полиактивный негормональный комплекс, препарат от простатита и для профилактики болезней предстательной железы и других заболеваний мочеполовой системы у мужчин. Также положительно влияет на потенцию, поэтому может использоваться в качестве интимного стимулятора (средство более безопасно, чем Виагра и ее аналоги). При простатите многие совершают ошибку и принимают только симптоматические медицинские средства от болей или для нормализации мочеиспускания. В итоге болезнь возвращается по 3–4 раза в год. На самом деле чтобы убрать болезнь, надо восстановить кровоток и лимфоток в тазу и железе, снять воспаление и запустить процессы естественной регенерации клеток. С этим вполне справляются натуральные средства, содержащие магний, цинк, селен, витамины А и D. Судя по составу, эти элементы в Уротрине имеются, так что его прием в комплексе с лекарствами ускорит выздоровление и закрепит результат.

Эффект от применения лечение хронического простатита самые эффективные методы лечения

У меня были довольно серьёзные проблемы с тем, что ниже пояса. Вроде бы физически был здоров, а как доходило до секса, так сразу всё на полшестого. Уже не знал, что и делать. Спросил совета в интернете, анонимно, там мне порекомендовали «Уротрин». Сейчас с эрекцией не только всё в порядке – могу жену несколько часов подряд! Надеюсь, вам это поможет.

Мнение специалиста

От простатита никто не застрахован. Вот и меня настигли эти симптомы, в туалет нормально не сходить, о сексе и вообще нечего думать, у меня даже началась депрессия. Уротрин вернул мне нормальную жизнь, эффект проявился спустя пять дней применения. Принимал по схеме производителя, два раза в день перед едой. Содержимое пакетика необходимо развести в полстакана воды (тщательно размешать). Схема приема достаточно простая: 5 дней принимаем по два пакетика в день, потом два дня перерыв и затем снова 5 дней прием, и снова перерыв, и так в течение месяца. Мне уже стало легче, но весь комплекс я пропью обязательно.

Как заказать

Для того чтобы оформить заказ лечение хронического простатита самые эффективные методы лечения необходимо оставить свои контактные данные на сайте. В течение 15 минут оператор свяжется с вами. Уточнит у вас все детали и мы отправим ваш заказ. Через 3-10 дней вы получите посылку и оплатите её при получении.



Отзывы покупателей:


Tata

Состав препарата Уротрин говорит о многом. Это натуральное и совершенно безопасное средство, заставляет организм мужчины работать, как настоящие швейцарские часы. Благодаря уникальной формуле и усиленной концентрации активных составляющих, воспаление снимается, эрекция нормализуется, простатит больше не беспокоит. Я считаю, что Уротрин значительно облегчил работу бесплатным врачам. Теперь они видят каждого пациента всего два раза — когда те приходят на обследование, и когда после лечения они спешат сказать — Спасибо, я совершенно здоров!

София

БЛАГОДАРЯ УРОТРИНУ 20 ТЫСЯЧ РОССИЙСКИХ МУЖЧИН УЖЕ ЗАБЫЛИ О БОЛИ И ПРОБЛЕМАХ МОЧЕИСПУСКАНИЯ


Боли были такие, что о сексе с молодой женой думать не мог. Страдал. Она мне принесла Уротрин. Через месяц меня не узнать. Здоров как бык. Боли нет, в туалет хожу как нормальный человек. Секс стал лучше. Где купить лечение хронического простатита самые эффективные методы лечения? От простатита никто не застрахован. Вот и меня настигли эти симптомы, в туалет нормально не сходить, о сексе и вообще нечего думать, у меня даже началась депрессия. Уротрин вернул мне нормальную жизнь, эффект проявился спустя пять дней применения. Принимал по схеме производителя, два раза в день перед едой. Содержимое пакетика необходимо развести в полстакана воды (тщательно размешать). Схема приема достаточно простая: 5 дней принимаем по два пакетика в день, потом два дня перерыв и затем снова 5 дней прием, и снова перерыв, и так в течение месяца. Мне уже стало легче, но весь комплекс я пропью обязательно.



Для того, чтобы эффективное лечение хронического простатита было достигнуто, надо знать по каким причинам он появляется. . Давайте начнем разбирать самые современные и наиболее эффективные методы лечения простатита у мужчин. 5 Самые эффективные народные средства для лечения простатита. 6 Диета и образ жизни. . Для терапии хронического простатита различного происхождения наиболее ценны фторхинолоны (Ципрофлоксацин, Левофлоксацин, Офлоксацин). Современные методы лечения включают. Современное лечение хронического простатита у мужчин – это комплекс мер . Народные методы. Для лечения простатита может применяться проверенная . Простатит – самый распространенный недуг не только среди российских, но и всех мужчин мира. Сегодня явление, по отзывам медиков, значительно. Лечение хронического простатита народными средствам — самые эффективные рецепты и методики. Как правильно лечить хронический простатит народными средствами. Наиболее эффективными при простатите являются следующие методы теплолечения . Хронический простатит – заболевание, тяжело поддающееся лечению, особенно если больной не соблюдает назначения лечащего врача и недостаточно ответственно подходит к вопросам организации. Для того, чтобы эффективное лечение хронического простатита было достигнуто, надо знать по каким причинам он появляется. . Давайте начнем разбирать самые современные и наиболее эффективные методы лечения простатита у мужчин. Виды хронического простатита. В зависимости от причины и. Как вылечить хронический простатит в домашних условиях: основные методы и рецепты. 2498. Автор статьи. Екатерина Эдуардовна Наконечная. Время на чтение: 7 минут. АА. Методы и средства лечения простатита. . Что такое простатит? Простатит — заболевание простаты или предстательной железы — весьма распространенная болезнь мужской . Ультразвук — один из самых действенных способов терапии. Заключается в воздействии ультразвуковых волн. Медикаментозное лечение простатита, методика терапии. Курс лечения хронического простатита. . Новейшие и эффективные методы лечения простатита. Простатит — это воспалительное заболевание предстательной железы. Патология встречается достаточно часто, почти каждый. Простатит – одно из самых распространенных среди мужчин урологических заболеваний, заключающееся в воспалении тканей предстательной железы и ее отеке.

https://ya-trader.com/upload/kakie_nedorogie_lekarstva_ot_prostatita7231.xml

http://topfruit.com.pl/images/realnoe_lechenie_prostatita1023.xml

http://christopherdallo.com/file/lechenie_prostatita_po_sunne4155.xml

http://www.hansstroeve.nl/UserFiles/omniks_lekarstvo_ot_prostatita1292.xml

http://www.recykla-glas.cz/media/images/upload/sredstvo_dlia_lecheniia_prostatita_i_povysheniia_potentsii4577.xml


У меня были довольно серьёзные проблемы с тем, что ниже пояса. Вроде бы физически был здоров, а как доходило до секса, так сразу всё на полшестого. Уже не знал, что и делать. Спросил совета в интернете, анонимно, там мне порекомендовали «Уротрин». Сейчас с эрекцией не только всё в порядке – могу жену несколько часов подряд! Надеюсь, вам это поможет.


лечение хронического простатита самые эффективные методы лечения


Уротрин – это полиактивный негормональный комплекс, препарат от простатита и для профилактики болезней предстательной железы и других заболеваний мочеполовой системы у мужчин. Также положительно влияет на потенцию, поэтому может использоваться в качестве интимного стимулятора (средство более безопасно, чем Виагра и ее аналоги). При простатите многие совершают ошибку и принимают только симптоматические медицинские средства от болей или для нормализации мочеиспускания. В итоге болезнь возвращается по 3–4 раза в год. На самом деле чтобы убрать болезнь, надо восстановить кровоток и лимфоток в тазу и железе, снять воспаление и запустить процессы естественной регенерации клеток. С этим вполне справляются натуральные средства, содержащие магний, цинк, селен, витамины А и D. Судя по составу, эти элементы в Уротрине имеются, так что его прием в комплексе с лекарствами ускорит выздоровление и закрепит результат.


Обзор недорогих, но эффективных свечей от аденомы простаты. Список суппозиториев с названиями, ценами и отзывами мужчин . Подробно про простатит. Характеристика причин, симптомов, диагностики и методов лечения простатита. Заходите! Главная. Лекарства. Лечение. Отзывы. Препараты. Изучаем отзывы на свечи от простатита и разбираемся с экспертами, что может быть действительно эффективно для лечения . Если забить в поисковик слово лечение простатита, тут же вылезает целый список свечей от простатита. Но, прежде чем понять, что они из себя представляют, давайте сначала. Лечение аденомы простаты и простатита имеет много общего, несмотря на различный патогенез заболевания. Свечи от аденомы простаты и простатита входят в схемы лечения заболеваний, преследуя различные цели: обезболивание, подавление воспаления, улучшение трофики тканей, восстановление. Свечи от аденомы простаты – лекарственные препараты в твердой форме, растворяемые от температуры тела. . Их можно использовать для лечения аденомы предстательной железы, от простатита, склероза простаты, кист. Но самолечением лучше не заниматься, так как есть диагнозы, когда. Свечи от простатита, эффективные и недорогие варианты суппозиториев для . Немногие мужчины знают, что суппозитории для лечения простатита можно . Из всего списка ставил Аденопросин, у меня аденома, реально облегчение наступило довольно быстро, стал гораздо реже в туалет ходить, и без напряга. Часто для лечения простатита и аденомы простаты урологи рекомендуют препараты комплексного действия, способные одновременно обезболивать и снимать воспаление, устранять мышечные спазмы, снизить температуру. Свечи при аденоме простаты воздействуют локально, не вредят органам пищеварения. . Свечи от аденомы простаты домашнего приготовления. В составе домашних свечей для лечения аденомы предстательной железы содержатся следующие компоненты: 30 граммов прополиса; 0,15 кг жира; 30 граммов. Лечение аденомы простаты с помощью суппозиториев. Какие свечи самые эффективные? Список препаратов и изготовление свечей в домашних условиях. . Тест на выявления симптомов простатита. Пройди тест и получи самые важные рекомендации. Пройти тест. Рекомендуемые клиники. Обзор свечей для лечения простатита: недорогие и эффективные препараты, цены, как сделать самостоятельно, как . Свечи от простатита производятся на основе натуральных и синтетических компонентов. Их назначают как в качестве вспомогательного средства параллельно с антибактериальными. Свечи при аденоме предстательной железы используются с целью устранения причин и симптомов патологического состояния. Активные компоненты препарата быстро проникают к очагу поражения, обеспечивая незамедлительный эффект. Многолетние исследования дока.

слов, корень дня: dis

Обнаружение вещей на расстоянии

Префиксы — это ключевые морфемы в английском словаре, с которых начинаются слова. Префикс dis- означает «отдельно»; сегодня мы будем dis охватывать много слов, в которых есть префикс dis- !

Римского бога Плутона также звали Дис, и, к счастью, этот бог подземного мира был dis tant от земли наверху или стоял «отдельно» от нее. Что, если Дис отправится в верхний мир со своим трехголовым псом Цербером? Представьте себе, насколько отличается от похожим, или «не похожим» на другие, которым был бы этот ужасный дуэт! Он и Цербер наверняка отвлекли бы от людей или отвлекли бы их от их обычных занятий, когда они гуляли по городу.Говоря о Цербере, представьте, что Дис отвел бы его в собачий парк — поговорите о dis , нарушающем или разрушающем «на части» обычный день игры для всех этих одноголовых собак! Приказ dis , или состояние «помимо» упорядоченности, которое последует, было бы радостным зрелищем. dis quiet, которое будет присутствовать, или состояние «помимо» спокойствия, утихнет, как только Дис уйдет в свой глубокий дом, таким образом потянув за собой действие dis , уйдя «отдельно» от того, чтобы быть там, надеюсь, для очень долгое время.

А теперь представим, что доктор Франкенштейн решает создать другого монстра, на этот раз самого себя. Ибо доктор поймал фатальную dis легкость, которая удерживает его физический комфорт «отдельно» от легкости. Это условие удерживает его с преимуществом dis , не позволяя ему быть лучшим. Чтобы добавить оскорбление к травме, в то время как означает захоронение мертвых тел или отделение этих тел от закопанных в землю, он показывает, что расположил свое плечо, отделяя его от обычного местоположения.К сожалению, упорный доктор доверяет dis кому-либо еще, кто копает за него, или удерживает их «отдельно» от своего доверия. Следовательно, он может вскоре заинтересоваться dis или отделиться от интереса ко всей концепции создания другого «я» и dis объединить его медицинскую команду, которая затем «разошлась бы» по разным районам страны.

Теперь вы больше не будете чувствовать комфорт dis при встрече со словами с приставкой dis- в них!

  1. дальний : стоять в стороне
  2. не похож на : «помимо» сходства
  3. отвлечь : разделить
  4. disrupt : разрыв «на части»
  5. беспорядок : «помимо упорядоченности»
  6. disquiet : «кроме тихого»
  7. исчезнуть : «помимо присутствия»
  8. болезнь : «помимо легкости»
  9. недостаток : «помимо преимущества»
  10. дезинтер : разбирать «отдельно от земли»
  11. вывих : разобрать «отдельно» от обычного места
  12. недоверие : «помимо того, что заслуживает доверия»
  13. бескорыстно : «помимо заинтересованности»
  14. расформировать : когда группа людей «расходится» друг с другом
  15. дискомфорт : быть «отдельно» от ощущения комфорта

История «болезни»: без легкости

Когда болезнь была впервые использована, она буквально относилась к «недостатку легкости или комфорта», а не к тому, как это используется сегодня для обозначения болезни или проблем с функциями организма. Болезнь и сегодня может использоваться для обозначения «неудобно», но обычно в слове «недомогание» используется дефис.

В середине апреля 2020 года, когда пишется эта статья, многие думают об одной конкретной болезни (хорошо, всем), но, поскольку слова — наша территория, мы собираемся сосредоточиться не на болезни как явлении. А на болезнь -много. Потому что слова завораживают, а слово болезнь изначально не имело того значения, которое оно имеет в настоящее время.

Первоначальное использование слова «болезнь»

Совершенно верно: когда впервые было использовано болезнь , оно не относилось к болезни, то есть к (как говорится в нашем определении) «состояние живого животного или растительного тела или одной из его частей, которое нарушает нормальное функционирование. и обычно проявляется отличительными признаками и симптомами ». Нет, первое значение болезни было гораздо более прозрачным, чем это. Как показывает добавление второго элемента к префиксу dis- , все дело в отсутствии легкости.

Ease не сильно изменился за свою 800-летнюю историю; Значения, которые он имеет в отношении состояния комфорта, включая свободу от боли или дискомфорта, были хорошо известны, когда болезнь вышла на сцену в 14 веке с ее «отсутствием легкости», что означает, что мы можем также понимать как неприятности, дискомфорт, беспокойство, страдания «.

Чосер использовал это слово таким образом в «Прологе Манципла» из Кентерберийских рассказов :

Где что мы тупица, что дрынке мы с нами карие.

Для этого wol turne rancor и DISSE

Т’акорд, любовь и много неправильных обезьян.

На современном английском языке это можно представить как:

Куда мы идем, хорошего питья несем с собой;

За это обратится злоба и все беспокойство

Согласиться и полюбить и умилостивить многих неверных.

Болезнь и болезнь

К концу 14 века, согласно Оксфордскому словарю английского языка, это значение «нехватка легкости» расширилось до особого вида недостатка легкости, связанного с плохим самочувствием, как общего термина для «болезни, недомогания».»Только в 16 веке болезнь использовалась для обозначения случая болезни или конкретных болезней и недомоганий.

Первоначальное значение слова болезнь до сих пор встречается в пунктирной форме, переданной в современном обиходе с помощью аккуратно поставленного дефиса:

Роман Дэвиса открывается пейзажами Вордсворта, внушающими тревогу и страх. Объект возвышенной, зарождающейся болезни впоследствии перемещается из красивых и угрожающих валлийских пейзажей в краудсорсинговую программу письма, вызывающую необъяснимое «падение тумана», одновременно разрушая авторскую собственность и изменяя мир природы до неузнаваемости.
— Кортни Трауб, The Arizona Quarterly , лето 2016

5 шагов для написания стихов о болезнях, травмах и исцелении

Пожалуйста, присоединитесь к Исследовательскому институту Бенароя в Вирджинии Мейсон (BRI) и автор / поэт Сюзанна Эдисон для Тело живет своей гибелью , a размышления в поэзии и изобразительном искусстве о жизни с аутоиммунным заболеванием в ратуше Сиэтла , среда, сентябрь.18 , , 19:00 . Билеты по 5 долларов США можно приобрести в ратуше в Сиэтле . Молодые люди в возрасте до 22 лет имеют право на бесплатные билеты (подробности см. В конце сообщения).

Работа Эдисон основана на ее личном опыте в качестве родителя ребенка с редким аутоиммунным заболеванием. Письмо стало для нее способом выразить весь спектр чувств, с которыми она столкнулась, и помочь другим использовать творческое выражение, чтобы понять и справиться с трудной реальностью жизни с хроническими заболеваниями.

Вот сообщение в блоге, которое она первоначально опубликовала для Hugo House , где она преподавала уроки письма для тех, кто испытал болезнь или травму.


Когда мы переживаем болезнь или травму, мы удерживаем ее в нашем теле.

Иногда события происходили в предсознательном возрасте, когда были очень молоды. Иногда они случаются с возрастом. Независимо от того, насколько молоды или стары, наши тела являются нашими хранилищами, и эти события могут нас разобрать.Они могут создать хаос там, где был порядок. Возможно, мы создали новый внутренний порядок, чтобы продолжать жить, возможно, защищая себя от боли, но это не значит, что мы были способны удерживать или преобразовывать каким-то образом те предыдущие или текущие события.

Письмо, и особенно стихи, могут быть средством или вместилищем для нашей эмоциональной, мыслящей и духовной личности.

1. С чего начать: переходить от абстракции к изображению.

Мы можем сказать «Мне больно», когда мы испытываем мучительную боль из-за нашего аутоиммунного заболевания, или «Я горю», когда говорим о потере любимого человека из-за хронической болезни.Но как на самом деле передать это ощущение кому-то другому? Слова «горе» и «боль» абстрактны; они имеют много значений и означают разные вещи для каждого из нас. Но мы можем найти слова, чтобы описать эти идеи. Изображение — это контейнер. Ритм и звук создают музыку в наших стихах, они являются контейнерами и транспортными средствами. Метафоры и сравнения, сравнивая это с этим, помогают нам найти слова, которые могут передать часть нашего опыта.

Мы можем передать чувства словами / музыкой, и это позволяет нам перейти от того, чтобы быть подавленными этими переживаниями, к способности думать и чувствовать одновременно.И это позволяет другим посочувствовать нам, когда слова «передают».

2. Сосредоточьтесь на одной части тела.

Один из подходов: вместо того, чтобы писать всем телом, сосредоточьтесь на одной части. Проведите инвентаризацию трупов. Сосредоточьтесь на своем дыхании, на том, где ему легче всего двигаться, а где нет.

Если вы скажете: «Мой желудок в узлах», разверните изображение: какие узлы, какого они цвета, из какого материала сделан узел, насколько он велик, издает ли он какие-либо звуки, делает ли это Напомнить вам каких-либо персонажей (реальных или вымышленных), можете ли вы сравнить его с животным?

Таким образом, вы можете составить целое стихотворение из одного аспекта вашего осознания.Вы можете писать стихи о своем телесном опыте, и ваш разум начнет устанавливать связи, которые могут привести вас в новое место.

3. Не думайте, что ваше стихотворение должно быть отличным для начала. Используйте ремесло, чтобы сформировать стихотворение.

Чаще всего мы можем использовать письмо, чтобы описать наши самые уязвимые или интуитивные переживания. Но это само по себе не может быть стихотворением.

Сначала наш опыт неудобоварим, и, как и еда, ему нужно время, чтобы разрушиться и стать полезным для нашего роста. Требуется время, чтобы позволить себе увидеть форму стихотворения и выработать самые необходимые слова, чтобы передать суть того, что мы надеемся сказать.

В большинстве случаев мы не знаем, что именно мы пытаемся сказать, и нам нужно позволить стихотворению направить нас к тому, что может быть скрыто в нас, но пытается говорить. Инструменты ремесла (разрывы строк, пустое пространство, изображение, метафора, повествование, точка зрения, время, созвучие, созвучие, метр и т. Д.) Помогают нам преобразовать слова в стихотворение.

4. Домашнее задание: следуйте своим инстинктам и находите подсказки для себя.

Держите записную книжку рядом с кроватью. Непосредственно перед сном запишите три образа, которые отражают то, что вы чувствуете.Если что-то происходит с вами ночью, просто запишите это; это также может помочь вам снова заснуть, если вы склонны размышлять над идеями по ночам.

В конце недели составьте список всех слов, а затем сделайте отдельный столбец слов, включающих их противоположности. Если слова имеют тенденцию к абстракции, посмотрите, сможете ли вы добавить изображения к этим словам. Затем попробуйте написать стихотворение, включающее как исходное изображение, так и его противоположность. Таким образом, вы можете прийти к новой идее, и стихотворение будет более динамичным или напряженным.

Вы также можете обнаружить, что способность удерживать две реальности, исходное чувство / образ и его противоположность, позволяет вам иметь более широкую перспективу вашего опыта. Это может помочь вам перейти от состояния страдания и боли к моментам исцеления или принятия. Стихотворение — лишь один из аспектов вас самих, не все вы, и «я» в стихотворении может быть частично вами, а не вами.

5. И наконец

Вы не обязаны никому показывать свое стихотворение! Вы можете писать только для себя, и это нормально.

О событии

Тело живет своей отменой состоится в среду, 18 сентября, в 19:00 в ратуше Сиэтла. Сюзанна Эдисон представит избранные стихотворения из книги «Тело живет своим разрушением», отражающих в поэзии и изобразительном искусстве жизнь с аутоиммунным заболеванием. Выступит президент BRI доктор Джейн Бакнер вместе с учеными, художниками и другими людьми, которые внесли свой вклад в создание этого буклета.

Это мероприятие является частью ежемесячного фестиваля «Возвращение домой», который проводится ратушей после масштабной реконструкции исторического здания.Билеты по 5 долларов США можно приобрести в ратуше в Сиэтле . Молодые люди в возрасте до 22 лет имеют право на бесплатные билеты. Копии буклета доступны на веб-сайте BRI , а также на мероприятии за 15 долларов США, и все доходы идут на медицинские исследования BRI.

О поэте

Сюзанна Эдисон, Массачусетс, МИД, поэтесса, педагог и бывший терапевт. Она вела семинары для родителей и медицинских работников о влиянии хронических заболеваний на семьи в Детской больнице Сиэтла (SCH), NIH, а также на национальных конференциях для Cure JM Foundation.Она создала группу писателей для родителей детей с хроническими заболеваниями в SCH и семинар «Подростки, пишущие от всего сердца и исцеление» в Одесской детской клинике Брауна. Она имеет степень магистра в области творческого письма Университета Лесли в Кембридже, Массачусетс. Ее последняя книга «Тело живет своим разрушением» была опубликована в 2018 году Исследовательским институтом Бенароя в Вирджинии Мейсон. Это исследование в области поэзии и визуального искусства об аутоиммунных заболеваниях, основанное на интервью с исследователями, врачами, пациентами и лицами, осуществляющими уход.

Сюзанна — получатель грантов от Artist Trust, 4Culture of King County, Сиэтлского управления искусства и культуры и будет стипендиатом Hedgebrook осенью 2019 года.

Некоторые из работ Сюзанны можно найти в ее первых главу «Мир, поедаемый молью», а также в следующих журналах и антологиях: Michigan Quarterly Review; Обзор реки Наугатук; JAMA; CMAJ; Исцеляющее искусство письма, Vol. Я; Журнал Исследованной Жизни; Лицом к лицу: женщины-писательницы о вере, мистицизме и пробуждении.Ее работы можно прочитать в различных других журналах и на ее веб-сайте. www.seedison.com


Этот пост был первоначально опубликован в блоге «From the House» сиэтлского литературного центра Hugo House и воспроизведен с их разрешения. Вы можете просмотреть исходное сообщение блога здесь .

Изображение баннера Мэтью Генри на Unsplash

Травмы иглой и острыми предметами: ответы OSH

Предупреждение травм — самый эффективный способ защитить рабочих.Комплексная программа предотвращения травм от колющих предметов будет включать:

  • Рекомендуемые руководящие принципы.
  • Улучшенная конструкция оборудования.
  • Эффективные системы утилизации.
  • Обучение сотрудников.
  • Безопасные процедуры повторной упаковки, если это необходимо.
  • Программы наблюдения.

Центр инфекционных заболеваний и инфекционного контроля при Агентстве общественного здравоохранения Канады (PHAC) рассматривает, публикует и обновляет инструкции по защите персонала от воздействия всех возбудителей инфекций в медицинских учреждениях.Текущее руководство называется «Обычные методы и дополнительные меры предосторожности для предотвращения передачи инфекции в медицинских учреждениях».

Предотвращение травм от уколов острыми предметами и иглами считается частью «рутинной практики», используемой медицинскими работниками.

Рабочие, использующие острые предметы, нуждаются в обучении и обучении в рамках программы предотвращения травм, связанных с острыми предметами. Рабочие должны быть обучены тому, как защитить себя во время использования и защитить других, кто может столкнуться с устройством во время или после процедур.

Поощряется использование устройств с повышенной безопасностью, таких как защищенные игольные устройства или безыгольные системы с самоуплотняющимися портами и шприцы. PHAC заявляет, что использование таких защитных устройств требуется в некоторых юрисдикциях. При использовании этих устройств необходимо учитывать как безопасность медицинского работника, так и пациента.

PHAC рекомендует:

  • Иглы не заменять колпачками. Использованные предметы следует немедленно поместить в специальный устойчивый к проколам контейнер, который легко доступен в месте оказания медицинской помощи.
  • Медицинские работники должны постоянно прикрывать открытые участки кожи или поражения на руках и руках сухой повязкой. Гигиена рук по-прежнему важна, поэтому необходима консультация, если повязка мешает этой процедуре.
  • Глаза, нос и рот должны быть защищены, если ожидается разбрызгивание крови или биологических жидкостей.
  • Немедленно окажите первую помощь, если кто-то попал в контакт с кровью или биологическими жидкостями. Первая помощь должна включать:
    • Тщательно промыть место травмы проточной водой и, если возможно, осторожно промыть водой с мылом.
    • Промыть глаза, нос или рот проточной водой, если они подверглись воздействию.
    • Сломанную кожу необходимо тщательно промыть.
  • Немедленно сообщите об инциденте своему работодателю.
  • При необходимости следуйте инструкциям медицинских специалистов по дальнейшему лечению и наблюдению.

PHAC также ссылается на CDC «Рабочая тетрадь по разработке, внедрению и оценке программы предотвращения травм от колющих предметов» в качестве примера программы.В этой рабочей тетради используется иерархический подход к контролю, в том числе:

Исключение — поиск способов устранения или сокращения использования игл во время процедур, доставки лекарств и сбора образцов.

Технические средства контроля — устраните или изолируйте опасность с помощью контейнеров для утилизации острых предметов или других устройств со встроенной функцией предотвращения травм. Устройства безопасности следует выбирать с осторожностью, поскольку ни одно устройство или стратегия не сработают в любой ситуации.

Средства контроля рабочей практики — Меры, которые могут быть предприняты для уменьшения травм, включают использование инструментов для захвата игл или загрузки / выгрузки скальпелей, недопущение передачи острых предметов из рук в руки, отделение острых предметов от других отходов, запрет на перенос мусора или белья мешки, прилегающие к телу и т. д.

Средства индивидуальной защиты (СИЗ) — СИЗ следует использовать в качестве последней меры контроля, где это уместно.

В ситуациях, когда пересмотр считается необходимым, разработайте безопасные подходы, которым могут следовать рабочие.Рабочие никогда не должны приближать открытый кончик иглы к незащищенной руке. Повторите это, положив колпачок на плоскую поверхность и набросив его на кончик шприца, который держится в одной руке. Держите свободную руку подальше от интродьюсера и позади обнаженной иглы.

Кроме того, все работники, входящие в группу риска, должны знать, что существует вакцина против гепатита B.

Вот сокращения Трампа по программам, ответственным за борьбу с коронавирусом

  • Президент Дональд Трамп во вторник настаивал на том, что коронавирус, известный как вирус COVID-19, находится под контролем, потому что Китай «очень много работает», чтобы сдержать его распространение.
  • Комментарии президента не соответствуют действительности. В тот же день CDC объявил, что ожидается, что вирус распространится в США настолько, что вызовет «нарушение повседневной жизни».
  • Администрация Трампа также провела последние несколько лет, демонтируя те самые правительственные программы, которые отвечают за борьбу с глобальным кризисом в области здравоохранения.
  • Посетите домашнюю страницу Business Insider, чтобы узнать больше.

Президент Дональд Трамп провел большую часть вторника, заверяя общественность в том, что коронавирус находится под контролем.

«Китай очень, очень много работает», — сказал Трамп журналистам на деловом круглом столе в посольстве США в Нью-Дели. «Я разговаривал с президентом Си, и они очень много работают. Если вы что-нибудь знаете о нем, я думаю, он будет в довольно хорошей форме. У них были тяжелые времена, но теперь похоже, что они получают это больше и больше под контролем. Я думаю, что эта проблема исчезнет ».

Комментарии Трампа не соответствуют действительности.

Коронавирус, или вирус COVID-19, возник в Ухане, Китай, убил 2700 человек и распространился в 30 странах.В США зарегистрировано не менее 36 подтвержденных случаев заболевания, включая репатриированных граждан.

Во вторник Центры по контролю и профилактике заболеваний объявили, что ожидают дальнейшего распространения вируса в США.

«Вопрос не столько в том, случится ли это больше в этой стране, сколько в том, когда это произойдет», — сказала д-р Нэнси Мессонье, директор Национального центра иммунизации и респираторных заболеваний. пресс-звонок во вторник.«Мы просим американскую общественность подготовиться к ожиданиям того, что это может быть плохо».

Мессонье также сказал, что агентство «готовится, как будто мы увидим распространение сообщества в ближайшем будущем», добавив, что вспышка вскоре может привести к «нарушению повседневной жизни».

Опасения пандемии возникли после того, как администрация Трампа провела последние несколько лет, уничтожая те самые правительственные программы, которые призваны бороться с таким кризисом.

В 2018 году, например, CDC сократил 80% своих усилий по предотвращению глобальных вспышек болезней, потому что у него заканчивались деньги.В конечном итоге отдел перешел из 49 стран всего в 10.

Вот некоторые другие действия, которые администрация Трампа предприняла для отмены программ государственных расходов, связанных с борьбой с распространением глобальных болезней, согласно Foreign Policy:

  • Shutting down весь отдел глобальной безопасности здоровья и безопасности Совета национальной безопасности.
  • Ликвидация Фонда комплексных кризисов правительства США в размере 30 миллионов долларов.
  • Сокращение национальных расходов на здравоохранение на 15 миллиардов долларов.
  • Последовательная атака на Марка Грина, директора Агентства США по международному развитию.

CDC работает над новым тестом для выявления коронавируса, но, согласно журналу New York, проблемы с разработкой теста привели к тому, что только три из 100 лабораторий общественного здравоохранения были оборудованы для проверки на наличие вируса. Более того, каждый тест стоит 250 долларов, а у Департамента здравоохранения и социальных служб уже не хватает денег для финансирования адекватного реагирования на вспышку.

Администрация Трампа недавно запросила 2,5 миллиарда долларов в виде чрезвычайных фондов — 1,25 миллиарда долларов в виде нового финансирования и 1,25 миллиарда долларов, которые должны быть отвлечены от других федеральных программ, — для помощи в подготовке и реагировании на случаи коронавируса в США.

Но законодатели-демократы и эксперты в области здравоохранения упрекали администрацию в том, что она не зашла достаточно далеко для борьбы с кризисом.

Экономические последствия нереализованной вспышки значительно превзойдут расходы США на усилия по борьбе с ней, сказал Марк Липсич, эпидемиолог и директор Центра динамики инфекционных заболеваний в Гарвардском университете Т.Школа общественного здравоохранения Х. Чана, сообщает Insider.

«Кажется совершенно неадекватным и абсурдным отвлекать средства от одной серьезной эпидемии к другой», — сказал Липсич о пакете экстренного финансирования. «Деньги для контроля — очень важное вложение».

Loading Что-то загружается.

инженерных белков для борьбы с опустошительными болезнями | Источник

По мере того, как продолжительность жизни человека увеличивается, определенные белки в нашем организме все более склонны принимать альтернативные формы.Эти неправильно свернутые белки могут в конечном итоге вызвать нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, Паркинсона и болезнь Лу Герига, официально известная как боковой амиотрофический склероз (БАС).

Jackrel

Мередит Джекрел, доцент кафедры химии в области искусств и наук Вашингтонского университета в Сент-Луисе, разрабатывает стратегии, позволяющие клеткам лучше справляться с этими разрушительными заболеваниями. Джекрел недавно получил пятилетний грант от Национального института здоровья (NIH) и еще один от Фонда долгой жизни на изучение белковых дезагрегаз — эволюционированных форм белка, которые смягчают неправильную укладку белков — в качестве стратегии борьбы с этими заболеваниями.

Ее лаборатория изучает несколько естественных белковых дезагрегаз в надежде разработать их, чтобы улучшить их возможности.

Белок дрожжей, известный как Hsp104, привлек внимание Джекрел во время ее постдокторских исследований. Она и другие исследователи знали, что дрожжи содержат этот белок, регулирующий прионы, что по-другому обозначает неправильно свернутые белки. Они посчитали, что если он может делать это с дрожжами, то, возможно, он может работать с неправильно свернутыми белками, которые вызывают нейродегенеративные заболевания у людей.

«Мы выяснили, что Hsp104 может разбирать множество различных белков, связанных с нейродегенеративными заболеваниями. Мы также использовали белковую инженерию, чтобы разработать его форму, которая растворяет множество различных агрегированных белков, таких как TDP-43 при БАС и α-синуклеин при болезни Паркинсона. Теперь думается, что он может растворить других », — сказал Джекрел.

Поскольку этот белок содержится в дрожжах, растениях и других микробах, но не в животных, использование его потенциала для использования человеком является сложной задачей. Но исследователи полагают, что существуют человеческие белки, которые можно использовать аналогичным образом.

Подробнее о работе в Амперсанде.

Аддуцин регулирует разборку саркомеров во время митоза кардиомиоцитов

Введение

Потеря кардиомиоцитов является ведущей причиной сердечной недостаточности, которая является разрушительным прогрессирующим заболеванием, поражающим более 30 миллионов пациентов во всем мире 1 . Хотя в сердце взрослых млекопитающих происходит ограниченное обновление кардиомиоцитов, этого недостаточно для восстановления сократительной функции после потери кардиомиоцитов, что приводит к кардиомиопатии 2–7 Следовательно, стимуляция регенерации кардиомиоцитов является основной целью восстановления сердца при кардиомиопатии.В отличие от некоторых низших позвоночных, которые обладают способностью к регенерации сердца в течение всей жизни 8–14 , кардиомиоциты взрослых млекопитающих навсегда выходят из клеточного цикла вскоре после рождения и обладают очень ограниченным регенеративным потенциалом. Исследования на сердцах новорожденных мышей показали, что апикальная резекция или инфаркт миокарда (ИМ) мышей постнатального дня 1 (P1) приводит к устойчивому регенеративному ответу, однако эта способность теряется P7, что совпадает с остановкой клеточного цикла послеродовых кардиомиоцитов 15, 16 На сегодняшний день идентифицировано несколько регуляторов клеточного цикла кардиомиоцитов 17–23 , однако неясно, существуют ли специфические для мышц факторы, которые регулируют митоз в кардиомиоцитах.

Плотный миофибриллярный состав кардиомиоцитов представляет собой особую проблему во время митоза, что является соображением, которого нет в других клетках без поперечно-полосатой линии. У взрослого кардиомиоцита саркомеры занимают более 60% цитоплазмы кардиомиоцитов 24 и прикрепляются к плазматической мембране, вызывая деформацию клетки во время сокращения. Важной и интересной особенностью регенерирующего сердца является разборка саркомеров кардиомиоцитов 15,25,26 и их периферическая маргинализация во время митоза кардиомиоцитов 27 .Этот феномен давно наблюдался при делении кардиомиоцитов и оказался надежным индикатором митоза кардиомиоцитов в раннем постнатальном сердце 15,17,22,28 Однако на сегодняшний день механизмы, которые регулируют разборку саркомеров, не изучены. Более того, неясно, играет ли регуляция разборки саркомеров роль в потере регенеративной способности сердца новорожденных с увеличением постнатального возраста. В текущем исследовании мы намеревались идентифицировать регуляторы разборки саркомеров кардиомиоцитов во время митоза.Мы обнаружили, что цитоскелетный регуляторный белок аддуцин является критическим регулятором разборки саркомера.

Результаты

Аддуцин преимущественно экспрессируется во время неонатального регенеративного окна и тесно связан с разборкой саркомера

Иммуноокрашивание регенерирующего сердца новорожденного демонстрирует клиренс цитоплазматического саркомера и локализацию тропонина Т (Tnocynt2) на периферии сердечной мышцы . Эта ассоциация Tnnt2 с разобранными саркомерами, таким образом, может быть использована для понимания других белков, связанных с разборкой.Поэтому мы сравнили протеомные профили, ассоциированные с Tnnt2, с помощью масс-спектрометрии (MS) после коиммунопреципитации (Co-IP) с антителом Tnnt2 на двух разных стадиях развития; Через 3 дня после инфаркта миокарда (ИМ) в точке P1 (P1MI), момент времени, связанный с устойчивой пролиферацией кардиомиоцитов, и 3 дня после инфаркта миокарда в точке P7 (P7MI), момент времени, в котором отсутствует митотическая индукция кардиомиоцитов (рис. 1B) 15, 16 . Среди 224 идентифицированных белков мы обнаружили, что 80% из них были белками, связанными с цитоскелетом.На рис. 1С перечислены выбранные белки цитоскелета или саркомеры, идентифицированные с помощью МС. α-спектрин является одним из наиболее распространенных белков в списке образца P1MI, но мало экспрессируется в образце P7MI. Мы также обнаружили, что α- и γ-аддуцин по-разному ассоциированы с Tnnt2 во время регенеративного окна. Хотя оба белка были слабо обнаружены с помощью MS, они были обнаружены только в образце P1MI. Предыдущие исследования немышечных клеток показали, что аддуцин регулирует взаимодействие спектрина с актином с образованием решетки для механической поддержки плазматических мембран. Известно, что аддуцин является последующим эффектором нескольких сигнальных путей, как важный регулятор, контролирующий взаимодействия спектрина. , актин и другие белки цитоскелета и мембраны в эритроцитах 30 , эндотелиальных клетках 31,32 и центральной нервной системе 33 , однако почти ничего не известно о его функции в мышечных клетках или кардиомиоцитах.Аддуцин имеет три изоформы: α-аддуцин (ADD1), β-аддуцин (ADD2) и γ-аддуцин (ADD3), которые кодируются разными генами, но имеют очень гомологичные домены головы, шеи и хвоста 34 . Аддуцины образуют гетеродимеры за счет взаимодействия в головном домене α- / β- или α- / γ-аддуцина. α- / γ-Аддуцин повсеместно экспрессируется во всех тканях, тогда как β-аддуцин ограничен эритроцитами или клетками мозга 35 . Затем уменьшение α-аддуцина с помощью Tnnt2 было подтверждено с помощью обратного Co-IP, в котором антитело Add1 использовалось в качестве приманки, а полученные в результате белки преобразования были обнаружены антителом Tnnt2 (рис.1D). Ассоциация аддуцина с саркомерным белком α-актинином также была подтверждена Co-IP и WB (рис. 1D). Исследование экспрессии эндогенного белка аддуцина с помощью WB показало, что экспрессия как α-, так и γ-аддуцина снижалась с увеличением постнатального возраста (рис. 1E). Затем мы исследовали с помощью иммуногистохимии характер экспрессии α-аддуцина, γ-аддуцина, α-спектрина и α-филамина, которые были 4 из самых популярных результатов на скрининге MS (рис. 1F). Мы обнаружили, что аддуцин и спектрин только совместно локализовались с разобранным саркомером в пролиферирующих кардиомиоцитах, где они были связаны с мембранозной и субмембранозной областями.α-Филамин показал заметную картину окрашивания ядер в непролиферативных клетках и слабую цитоплазматическую картину в клетках пролиферации. Эти результаты подтверждают ассоциацию аддуцина с пролиферирующими кардиомиоцитами в сердце новорожденного.

Рисунок 1. Идентификация аддуцина как ключевого белка, связанного с разборкой саркомера.

A. Схема показывает морфологию разборки саркомера. B. Схема Co-IP / MS с помощью раскрывающегося списка TNNT2. C. В таблице перечислены выбранные белки, ассоциированные с TNNT2, идентифицированные с помощью Co-IP / MS.* PSM: соответствие пептидного спектра. Количество спектров, присвоенных пептидам, которые способствовали заключению о белке. ** MIC Sin: нормализованная статистика спектрального индекса для белка для конкретной группы. Рассчитывается по интенсивности ионов фрагментов в каждом спектре, относящемся к белку. *** Соотношение: количественное соотношение белка между группами, полученное на основе значения MIC Sin. D. Коиммунопреципитация ADD1 из всех экстрактов сердца в точках P1 и P7, исследованная на TNNT2 и α-актинин. E. (слева) Представитель WB для демонстрации профиля эндогенной экспрессии ADD1 и ADD3 в разном возрасте. (Справа) Количественная оценка уровня экспрессии аддуцина относительно внутреннего контроля GAPDH. (n = 3 в группе). F. Экспрессия четырех выбранных цитоскелетных белков по результатам МС, α-, γ-аддуцин, спектрин и филамин были окрашены в сердцах новорожденных, показывая профиль пролиферации (слева) и непролиферации (справа) кардиомиоцитов. Стрелки указывают на репрезентативные ячейки. Стрелки на изображениях, окрашенных филамином, относятся к расположению ядра.Масштабная линейка = 10 мкм.

Сверхэкспрессия изоформы 2 α-аддуцина может разбирать саркомеры у молодых

Альтернативный сплайсинг является важной посттранскрипционной регуляцией в генах, специфичных для мышц 36,37 . Он также играет важную роль в развитии сердца и кардиомиопатии 38–40 . До сих пор почти все публикации об α-аддуцине были сосредоточены на варианте 1, который кодирует полноразмерный Add1. Согласно информации от Ensembl, Add1 имеет 15 вариантов сплайсинга, в результате чего образуются две основные изоформы, изоформа 1 и 2.Их различие заключается в экспрессии экзона 15, который имеет стоп-кодон в рамке считывания (рис. 2A, верх). Следовательно, включение экзона 15 будет транскрибировать вариант 2, который кодирует более короткую изоформу 2, лишенную ~ 100 аминокислот на С-конце. С другой стороны, транскрипция с исключением экзона 15 будет давать полноразмерную изоформу 1 α-аддуцина (рис. 2A внизу). Мы исследовали уровень эндогенной экспрессии изоформы 2 в сердце в разном возрасте с помощью WB (рис. 2Б). Мы обнаружили, что уровни экспрессии изоформы 2 следовали той же схеме, что и изоформа 1, где она также снижается с постнатальным возрастом в сердце мыши.Чтобы выяснить потенциальную роль Add1 в разборке саркомеров в кардиомиоцитах, мы создали конструкции для индивидуальной экспрессии изоформы 1 (Add1 i1) и 2 (Add1 i2) WT и упаковали их в аденоассоциированный вирус (AAV). Мы использовали кардиотропный AAV6, несущий различные изоформы в миоцитах желудочка новорожденных крыс (NRVM) (рис. 2C), чтобы определить влияние экспрессии аддуцина на разборку саркомера. AAV6-GFP был включен в качестве контроля. Очищенные вирусы использовали для заражения культивируемых NRVM с титром 5 × 10 4 векторного генома на клетку (vg / клетку) в течение 72 часов до фиксации.Чтобы количественно оценить степень разборки саркомера, мы заранее определили три типа паттернов; саркомеры в собранном, частично разобранном и полностью разобранном виде. Частично разобранный саркомер относится к миоцитам с любыми видимыми саркомерами, тогда как полностью разобранный саркомер — это миоциты без каких-либо саркомеров. Мы обнаружили, что 61,9% NRVM со сверхэкспрессией Add1 i1 показали частично разобранные саркомеры (рис. 2C-i), в то время как 10,8% положительных клеток Add1 i1 показывают полностью разобранные саркомеры, где саркомеры не были обнаружены (рис.2C-ii). Сверхэкспрессия с помощью Add1 i2 приводила к частичной дизассемблированию 49,1% и полной разборке на 50,8% (рис. 2C iii, iv). Эти результаты показывают, что сверхэкспрессия Add1 i2 более эффективна в индукции разборки саркомера, чем Add1 i1. Затем мы попытались создать кардиоспецифичную трансгенную (TG) модель, в которой экспрессия Add1 i2 управляется промотором α-MHC (Fig. 2D Top). Трансгенные мыши Add1i2 не показали значительных различий в размере и морфологии сердца по окрашиванию H&E (рис. 2D внизу слева) или HW / BW (рис.2D внизу справа). Когда мы сравнивали паттерн сверхэкспрессии аддуцина на P14 и P28, мы отметили относительное снижение Add1 на P28 по сравнению с сердцами P14 (рис. 2E). Важно отметить, что мы обнаружили, что сердца P14 демонстрировали признаки разборки саркомера, а сердца P28 — нет (рис. 2F). Оценка систолической функции левого желудочка с помощью эхокардиографии не показала какой-либо заметной разницы между WT и Add1i2 TG сердцами (рис. S1A). Наконец, мы наблюдали значительное увеличение ph4-положительных кардиомиоцитов Add1i2 TG на p14 (рис.S1B) без изменения размера кардиомиоцитов (рис. S1C). Эти результаты подтверждают, что специфическая для кардиомиоцитов избыточная экспрессия Add1 i2 вызывает временное усиление разборки саркомеров, которое не сохраняется до взрослого возраста.

Рисунок 2. Сверхэкспрессия изоформы 2 Add1 разрушает саркомеры кардиомиоцитов.

A. (вверху) Схема экзонов и интронов гена Add1 . Красный прямоугольник представляет экзон 15, который является целью альтернативного сплайсинга. (Внизу) Схема показывает включение или исключение экзона 15 в событиях альтернативного сплайсинга мРНК.Соответствующая схема транслируемого белка показана рядом с мРНК. Включение экзона 15 имеет код остановки в рамке считывания, который генерирует изоформу 2 ADD1, состоящую из 636 аминокислот (а.о.). Исключение экзона 15 транслируется в изоформу 1 ADD1, составляющую 732 а.о. B. Вестерн-блот показывает эндогенный профиль изоформы 2 ADD1 в разном возрасте. GAPDH используется в качестве внутреннего контроля. C. Типичные изображения NRVM, трансдуцированные с помощью AAV6-Add1i1 (i, ii), AAV6-Add1i2 (iii, iv) и AAV6-GFP (v) на 3-й день.Схемы кассет экспрессии AAV показаны с изображениями каждой группы. Клетки фиксировали и иммуноокрашивали α-актинином (ACTN2, красный) для выявления саркомерной организации. Зеленая флуоресценция представляет собой либо изоформу аддуцина 1 и 2, либо GFP. Справа показаны изображения квадратичных областей с большим увеличением. Пунктирными линиями обозначена граница кардиомиоцитов. (i) и (iii) представляют собой частично разобранные саркомеры. (ii) и (iv) представляют собой полностью разобранные саркомеры. (v) представляет собранные саркомеры.Процент изменений сборки саркомера с помощью AAV показан на графике. D. (вверху) Схема, показывающая стратегию создания отдельной трансгенной линии изоформы 2 Add1. (Внизу слева) H&E окрашивание WT и кардиоспецифичных трансгенных Add1 i2. Масштабная линейка = 1 мм. (Внизу справа) Соотношение массы сердца к массе тела у контрольных и кардиоспецифичных трансгенных Add1i2. E. (вверху) Изображения, демонстрирующие паттерн экспрессии трансгенного ADD1 i2 на P14 и P28. (Внизу) Изображение квадрата области с большим увеличением на верхних панелях.Масштабная линейка = 10 мкм. F. (вверху) Репрезентативные изображения, показывающие образец саркомера трансгенного ADD1 i2 на P14 и P28. Врезки — изображения одиночных кардиомиоцитов (области в квадрате) с большим увеличением. Пунктирными линиями нанесены внешние и внутренние границы саркомеров. (Внизу) График количественной оценки, показывающий степень разборки саркомера. Оценки разборки были определены как: (внешняя область — внутренняя область) / внешняя область. Соответствующие по возрасту матки помета мышей WT использовали в качестве контроля. На P14 трансгенные мыши ADD1 i2 имеют значительно более тонкую саркомерную зону с центральным клиренсом по сравнению с контролем.Данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двустороннего теста t .

Роль фосфорилирования α-аддуцина в митозе кардиомиоцитов новорожденных

Ранее были идентифицированы несколько фосфо-сайтов аддуцина, которые регулируют паттерны дифференциальной экспрессии. Чтобы понять, участвует ли фосфорилирование аддуцина в регуляции разборки саркомера кардиомиоцитов, мы исследовали паттерн эндогенной экспрессии фосфо-изоформ α-аддуцина в сердце новорожденных мышей (рис.3А). Предыдущие исследования показали, что фосфорилирование α-аддуцина по Thr445 и Thr480 в шейном домене усиливает рекрутирование спектрина на F-actin 31 . Окрашивание неонатальных сердец антителом против фосфо-Thr455 показало локализацию в клеточной коре только в миоцитах с разобранным саркомером (стрелки), но в ядре кардиомиоцитов нераспространения (стрелки). Также сообщалось, что α-аддуцин фосфорилируется циклин-зависимой киназой 1 (CDK1) по Ser12 и Ser355 в головном домене, чтобы связываться с митотическими веретенами 32 .Мы обнаружили, что митотические кардиомиоциты демонстрируют колокализацию Ser355 в цитоплазме митотических кардиомиоцитов (стрелка). В других исследованиях сообщалось, что Ser716 и Ser726 (S714 и S724 у мышей соответственно) расположены в C-концевом миристоилированном домене, связанном с богатым аланином субстратом C-киназы (MARCKS), и являются субстратами для протеинкиназ A (PKA) и C ( PKC). Фосфорилирование этого домена ингибирует рекрутирование спектрина на актиновые филаменты и вызывает разборку сети спектрин-F-актин 41 .Наши результаты показывают, что фосфорилирование S724 не происходит в кардиомиоцитах новорожденных in vivo. Кроме того, аддуцин может фосфорилироваться PKA по Ser408, Ser436 и Ser481, что ингибирует его связывание с комплексом спектрин-F-актин 42 . Мы обнаружили, что фосфорилирование S724 или S481 не происходит в кардиомиоцитах новорожденных. Мы также исследовали корреляцию экспрессии фосфо-аддуцина со стадией клеточного цикла кардиомиоцитов как in vitro, и in vivo. Иммунофлуоресцентное окрашивание антителом pT445 в NRVM (рис.3B) и сердце P4 (фиг. S2A) подтвердили корреляцию экспрессии аддуцина с митозом кардиомиоцитов. В профазе pT445, по-видимому, является ядерным, тогда как в прометафазе с инициацией разборки аддуцин pT445 экспрессируется как в цитоплазме, так и в митотической хромосоме. Экспрессия аддуцина остается цитоплазматической через телофазу. WB паттерна экспрессии аддуцина фосфо-T445 указывает на то, что его экспрессия снижается с возрастом, что соответствует тому же паттерну WT Add1 (фиг. 3C). Этот паттерн экспрессии фосфо-аддуцина T445 / T480 во время митоза кардиомиоцитов предполагает, что фосфорилирование T445 и T480 может играть важную роль в разборке саркомеров.

Рис. 3. Роль фосфомиметика Add1 i1 при разборке саркомера.

A. Паттерн экспрессии эндогенного фосфоаддуцина в сердце новорожденных мышей. Схема расположения фосфозита показана слева. Справа: изображения иммуноокрашивания показывают изображения совместного окрашивания антител к фосфоцентрам с саркомерным белком TNNT2 или α-актинином. Сверху вниз расположены фосфо-сайты T445 / T480, S12 / S355, S714 / S724 и S408 / S436 / S481. Стрелки указывают фосфо-аддуцин, совместно локализованный с разобранными саркомерами.Стрелки указывают на совместную локализацию с собранными саркомерами. B. Эндогенная экспрессия фосфоаддуцина Т445 в NRVM, окрашенная α-актинином (красный), антифосфоаддуцином pT445 (зеленый) и DAPI. Фосфо-аддуцин перемещается из ядра в цитоплазму во время митоза. C. (вверху): исследование WB уровня экспрессии эндогенного фосфо-T445. (Внизу) Количественная оценка уровня экспрессии pT445 относительно уровня экспрессии ADD1. D. Сверхэкспрессия аддуцина фосфо- или нефосфомиметика T445 / T480 в NRVM, индуцированная AAV6.(Вверху слева). Схематическая диаграмма челночного вектора AAV показывает, что мутанты аддуцина экспрессируются с 3 тандемными эпитопами FLAG в рамке считывания на N-конце. (Внизу слева) Иммунофлуоресцентное окрашивание антителом к ​​α-актинину для выявления саркомерной структуры. Мутанты аддуцина выявляются антителами Flag в зеленом цвете. Справа были показаны изображения репрезентативной области с большим увеличением (белый прямоугольник). Пунктирные линии были нарисованы вокруг границы камеры. (Справа) Количественный анализ разобранных саркомеров, индуцированных сверхэкспрессией аддуцина.Масштабная линейка = 10 мкм. E. (вверху). Схемы, демонстрирующие стратегию создания кардиоспецифического индуцибельного отдельного трансгенного фосфора Add1 i1 (p-TRE T445E / T480E, α-MHC tTA). (Внизу слева) H&E окрашивание контрольного и кардиоспецифического трансгенного фосфата Add1 i1. Масштабная линейка = 1 мм. (Внизу справа) Соотношение массы сердца к массе тела у контрольных и кардиоспецифичных фосфо-одиночных трансгенных животных. F. (вверху) Изображения, демонстрирующие паттерн экспрессии трансгенного фосфо-Add1i2 на P14 и P28. (Внизу) Изображения с большим увеличением селективных кардиомиоцитов, имитирующих гиперэкспрессию фосфо-аддуцина.На P14 мы видели фосфо-мимические экспрессии как в цитоплазме, так и на мембране (внизу слева). На P28 фосфо-мимический аддуцин экспрессируется на мембране и в ядре (внизу справа). Масштабная линейка = 10 мкм. G. (слева) Репрезентативные изображения, демонстрирующие структуру саркомера трансгенного фосфо-ADD1 i1 на P14 и P28. Вставки представляют собой изображения одиночного кардиомиоцита с большим увеличением. Пунктирными линиями проведены по внешнему и внутреннему краям кардиомиоцитов. (Справа) Количественный график, показывающий разборку саркомера.Оценки разборки определяли так же, как и у трансгенного Add1i2 на фиг. 2F. Масштабная линейка = 10 мкм. Масштабная линейка = 10 мкм. Данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двустороннего теста t . Данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двустороннего теста t .

Чтобы определить, влияет ли избыточная экспрессия фосфорилированного аддуцина в кардиомиоцитах на разборку саркомера, мы сконструировали серию мутантов аддуцина, имитирующих фосфорилированный и нефосфорилированный аддуцин посредством сайт-направленного мутагенеза (фосфо-мимического и фосфо-молчащего).Замена на Glu имитирует форму фосфорилирования аддуцина, в то время как мутация на Ala имитирует нефосфорилированную форму. В конструкции дополнительно упаковывали вспомогательную плазмиду для создания рекомбинантного вируса AAV6. Морфологию саркомера исследовали путем окрашивания антителом к ​​α-актинину и совместной локализации с FLAG-положительными клетками. Наши результаты демонстрируют, что почти 60% Add1-положительных кардиомиоцитов с фосфомиметической сверхэкспрессией (T445E / T480E) демонстрируют полную разборку саркомера по сравнению с кардиомиоцитами, инфицированными фосфо-молчащей формой (T445A / 480A), что в основном индуцировало частичную разборку саркомера (рис.3D). Мы также создали фосфо-мимические и фосфо-молчащие мутанты по фосфо-сайтам S12 / S355 и S714 / S724. Заражение NRVM AAV6, несущим эти фосфомутанты, не показало значительного увеличения полной разборки саркомера (рис. S2B и S2C), хотя фосфо-молчащая форма S714 / S724 действительно показала более высокие показатели полной разборки по сравнению с фосфо-мутантами. мимическая форма. Поэтому мы сосредоточились на фосфо-сайтах T445 / T480, чтобы изучить их роль в разборке саркомеров.

Чтобы определить, может ли форсированная экспрессия конститутивно активной мембранно-ассоциированной формы Add1 вызывать разборку саркомера in vivo, мы создали индуцибельную линию трансгенных (TG) мышей pTRE-T445E / T480E, в которой фосфоизоформа аддуцин избирательно экспрессируется в кардиомиоцитах только после скрещивания с мышью αMHC-tTA и отмены доксициклина (Tet-off) (рис.3E). Трансгенные животные не показали значительных изменений в размере сердца или HW / BW на P28 (рис. 3E). Подобно вышеупомянутой одиночной трансгенной линии Add1 i2, мы обнаружили, что кардиомиоциты, положительные по фосфоаддуцину, имели неоднородный паттерн экспрессии, и мы наблюдали снижение экспрессии от P14 до P28 (фиг. 3F, вверху). Дальнейшее изучение саркомерного паттерна в фосфо-мимических положительных кардиомиоцитах показало цитоплазматическую экспрессию аддуцина с разборкой саркомера на P14, которая не сохранялась до кардиомиоцитов P28, которые показали нормальные саркомерные структуры (рис.3F внизу). Оценка разборки подтвердила, что, хотя кардиомиоциты были разобраны на P14, они имели нормальную морфологию на P28 (рис. 3G), что напоминает паттерн, который мы отметили ранее с Add1i2 TG (рис. 2F). Это указывает на то, что избыточная экспрессия Add1 i2 или фосфомиметика Add1 i1 помогает расширить окно разборки саркомера, но не поддерживает этот паттерн до взрослого возраста. Хотя мы обнаружили сигналы ph4 в сердцах на P14, существенной разницы по сравнению с контролем нет (рис.S3A). Размер кардиомиоцитов также не отличается на P14 (рис. S3B).

Для стабилизации белка требуется сопутствующая экспрессия α- и γ-аддуцинов

Предыдущие отчеты в основном были сосредоточены на α-аддуцине, в первую очередь потому, что он считается ограничивающим фактором в образовании гетеродимера с γ- или β-аддуцином или даже с α-аддуцином. гомодимер сам с собой 43 . Это предположение подтверждается элегантными исследованиями на моделях Add1 KO, которые предположили, что делеция α-аддуцина приводит к значительному снижению экспрессии γ-аддуцина.Однако в наших исследованиях невозможность разобрать саркомер в обоих одиночных Add1 TG после P14 поднимает важный вопрос: нужен ли γ-аддуцин для функции α-аддуцина in vivo? В наших исследованиях профиль эндогенной экспрессии аддуцинов показал, что экспрессия γ-аддуцина становится незначительной на P14 (рис. 1E). Это может указывать на то, что одиночные линии TG Add1 теряют способность разбирать саркомеры за пределами P14 вторично по отношению к возрастной потере Add3. Чтобы оценить стабильность Add1 по отношению к Add3, мы провели трансфекцию in vitro с помощью Add1 var.1 и вар. 2 при наличии или отсутствии Add3. Чтобы избежать перекрестной реакции антител к аддуцину между α-аддуцином и γ-аддуцином, мы трансфицировали клетки вариантами Add1 с тремя тандемными тегами FLAG на N-конце и / или плазмидами Add3 с тремя тандемными тегами TY1 на N-конце. Через 24 часа после трансфекции клетки обрабатывали 80 мкМ циклогексимидом (CHX) для ингибирования трансляции белка. Мы собирали клетки в нескольких точках времени после обработки и исследовали уровни белка с помощью WB. Интересно, что мы обнаружили, что как α-аддуцин i1, так и i2 стали нестабильными после обработки CHX в отсутствие γ-аддуцина.Однако в присутствии γ-аддуцина стабильность изоформ α-аддуцина 1 и 2 значительно повышалась. (Рис. 4A). Этот результат указывает на то, что неспособность отдельных трансгенных линий вызывать выраженную разборку за пределами P14 может быть связана с отсутствием эндогенного γ-аддуцина в более поздние моменты времени.

Рисунок 4. Совместная экспрессия изоформы 2 Add1 вместе с Add3 повышает стабильность аддуцина.

A. Клетки HEK293T подвергали трансфекции варианта 1 (p-3xFlag-Add1i1) и варианта 2 Add1 (p-3xFlag-Add1i2) в присутствии или в отсутствие Add3 (p-3xTy1-Add3).Через 24 часа после трансфекции клетки обрабатывали 80 мкМ циклогексимидом (CHX) для ингибирования трансляции белка. Клетки собирали через 0, 24 и 48 часов после обработки. (Слева) WB для отображения уровня белка. (Справа) Измерение относительного уровня белка ADD1i1 или Add1i2 (рассчитанного как FLAG по сравнению с GAPDH) в отсутствие или в присутствии ADD3. Данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием одностороннего теста t . Б. Схематическая диаграмма, показывающая конструкции для создания двойных трансгенных Add1 i2 и Add3. Обе экспрессионные конструкции управлялись промотором α-MHC. C. Результаты QPCR показывают уровень мРНК Add1i2 у двухмесячных двойных трансгенных животных с низкой экспрессией. D. (слева) H&E окрашивание контрольных и кардиоспецифичных двойных трансгенных клеток Add1 i2 / Add3 с низкой экспрессией. Образцы взяты из двухмесячных мышей. Масштабная линейка = 1 мм. (Справа) Соотношение массы сердца к массе тела у WT и двойных трансгенных животных с низкой экспрессией. E. Эхокардиография (слева) и количественная оценка систолической функции левого желудочка по фракции выброса (справа) у двухмесячных двойных трансгенных ADD1 i2 / ADD3 (низкая экспрессия). n = 3 для каждой группы. F. Продольные виды, демонстрирующие структуру саркомеров у двухмесячного дикого животного и двойного трансгенного аддуцина (низкая экспрессия). Изображения с большим увеличением области в рамке на изображении с низким увеличением показаны справа. Пунктирными линиями обозначена граница, на которой экспрессируется аддуцин. На вставке показаны саркомеры в частично разобранном виде (неорганизованные, но не отсутствующие саркомеры).Соответствующая экспрессия аддуцина указана стрелками. Масштабная линейка = 10 мкм. G. QPCR показывает уровень мРНК Add1i2 у двухмесячных двойных трансгенных животных с высокой экспрессией. H. (слева) H&E окрашивание контрольных и кардиоспецифичных двойных трансгенных клеток Add1 i2 / Add3 с низкой экспрессией. Образцы взяты из двухмесячных мышей. Масштабная линейка = 1 мм. (Справа) Соотношение массы сердца к массе тела у WT и двойных трансгенных животных с высокой экспрессией. I. Эхокардиография (слева) и количественная оценка систолической функции левого желудочка по фракции выброса (справа) у двойных трансгенных ADD1 i2 / ADD3 в возрасте 1 месяца (высокая экспрессия).(n = 3 для каждой группы). J. (вверху) Репрезентативные изображения, демонстрирующие паттерн саркомера у двойных трансгенных ADD1 i2 / ADD3 возрастом 1 месяц (высокая экспрессия). (Внизу) Увеличенные изображения Вставки из панелей сверху. K. (Слева) Двойной трансгенный ADD1 i2 / ADD3 с высокой экспрессией имеет свидетельства фрагментации кардиомиоцитов. (Справа) Большое увеличение области слева. Стрелки указывают на фрагменты саркомера, в которых совместно локализованы ADD1 и TNNT2. Масштабная линейка = 10 мкм. Масштабная линейка = 10 мкм.Данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двустороннего теста t .

Чтобы проверить эту гипотезу, мы создали линию кардиоспецифичных двойных трансгенных (dTG) мышей, коэкспрессирующих ген Add1 варианта 2 и ген Add3. Эта линия была получена путем инъекции двух независимых кассет экспрессии вместе (фиг. 4B). Из 35 учредителей 11 были положительными dTG. Иммуноокрашивание с помощью Add1 и Add3 подтвердило, что как α-, так и γ-аддуцин экспрессируются и совместно локализуются в кардиомиоцитах (рис.S4A). Основываясь на результатах qPCR уровней экспрессии Add1 i2, мы разделили линии на две группы в зависимости от уровня экспрессии (рис. 4C). Здесь важно отметить, что уровни эндогенной экспрессии Add1i2 на исходном уровне не обнаруживаются после P14, поэтому трансгенные линии показывают высокий уровень относительной экспрессии мРНК в сравнении.

Сначала мы исследовали линии с более низким уровнем экспрессии (dTG-L). Мы обнаружили, что морфология сердца и HW / BW в возрасте 2 месяцев были аналогичны WT (рис.4D — репрезентативная нижняя линия выражения). Однако систолическая функция ЛЖ у мышей dTG-L была немного ниже, чем у WT (рис. 4E). Интересно, что мы обнаружили, что саркомерные структуры демонстрировали частичную разборку кардиомиоцитов, если аддуцин был сверхэкспрессирован (Рис. 4F). Эта морфология выглядела как дезорганизованные саркомеры без четких полос (рис. 4F). Однако мы не наблюдали классической схемы разборки саркомера с зазором саркомера. Затем мы исследовали фенотип группы с высокой экспрессией аддуцина (dTG-H).Уровень мРНК группы с высокой экспрессией dTG-H был примерно в 1,6 раза выше, чем в группе с низкой экспрессией (фиг. 4G-репрезентативная линия с более высокой экспрессией). Срезы сердца с dTG-H в возрасте двух месяцев показали расширение желудочков (рис. 4H, слева) и увеличенное соотношение HW / BW (рис. 4H, справа). Эхокардиография показала заметно сниженную систолическую функцию ЛЖ с фракцией выброса левого желудочка (ФВЛЖ) 56% (рис. 4I). Мы наблюдали некоторую частичную разборку с фокальной локализацией TNNT2 на вставленном диске (рис.4J), хотя некоторые миоциты не демонстрировали значительной дезорганизации саркомеров (нижний ряд рис. 4J). Мы также наблюдали разрушение и фрагментацию кардиомиоцитов, что свидетельствует об увеличении гибели клеток (рис. 4K). что было дополнительно подтверждено тестом TdT-опосредованного мечения ник-концов dUTP (TUNEL) (рис. S4B). Затем мы оценили размер кардиомиоцитов с помощью окрашивания WGA и обнаружили, что dTG-H имеет значительно высокий процент малых кардиомиоцитов, более низкий процент кардиомиоцитов среднего размера и аналогичный процент крупных кардиомиоцитов (рис.S4C). Эти результаты показывают, что сопутствующая экспрессия Add3 и Add1 стабилизирует аддуциновый комплекс и что как dTG-L, так и dTG-H демонстрируют частичную разборку саркомера, при этом dTG-H демонстрирует доказательства широко распространенной гибели кардиомиоцитов и подавления функции ЛЖ.

Создание двойной трансгенной мыши с фосфо-аддуцином Add1 / Add3 Модель

Как отмечалось ранее, фосфо-одиночный TG T445E / T480E демонстрирует разборку саркомера в сердце новорожденного, но не в сердце взрослого человека (рис. 3G), вероятно, из-за отсутствия Выражение Add3 во взрослом сердце.Учитывая улучшенную разборку кардиомиоцитов новорожденных с форсированной экспрессией фосфо-T445E / T480E, мы интегрировали дизайн фосфомиметического трансгенного с Add1i2 / Add3 dTG для создания нового кардиоспецифичного двойного трансгена, который коэкспрессирует фосфомиметик Add1 i2 T445E / T480E и WT Add3 (p-dTG) (рис. 5A вверху). Окрашивание H&E сердец этих мышей продемонстрировало, что взрослые сердца p-dTG больше, чем WT (фиг. 5A внизу), что было подтверждено измерением HW / BW (фиг. 5B). ФВЛЖ была умеренно снижена у двухмесячных мышей, хотя существенно не изменилась у более молодых мышей (рис.5С). Изучение уровня мРНК аддуцина с помощью кПЦР подтвердило повышенный уровень экспрессии pAdd1i2 по сравнению с данными WT (фиг. 5D). Иммуноокрашивание Add1 и Add3 подтвердило, что как α-, так и γ-аддуцин экспрессируются и совместно локализуются в цитоплазме кардиомиоцитов (рис. S5A). Затем мы исследовали саркомерную структуру путем окрашивания тропонином на P7, P14, P21 и через 2 месяца. Результаты демонстрируют, что кардиомиоциты p-dTG демонстрируют разобранные саркомеры, которые были очевидны во все моменты времени (рис. 5E I, ii, iii и iv), хотя разборка кажется более выраженной на ранних стадиях новорожденности.Фактически, большинство взрослых кардиомиоцитов демонстрировали частичную разборку, которая, по-видимому, была локализована в зоне, окружающей ядра и на периферии кардиомиоцитов, с полным очищением саркомеров в этих зонах. Исследование митотических маркеров кардиомиоцитов этих сердец показало увеличение количества кардиомиоцитов, положительных по киназе ph4 и aurora B, как на P21, так и через 2 месяца (рис. S5B и C), без изменения размера клеток (рис. S5D) или нуклеации (рис. . S5E).

Рисунок 5. Фосфомимический двойной трансгенный продукт способствует разборке саркомера.

A. (вверху) Схематическая диаграмма конструкций для создания двойных трансгенных фосфомиметиков Add1 i2 и Add3. Замена Glu на T445 и T480 имитирует фосфорилированную форму Add1 i2. Обе экспрессионные конструкции управлялись промотором α-MHC. (Внизу) H&E окрашивание контрольных и кардиоспецифичных двойных трансгенных фосфо-Add1 i2 / Add3. Образцы взяты из двухмесячных мышей. Масштабная линейка = 1 мм. B. Отношение массы сердца к массе тела у WT и фосфо-двойных трансгенных животных на Р21 день и 2 месяца.(n = 3 для P21 и n = 5 в течение 2 месяцев). C. Эхокардиография (слева) и количественная оценка систолической функции левого желудочка по фракции выброса (справа) у P21 и двухмесячных двойных трансгенных ADD1 i2 / ADD3 (низкая экспрессия). (n = 3 для P21 и n = 5 в течение 2 месяцев). D. QPCR уровня мРНК Add1i2 у двухмесячных фосфо-двойных трансгенных клеток. E. Саркомерный образец двойных фосфо-трансгенных трансгенных клеток в точках P7 (i), P14 (ii), P21 (iii) и в возрасте 2 месяцев (iv). Изображения с большим увеличением области в рамке показаны справа от уменьшенного изображения.Пунктирные линии обводят границу, где аддуцин экспрессируется вне саркомеров. Стрелки относятся к регионам с высоким уровнем экспрессии аддуцина. Обратите внимание на очистку саркомеров, в которых экспрессируется аддуцин. Масштабная линейка = 10 мкм. F. Крупномасштабный скрининговый анализ киназ выявил 7 кандидатов, которые потенциально фосфорилируют сайты T445 (слева) и T480 (справа). Скорректированные значения активности киназы (исходное значение минус образец пептидного фона, в имп / мин) с образцом пептида при одной концентрации в анализах пептидкиназы 245 Ser / Thr.Синий: киназа с образцом пептида; желтый: активность киназы без образца пептида. G. Анализ совпадения серин / треониновых киназ для проверки 3 киназ, NEK1, DCAM1 и IRAK4, выбранных из начального скринингового анализа киназ. Каждую киназу тестировали при трех концентрациях в трех повторностях. Эти результаты предполагают, что все киназы NEK1, DCAMKL2, IRAK4 демонстрируют зависящую от концентрации способность фосфорилировать образец пептида «T445» и «T480». H. Подтверждение паттерна эндогенной экспрессии IRAK4 (слева) и NEK1 (справа) в регенерирующем сердце новорожденных.Положительные сигналы обозначены стрелкой. I. (вверху) Схема кассет экспрессии IRAK4 в конструкциях AAV6. Сверхэкспрессия IRAK4 (зеленый) в NRVM вызывает разборку саркомера (окрашенного α-актинином, красный цвет) (i) и аддуцина pT445 (окрашенного pT445, красный цвет), перемещаемого из ядра в цитоплазму (ii). Стрелки указывают на то, что аддуцин экспрессируется в ядрах IRAK4-отрицательных клеток. Масштабная линейка = 10 мкм. J. (вверху слева) Схема кассет экспрессии IRAK4 в конструкциях AAV9. (Вверху справа) Схематическое изображение экспериментальной конструкции.(Внизу) AAV9-IRAK4-GFP вводили детенышам CD1 на P1, а сердца собирали на P15 для разделения и окрашивания. Сверхэкспрессия IRAK4 вызвала сильную разборку саркомеров (i) в кардиомиоцитах по сравнению с контролем из однопометников (ii).

Идентификация киназ, которые опосредуют фосфорилирование аддуцина в кардиомиоцитах

Учитывая критическую роль, которую фосфорилирование T445 / T480 играет в разборке саркомера, мы попытались определить механизм этого события фосфорилирования. Чтобы идентифицировать киназы, которые опосредуют фосфорилирование ассоциированных с мембраной сайтов T445 и T480, мы выполнили анализ киназного скрининга 245 киназ на фосфо-сайты T445 и T480.Первоначальный скрининг выявил семь потенциальных киназ с относительно высокими значениями активности по сравнению с фоном для фосфо-сайта T450 (таблица S1, фиг. 5F слева). Пептид T480 показал значительный ответ только на киназу VRK1 (рис. 5F справа). Затем мы выполнили вторичный скрининг для основных совпадений, описанных выше, с использованием анализа зависимости реакции от дозы HitConfirmation ™. Эти исследования подтвердили активность только трех киназ, а именно киназы 1, связанной с NIMA (NEK1), киназы 4, связанной с рецептором интерлейкина 1 (IRAK4), а также даблкортин-подобной и CAM-киназы 2 (DCAMKL2), которые проявляют зависимое от концентрации фосфорилирование T445. фосфозит (рис.5G). Эти киназы также показали увеличение доза-ответ на T480, хотя это оказалось менее заметным, чем у пептида T445. Эндогенное окрашивание кандидатов в киназы на сердце P4 подтвердило, что как IRAK4, так и NEK1 продемонстрировали четкую совместную локализацию с разобранными саркомерами (фиг. 5H).

Чтобы определить роль IRAK4 в индукции разборки саркомеров, мы создали конструкции IRAK4-AAV6 для сверхэкспрессии IRAK4 в кардиомиоцитах новорожденных in vitro. Интересно, что сверхэкспрессия IRAK4 привела к разборке саркомера (рис.5I, верхняя панель), что было связано с экспрессией фосфорилированного аддуцина pT445 в цитоплазме IRAK4-положительных клеток (нижняя панель). В IRAK4 отрицательных клетках аддуцин экспрессировался только в ядре (рис. 5I, нижняя панель со стрелками). Сверхэкспрессия NEK1 в NRVM не оказывала какого-либо явного влияния на саркомеры или фосфорилирование аддуцина (данные не показаны).

Для оценки структурных изменений саркомера при сверхэкспрессии IRAK4 in vivo, мы создали вирус AAV9-IRAK4.Мы вводили этот вирус в сердца новорожденных мышей в точке P1 и собирали сердца в точке P15, момент времени, значительно превышающий выход из клеточного цикла кардиомиоцитов новорожденных. Иммуноокрашивание срезов сердца продемонстрировало, что клетки со сверхэкспрессией IRAK4 демонстрировали заметную разборку саркомеров (фиг. 5J). Эти результаты показывают, что IRAK4 фосфорилирует аддуцин in vitro и in vivo и вызывает разборку саркомера. В совокупности наши результаты идентифицируют гетеродимер аддуцина в качестве важного регулятора разборки саркомера кардиомиоцитов во время митоза кардиомиоцитов

Идентификация партнеров по связыванию комплекса аддуцина в регенеративных и нерегенеративных точках времени

Наши результаты показывают, что фосфорилированный гетеродимер аддуцина опосредует разборку кардиомиоцитов. .Однако, учитывая, что аддуцины ранее не исследовались на сократительных клетках, партнеры связывания аддуцина в кардиомиоцитах неизвестны. Чтобы идентифицировать белки, которые взаимодействуют с аддуцином в кардиомиоцитах, мы выполнили MS-анализ экстрактов сердечных белков P1 и P7 с использованием антитела ADD1 в качестве приманки (стратегия, аналогичная фигуре 1A, но с использованием антитела ADD1 вместо антитела Tnnt2). Мы обнаружили, что многочисленные мишени, которые были идентифицированы при начальном анализе Tnnt2 с понижением, также были обнаружены с помощью α-аддуцина (рис.6A), предполагая, что α-аддуцин связывается с саркомерными белками в раннем постнатальном сердце.

Рисунок 6. Анализ Co-IP / MS с очищенным комплексом аддуцина.

A. В таблице перечислены выбранные белки, ассоциированные с ADD1, идентифицированные с помощью Co-IP / MS. * PSM: соответствие пептидного спектра. Количество спектров, присвоенных пептидам, которые способствовали заключению о белке. ** MIC Sin: нормализованная статистика спектрального индекса для белка для конкретной группы. Рассчитывается по интенсивности ионов фрагментов в каждом спектре, относящемся к конкретному белку.*** Соотношение: количественное соотношение белка между группами, полученное на основе значения MIC Sin. Масштабная линейка = 10 мкм. Б . Схема процесса очистки коротких и длинных комплексов аддуцинов. C. На схематическом чертеже показана блок-схема Co-IP / MS путем раскрытия очищенного комплекса аддуцина D. Гистограмма для канонических путей, обогащенных каждым образцом. Ось X показывает преобразованное скорректированное значение p (процедура Бенджамини-Хохберга) перекрытия между белками образца и путями.FDR означает частоту ложного обнаружения. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двустороннего теста t . E. Сетевой график белков цитоскелета из анализа методом pull down взаимодействует с adducin_long или adducin_short в разные моменты времени (P1 и P21). Различная цветовая маркировка, выделяющая общие и уникальные белки среди групп образцов. Красный цвет представляет четыре группы образцов в выпадающем анализе. Желтым цветом обозначены белки, общие для всех групп.Зеленый цвет обозначает белки, общие только для двух или трех групп. Синий представляет белки, уникальные для каждой группы. F. Анализ близости лигирования (PLA) для изучения прямого взаимодействия между аддуцином (pT445) и саркомерными белками (α-актинин 2) в ткани сердца P4. Красные точки (стрелки) — это флуоресцентные сигналы, указывающие на тесное взаимодействие между двумя антигенами. Образцы включают взаимодействие между α-актинином и тропонином T (в качестве положительного контроля) или фосфо-аддуцином (pT445) и α-актинином. Масштабная линейка = 10 мкм. G. Иммуно-ЭМ изображение, показывающее субклеточное расположение фосфо-аддуцина в кардиомиоцитах с разобранными саркомерами в сердцах новорожденных после инфаркта миокарда на 3-й день после операции. Два красных прямоугольника на левом изображении увеличены справа. (i) аддуцин локализован на z-дисках. (ii) фосфо-аддуцин в значительной степени локализован на z-дисках, связанных с плазматической мембраной в кардиомиоцитах с разобранными саркомерами. Красные стрелки указывают местонахождение аддуцина.

Поскольку аддуцин действует как дуплекс (α / y в кардиомиоцитах), использование антитела ADD1 в качестве приманки может не повторить его характер связывания.Кроме того, хотя вышеупомянутое исследование на основе антител может работать в сердце новорожденного, отсутствие значимой экспрессии аддуцина в сердце взрослого человека не позволяет провести это исследование у взрослых. Чтобы лучше понять, почему даже в dTG-сердцах разборка сердец, по-видимому, более выражена у новорожденных по сравнению со взрослыми кардиомиоцитами, мы провели исследование с использованием очищенного комплекса α / γ-аддуцина в качестве приманки с экстрактами сердца P1 или P21. Мы клонировали оба гена Add1 и Add3 в плазмиду pETDuet, которая совместно экспрессирует две ORF вместе и естественным образом образует дуплекс в клетках.6xHis-метку клонировали на N-конце Add1 для облегчения очистки и анализа с пониженным содержанием. Чтобы определить, действительно ли длинная (ADD1i1 / ADD3) и короткая (ADD1 i2 / ADD3) формы аддуцина по-разному связывают саркомерные белки во время регенеративного окна по сравнению с более поздними временными точками, мы создали две плазмиды для ко-экспрессии ADD1i1 / ADD3 (длинная форма) или ADD1i2 / ADD3 (краткая форма) соответственно. Очищенные белки инкубировали с лизатами сердца в течение ночи, затем связывали с гранулами Ni-NTA, чтобы аддуцин и связанные белки прикреплялись к смоле.Мы также включили отрицательный контроль, в котором лизаты сердца были смешаны с гранулами Ni-NTA. Фиг. 6B и представляют собой схемы очистки белка и Co-IP с использованием очищенного белкового комплекса в качестве приманки. Затем образцы и соответствующие им контроли анализировали масс-спектрометрией в форме log2 (образец / контроль) для расчета кратного изменения. Изменения складок более 1,5 учитывались для дальнейшего анализа пути изобретательности. Фиг.6D представляет собой гистограмму статистически значимых канонических путей, обогащенных образцом.Интересно, что единственный путь с усиленной регуляцией на P1 по сравнению с P21 — это сигнальный путь актинового цитоскелета (два других пути, связанных с митохондриями, были подавлены на P1 по сравнению с P21). Мы также создали сетевой график, чтобы показать, как белки сигнального пути цитоскелета взаимодействуют с длинными или короткими аддуцинами в разные постнатальные моменты времени (P1 и P21) (рис. 6E). Мы также обнаружили, что как длинная, так и короткая формы аддуцина связывают исключительно специфические саркомерные белки в сердце P1, но не в P21.В частности, мы обнаружили, что комплекс аддуцина связывает сердечный актинин (ACTN2) только в сердце P1, но не в сердце P21. Оглядываясь назад, возможно, это не должно было вызывать удивления, учитывая, что актинины являются каркасными белками, которые принадлежат к суперсемейству спектринов 44 , а спектрин является известным партнером по связыванию аддуцинов в неконтрактильных клетках. В кардиомиоцитах альфа-актинин локализован на Z-дисках, где он важен для регуляции саркомерной организации актина и сборки саркомера.Следовательно, потенциальное взаимодействие между аддуцином и альфа-актинином может быть механизмом разборки саркомера во время митоза кардиомиоцитов. Чтобы оценить взаимодействие между аддуцином и α-актинином2, мы провели анализ лигирования методом близости (PLA) (Duolink®, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) (рис. 6F) с использованием антитела против фосфо T445 в сердце новорожденного. В качестве положительного контроля мы использовали связывание TNNT2 с α-актинином 2 в анализе PLA. Или результаты показывают, что аддуцин pT445 больше ассоциируется с ACTN2 in vivo в сердце новорожденного.Кроме того, мы использовали электронную микроскопию Immunogold (Immuno-EM) для определения субклеточной локализации аддуцина pT445 в неонатальных кардиомиоцитах с разобранными саркомерами, что продемонстрировало, что аддуцин локализован на z-дисках саркомеров (где также находится альфа-актинин). локализованный) (рис. 6 Ги). Аддуцин pT445 также, по-видимому, связан с разобранными саркомерами в клеточной коре в ассоциации с плазматической мембраной (рис. 6Gii).

Обсуждение

В последние годы многочисленные исследования выявили механизмы регуляции клеточного цикла кардиомиоцитов.Эти механизмы включают различные пути, включая прямые регуляторы клеточного цикла, факторы транскрипции, микро-РНК, Lnc-РНК, а также немиоцитарные факторы, включая, среди прочего, внеклеточные матричные, иммунологические факторы и факторы окружающей среды. Однако специфические для поперечно-полосатых мышц механизмы, которые регулируют организацию саркомеров во время митоза кардиомиоцитов, остаются плохо изученными. В текущем отчете мы демонстрируем, что белок цитоскелета аддуцин регулирует разборку саркомеров во время митоза кардиомиоцитов.В неконтрактильных клетках предыдущие исследования идентифицировали механизмы, которые регулируют сборку цитоскелета и димеризацию актиновых листов. Напр., Цитоскелетный регуляторный белок аддуцин является основным регулятором связывания актина и взаимодействия актин-спектрин 29,30 . Семейство аддуцинов состоит из 3 членов, а именно α-, β- или γ-аддуцинов. Полностью собранный аддуцин состоит из гетеродимеров гомологичных альфа- и бета- или гамма-субъединиц. Несмотря на известную роль аддуцина в сборке актина в неконтрактильных клетках, его роль в сократительных клетках полностью неизвестна.

Наши результаты основаны на протеомном скрининге белков, которые дифференциально связываются с TNNT2 в момент ранней регенерации сердца новорожденной мыши. Хотя некоторые белки цитоскелета, по-видимому, по-разному связаны с TNNT2 в этот ранний момент времени, мы сосредоточились на аддуцине, учитывая его известную регулирующую роль цитоскелета в неконтрактильных клетках. Мы приводим несколько линий доказательств, подтверждающих связь аддуцина с саркомерными белками; Во-первых, иммуноокрашивание демонстрирует, что α-аддуцин локализован в цитоплазме и мембране только в кардиомиоцитах с разобранными саркомерами.Во-вторых, CoIP с использованием антитела ADD1 или очищенного комплекса α / γ-аддуцина предполагает возможную ассоциацию аддуцина с саркомерными белками, в частности α-актинином. В-третьих, мы идентифицировали ассоциированную с мембраной фосфо-изоформу Add1, которая связывает α-актинин с помощью пробы лигирования близости и колокализуется с ассоциированными с мембраной саркомерами с помощью иммуно-электронной микроскопии, меченных частицами нанозолота. Эти результаты показывают, что Add1 является цитоскелетным белком, связанным с саркомером, в кардиомиоцитах.

Важно отметить увеличение функциональных исследований in vitro и in vivo, чтобы продемонстрировать, что форсированная экспрессия аддуцина вызывает разборку саркомера.Мы показали, что экспрессия нескольких изоформ аддуцина вызывает разборку саркомеров в первичных неонатальных кардиомиоцитах в культуре. Кроме того, как одиночный фосфомиметик TG Add1 i2, так и Add1 i1 обнаруживают негомогенный паттерн экспрессии, который приводит к расширению окна разборки саркомера до P14, но не до зрелого возраста. Анализы стабильности белков продемонстрировали, что совместная экспрессия Add1 или Add3 необходима для стабильности обоих белков, и это было подтверждено in vivo на линиях dTG, которые демонстрировали стабильную экспрессию в зрелом возрасте.Мы также демонстрируем, что, хотя нефосфомимические линии dTG демонстрируют стойкую экспрессию аддуцина, это не привело к выраженной разборке саркомера, в то время как та же самая конструкция dTG с конститутивно активным фосфомимиком T445 / T480 привела к разборке саркомера, которая сохранялась до взрослой жизни.

Одним из важных ограничений текущих результатов является неполная разборка, которую мы наблюдали во взрослых кардиомиоцитах даже в фосфо-мимических dTG. Хотя мы отметили полную разборку в раннем постнатальном периоде, большинство взрослых кардиомиоцитов демонстрировали частичную разборку, которая, по-видимому, локализовалась в зоне, окружающей ядра, и на периферии кардиомиоцитов с полным очищением саркомеров в этих зонах.Эта частичная разборка, вероятно, объясняет отсутствие заметного снижения систолической функции ЛЖ в этой линии ТГ. Механизм этого дифференциального эффекта аддуцина на раннем постнатальном периоде по сравнению со взрослыми саркомерами неясен, но может быть связан с изменениями фенотипа саркомеров с возрастом. Чтобы ответить на этот вопрос, мы использовали очищенный белковый комплекс альфа (короткая или длинная изоформа) -гамма-аддуцин для выявления партнеров по связыванию в сердце ранних новорожденных и подростков. Результаты демонстрируют, что комплекс аддуцина по-разному связывается с белками цитоскелета в зависимости от постнатального возраста.В частности, как короткие, так и длинные формы аддуцинового комплекса, по-видимому, избирательно связываются со специфическим для сердца α-актинином (ACTN2) в сердцах P1, но не P21. PLA и иммуноголд-EM подтверждают мнение, что аддуцин ассоциируется с α-актинином в z-дисках. Хотя ранее не было показано, что аддуцин связывает α-актинин, α-актинин принадлежит к суперсемейству спектринов, и спектрин является известным партнером по связыванию аддуцина в неконтрактильных клетках. Учитывая известную роль α-актинина в прикреплении актина к z-дискам кардиомиоцитов, будущие исследования должны изучить потенциальную роль α-актинина в регуляции разборки саркомеров ниже аддуцина.В совокупности эти результаты идентифицируют важный регуляторный механизм разборки саркомеров, который связывает организацию цитоскелета с регуляцией клеточного цикла в кардиомиоцитах млекопитающих и дает представление о проблемах митоза в активно сократительных клетках.

МЕТОДЫ

Экспериментальные животные

Все протоколы были одобрены Комитетом по уходу и использованию институциональных животных Юго-западного медицинского центра Техасского университета. Во всех экспериментах использовались как самцы, так и самки мышей, чтобы гарантировать соответствие возраста и пола.Здоровых мышей выбирали случайным образом из колонии для всех экспериментов. Мышей CD1 использовали для гистологических исследований дикого типа с окрашиванием и инъекциями AAV9. Количество животных, используемых для каждого эксперимента, составляло от 3 до 5.

Коиммунопреципитация (Co-IP) и масс-спектроскопия (MS)

Мышиные сердца в двух разных точках времени регенерации (n = 3 для каждой), через 3 дня после Инфаркт миокарда (MI) на P1 (P1MI) и через 3 дня после MI на P7 (P7MI) собирали и лизировали в буфере для лизиса IP: 2.5 мМ Трис, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% NP40, 5% глицерин. Комбинация ингибиторов протеиназы и ингибиторов фосфатазы включалась постоянно. 5 мкг мышиного моноклонального антитела TNNT2 (Thermo Scientific) использовали для связывания с 1 мг переваренных образцов сердца при осторожном покачивании при 4 ° C в течение ночи. К смеси добавляли гранулы агарозы с белком А (Calbiochem) и продолжали инкубацию при осторожном покачивании в течение 3 часов при 4 ° C. После микроцентрифугирования в течение 30 секунд при 4 ° C осадки пять раз промывали 1 мл буфера для лизиса IP.Конечные осадки ресуспендировали в 25 мкл буфера для образцов 2XSDS и наносили на гель SDS-PAGE (4-20%). Когда образцы входили в растворяющийся гель примерно на 5-10 мм, анализ останавливали и гель окрашивали кумасси синим. Окрашенную область разрезали и нарезали кубиками размером 1 мм. Затем образцы подвергали масс-спектрометрическому анализу для идентификации белка. Ко-IP с антителом к ​​аддуцину (H-10, номер по каталогу sc-25731 Santa Cruz) проводили с использованием того же протокола.

Гистология и иммуноокрашивание

Ткани сердца фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA) / PBS в течение ночи при комнатной температуре, а затем обрабатывали либо для парафина, либо для криогенной заливки.Окрашивание H&E проводили в соответствии со стандартными процедурами в центре гистологии ядра UTSW на парафиновых срезах. Для криозакрепления фиксированные ткани инкубировали в 30% сахарозе / PBS при 4 ° C до погружения тканей. Ткани помещали в замораживающую среду, замораживали при -80 ° C и готовили для криосрезов. Иммуноокрашивание проводили согласно предыдущему описанию 45 . Вкратце, после извлечения антигена срезы пермеабилизировали и блокировали 10% сывороткой / 0,3% Triton-X100 / PBS в течение 20 минут при комнатной температуре.Затем образцы инкубировали в течение ночи при 4 ° C с первичными антителами. Разведения первичных антител и вторичных антител (ThermoFisher) при инкубации варьировались в зависимости от экспериментов. После промывки PBS срезы окрашивали DAPI (ThermoFisher D1306) и устанавливали с помощью VECTASHIELD (Vector Laboratories h2700) для визуализации.

Антитела

Первичные антитела: антитела к тропонину Т, сердечная изоформа Ab-1, клон 13-11 (Thermo Scientific MS-295-P1, 1: 100), антисаркомерный α-актинин (Abcam ab68167), анти- фосфогистон h4 Ser10 (Millipore 06-570, 1: 100), антитело против α-аддуцина (1B1, банк гибридных исследований развития, 1:50, для рисунка 1F), антитело против α-спектрина (3A9, гибридома исследований развития Банк, 1:50, для Фигуры 1F), антитело против Филамина 1 (E-3, sc-17749, Санта-Крус, 1: 100, для Фигуры 1F), антитело против α-аддуцина (фосфо T445) (Santa Cruz sc16738 , для WB и окрашивания, 1: 100), N-концевое антитело против α-аддуцина (Abcam ab151474, для Add1i2 WB и TG), антитело против α-аддуцина (Santa Cruz H-100 sc-25731, для WT WB мыши и окрашивание на трансгенном pTRE-Add1 T445 / T480E, 1: 100), антитело против Y-аддуцина (Santa Cruz sc-365177, клон G-2, для WB и окрашивания, 1: 100), анти-α-аддуцин (фосфо S726) антитело (Abcam ab53093, 1: 100.Обратите внимание, что фосфозит S726 у человека расположен на 724 у мыши. Поэтому мы использовали S724, относящийся к этому сайту в статье), антитело против α-аддуцина фосфо S355 (Abmart 20592-1NB-3 / C63-S, 1: 100, для WB и двойных трансгенных), антитело против FLAG (M2 , F3165, Sigma-Aldrich 1: 100). Антитело легкой цепи миозина 2 (ptglab, 10906-1-AP, для окрашивания), антитело против MYH6 (Sigma-Aldrich, HPA001349).

Imaging

Флуоресцентные изображения тканей или клеток были получены с помощью Leica DM2000, микроскопа Nikon Eclipse Ni или конфокального микроскопа Nikon A1R и обработаны с помощью Photoshop CS3 для создания объединенных изображений с разными цветами.Для подсчета размера клеток кардиомиоцитов изображения образцов, окрашенных WGA, анализировали с помощью программного обеспечения Fiji.

Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг выполняли с использованием стандартных протоколов. Антитела, используемые в WB, представляют собой антитело против α-аддуцина (Santa Cruz H-100, sc-25731, 1: 500), антитело против γ-аддуцина (Santa Cruz H-60, sc-25733, 1: 500), -FLAG-антитело (Genescript # A00187, 1: 3000), антитело против Ty1 (Diagenode, # C15200054, 1: 3000) и пероксидаза AffiniPure осла против кроличьего IgG (Jackson ImmunoResearch 711-035-152, 1: 20 000), пероксидаза IgG козы антимыши AffiniPure (Jackson ImmunoResearch 115-035-003, 1: 20 000) были обработаны LI-COR.

Выделение желудочковых миоцитов новорожденных крыс (NRVM) и культивирование клеток

Кардиомиоциты были выделены из левого желудочка 1-2-дневных крыс Sprague-Dawley в соответствии с протоколом из набора для изоляции (Cellutron Life Technologies, cat # nc- 6031). Затем миоциты помещали на покровные стекла, покрытые ламинином (Life tech # 23017-015) при плотности 1250 клеток / мм в среде DMEM: M199 (3: 1), содержащей 10% лошадиной сыворотки, 5% FBS и 1% пенициллина / Стрептомицин. 100 мкмоль / л 5’-бром-2’-дезоксиуридина включен для подавления роста фибробластов.Через 24 часа после прикрепления клеток замените питательную среду.

Выделение кардиомиоцитов

Выделение кардиомиоцитов из сердец взрослых мышей было описано ранее (Mahmoud et al., 2013). Вкратце, взрослые сердца были взяты только что без предсердий. Образцы фиксировали в 4% PFA в течение ночи при 4 ° C. Ножницы разрезают область аорты для лучшего проникновения. После непродолжительной промывки в PBS для удаления PFA сердца инкубировали со свежей коллагеназой D (2,4 мг / мл, Roche) и B (1,8 мг / мл, Roche) с добавлением 1% пенициллина / стрептомицина в течение 12 часов при 37 ° C, используя встряхиватель встряхивающий.Супернатанты собирали и хранили при 4 ° C. После нескольких циклов переваривания до исчезновения видимой ткани супернатанты объединяли и фильтровали через фильтр с нейлоновой сеткой 160 мкм. Конечные клетки собирали центрифугированием при 1000 об / мин в течение 5 минут. Осадки клеток ресуспендировали в свежем PBS с добавлением 1% P / S. Для подсчета нуклеации по крайней мере 300 кардиомиоцитов на образец были определены количественно с помощью конфокальной визуализации z-стека.

Плазмиды и мутагенез

Вариант 1 транскрипта кДНК мыши Add1 был приобретен у Origene (№ по каталогу MR210357).Ген Add1 амплифицировали и субклонировали в pUC19 для точечных мутаций с помощью набора GeneArt Site-Directed Mutagenesis Plus (Life Technologies, номер по каталогу A14604). Вариант 2 Add1 был клонирован из кДНК библиотеки кДНК мыши P1 Mouse Irak4. был куплен у Ориджена (MR207322). Праймеры, используемые для создания сайт-направленного мутагенеза или других клонов, перечислены в приложениях.

Получение и очистка рекомбинантных векторов AAV

Плазмиды pTR-GNP для создания кассеты экспрессии AAV, pDP6rs и pDG9 для упаковки AAV6 и AAV9 соответственно являются подарками от Dr.Роджер Хаджар (Медицинская школа Маунт-Синай, Нью-Йорк). Мы использовали безвирусную систему упаковки AAV на основе двух плазмид для производства вирусов. Вирусы были продуцированы полиэтиленимином (Polysciences, Warrington, PA) -опосредованной трансфекцией клеток HEK293T (эмбриональная почка человека, ATCC, # CRL-11268, Manassas, VA). После трансфекции в течение 72 часов клетки собирали центрифугированием. После трех циклов замораживания и оттаивания лизаты клеток обрабатывали универсальной нуклеазой Pierce для лизиса клеток (Pierce, Waltham, MA).Неочищенные вирусные суспензии подвергали двум циклам центрифугирования в градиенте плотности йодиксанола. Конечные концентрированные вирусы диализовали против PBS и титровали количественной ПЦР в реальном времени.

Культура клеток, трансфекция и обработка циклогексимидом

Клетки HEK293T трансфицировали p-3xFlag-Add1i1 и p-3xFlag-Add1i2 в присутствии или в отсутствие плазмиды p-3xTy1-Add3. Через 24 часа после трансфекции клетки обрабатывали 80 мкМ циклогексимидом. Клетки собирали через 0, 24 и 48 часов после обработки.Белки экстрагировали и измеряли концентрацию. 10 мкг общих белков разделяли с помощью SDS-PAGE и позже переносили на нитроцеллюлозную мембрану для WB. Антитело против FLAG использовали для обнаружения экспрессии α-аддуцина. Антитело против Ty1 использовали для обнаружения экспрессии γ-аддуцина. GAPDH использовался в качестве внутреннего контроля.

Получение трансгенных мышей

ORF конститутивно активной формы Add1i1 (T445 / T480E) субклонировали в вектор ДНК pTRE-Tight для создания плазмиды pTRE-T445 / T480E.pTRE-T445 / T480E линеаризовали с помощью PvuI и микроинъектировали в оплодотворенные ооциты полученным трансгенным мышам с использованием стандартных процедур 17 . Чтобы вызвать сверхэкспрессию Add1 в кардиомиоцитах, мышей pTRE-T445 / T480E скрещивали с мышами αMHC-tTA. Мышей соответствующего возраста αMHC-tTA использовали в качестве контроля. кДНК Add1 i2 синтезировали непосредственно из сердца мыши P1 CD-1. Область ORF была субклонирована в вектор на основе pBluescript, промотор которого был заменен на промотор αMHC для специфической экспрессии в кардиомиоцитах 46 .Плазмиду αMHC-Add1i2 линеаризовали с помощью EcoRV и микроинъектировали в оплодотворенные ооциты созданным трансгенным мышам. Трансгенных мышей скрестили с C57B6N / J. кДНК Add3 была приобретена у Genecript (GenScript Bioteh, NJ). ORF была субклонирована в тот же вектор, что и αMHC-Add1i2. Для создания двойных трансгенных образцов Add1i2 / Add3 линеаризованную ДНК αMHC-Add1i2 и αMHC-Add3 микроинъектировали в оплодотворенные ооциты с использованием стандартных процедур. Для создания двойного трансгенного фосфо-аддуцина мутантный Add1 i2 T445E / T480E субклонировали под промотором αMHC.Линеаризованную ДНК αMHC-Add1i2 T445E / T480E и αMHC-Add3 микроинъектировали в оплодотворенные ооциты. И двойные трансгенные, и фосфо-двойные трансгенные были скрещены с C57B6N / J для стратегии разведения.

Иммуно-электронная микроскопия

Чтобы пометить антитело аддуцина нанозолотыми частицами, мы использовали золотое мечение антитела альфа-аддуцина фосфо-Т445. Процедура маркировки соответствовала протоколу J.R.Thorpe 47 .

Proximity Ligation Assay

Proximity Ligation Assay (Duolink, # DUO92101, Sigma) выполняли в соответствии с инструкциями.Циросрезы, полученные через 3 дня после образцов P1MI, использовали для всех исследований. Этапы извлечения антигена и пермеабилизации были такими же, как и при стандартной процедуре иммуноокрашивания. Первичные антитела TNNT2 и α-актинин использовали в качестве положительного контроля.

TUNEL Assay

Криосрезы окрашивали на тропонин Т, как указано выше в разделе «Гистология и иммуноокрашивание». После инкубации с соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с Alexa Fluor 555 (Invitrogen), окрашивание TUNEL проводили в соответствии с рекомендациями производителя (набор для определения гибели клеток in-situ, Fluorescein, Roche).Все окрашивание проводили на 3 сердцах на группу, по 3 среза на сердце.

Скрининговый анализ серина / треонина

Мы синтезировали два биотинилированных пептида с сайтами фосфорилирования в середине последовательностей. Они предназначены для «T445», KQQREK T RWLHSG и «T480», EDGHR T STSAVP (символы, отмеченные красным, представляют собой сайты фосфорилирования). Скрининговый анализ киназ проводился ProQinase GmbH (Фрайбург, Германия). Первоначальный скрининговый анализ определяли при 1 мкМ в одном экземпляре в радиометрическом анализе ( 33 PanQinase® Activity Assay) на панели 245 Ser / Thr киназ с использованием покрытых стрептавидином планшетов FlashPlate® PLUS (PerkinElmer, Бостон, Массачусетс).Реакционные смеси вносили пипеткой в ​​96-луночные V-образные полипропиленовые микротитровальные планшеты. Каждый аналитический планшет содержит одну лунку, в которой нет фермента и которая используется в качестве фона. Для оценки результатов параллельно определяли фоновый сигнал каждой киназы (без биотинилированного пептида). Для анализа подтверждения совпадения семь киназ, выбранных из первого скринингового анализа, тестировали с образцами пептидов в трех повторностях при трех концентрациях (1, 0,5, 0,25 мкМ).

Экспрессия и очистка белка

Полноразмерная изоформа 1 ADD1 мыши и ADD3 или ADD мыши! Изоформа 2 и ADD3 были субклонированы в первую и вторую открытую рамку считывания (ORF) вектора pETDuet соответственно.mADD1 имеет метку 6xHis на своем N-конце, за которой следует сайт узнавания протеазы TEV, и плазмида была трансформирована в клетки Rosetta (DE3) pLysS (Novagen). Целевой белок экспрессировали в культурах, выращенных в среде с аутоиндукцией при 18 ° C в течение ночи 48 . Культуру собирали и лизировали через French Press в буфере для лизиса (20 мМ Трис (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 0,5 мМ DTT и с добавлением ингибиторов протеаз). Лизат центрифугировали и супернатант наносили на аффинную колонку Ni-NTA (Qiagen).Белки элюировали элюирующим буфером (20 мМ Трис (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 2 мМ DTT и 250 мМ имидазол (pH 8,0)). Элюат дополнительно очищали ионообменной хроматографией (HiTrapSP) с последующей гель-фильтрационной хроматографией (GF_Superose6). Пиковые фракции собирали и концентрировали до 2-3 мг / мл для последующих экспериментов.

Co-IP очищенного аддуцина 1/3

Очищенный дуплекс аддуцина длинной формы ADD1 i1 / ADD3 и короткой формы дуплекса ADD1 i2 / ADD3 использовали в качестве приманки в анализе методом вытягивания вниз.Свежие сердца P1 и P21 лизировали в IP-буфере: 50 мМ Nah3PO4, 150 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, 0,05% Твин 20, pH 8,0. Комбинация ингибиторов протеиназы и ингибиторов фосфатазы включалась всегда. 2 мкг очищенного дуплекса аддуцина (короткого или длинного) использовали для связывания с 800 мкг переваренных образцов сердца при осторожном покачивании при 4 ° C в течение ночи. Гранулы агарозы Ni-NTA промывали 3 раза буфером для лизиса. Затем в смесь добавили шарики. Инкубацию продолжали при осторожном покачивании в течение 1 часа при 4 ° C.После микроцентрифугирования в течение 30 секунд при 4 ° C осадки 5 раз промывали 1 мл IP-буфера для лизиса. Буфер для лизиса IP был дополнен 5 мМ иммидазолом в первые 3 раза; с 20 мМ имидазолом последние 2 раза. Гранулы Ni-NTA, связывающиеся с лизатами сердца P1 или P21 при 4 ° C, 1 час были включены в качестве отрицательного контроля. Конечные осадки ресуспендировали в 25 мкл буфера для образцов 2XSDS и наносили на гель SDS-PAGE (4-20%). Когда образцы входили в растворяющийся гель примерно на 5-10 мм, анализ останавливали и гель окрашивали кумасси синим.

admin

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *