² Медицинский факультет Гарвардской медицинской школы, Бостон, Массачусетс 02115, США

Павел Иванов

^{1 Отделение ревматологии} , Immunology and Allergy, Brigham and Women’s Hospital, Бостон, Массачусетс 02115, США

² Медицинский факультет, Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс 02115, США

³ Гарвардский институт Броуда и М.IT, Cambridge, MA 02142, USA

¹ Отделение ревматологии, иммунологии и аллергии, Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA 02115, USA

² Медицинский факультет Гарвардской медицинской школы, Бостон, MA 02115, USA

³ The Broad Institute of Harvard and MIT, Cambridge, MA 02142, USA

^* Текущий адрес: Minerva Biotechnologies, Waltham, MA 02451, USA.

Поступила в редакцию 3 ноября 2016 г .; Принято 10 января 2017 г.

РЕФЕРАТ

Клетки выработали различные механизмы ответа на стресс, включая образование цитоплазматических очагов, известных как стрессовые гранулы (SG). СГ динамичны и образуются в результате ингибирования трансляции стрессом. Несмотря на огромный интерес к СГ из-за их вклада в патогенез ряда заболеваний человека, многие аспекты образования СГ изучены недостаточно.Обычно считается, что SG, вызванные различными стрессами, однородны, хотя некоторые исследования предполагают, что существуют разные подтипы SG и SG-подобные цитоплазматические фокусы. Здесь мы исследовали молекулярные механизмы сборки SG и охарактеризовали их состав при различных стрессах. Наши данные выявили стресс-специфические различия в составе, сборке и динамике СГ и СГ-подобных цитоплазматических очагов. Используя набор генетически модифицированных гаплоидных клеток человека, мы определили молекулярную схему стресс-специфического ингибирования трансляции перед образованием SG и его связь с выживаемостью клеток.Наконец, наши исследования характеризуют очаги, индуцированные цитоплазматическим стрессом, связанные с каноническими SG, но отличные от них, а также представляют гаплоидные клетки в качестве ценного ресурса для изучения гранул РНК и механизмов контроля трансляции.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Гаплоидная клетка, Контроль трансляции, Реакция на стресс, Гранулы стресса, Инициация трансляции, eIF2α выжить (Ямасаки и Андерсон, 2008).Клетки, подвергающиеся различным стрессам, реагируют немедленным отключением общего синтеза белка, опосредованного ингибированием инициации трансляции через два ключевых регуляторных механизма. Первый механизм включает фосфорилирование α-субъединицы эукариотического фактора инициации 2 (eIF2α, также известного как EIF2S1) одной или несколькими активируемыми стрессом киназами eIF2α (eIF2αKs) (обзор в Holcik and Sonenberg, 2005; Ivanov et al., 2011; Зоненберг и Хиннебуш, 2009). eIF2 является компонентом тройного комплекса, который доставляет инициаторную тРНК к трансляционно-компетентным преинициаторным комплексам, собранным на 5′-концах мРНК (Jackson et al., 2010). Фосфорилирование eIF2α в S51 предотвращает обмен GDP/GTP на eIF2 и, следовательно, не может доставить инициирующую тРНК к рибосомам для распознавания стартового кодона, что в конечном итоге приводит к снижению глобальной инициации трансляции. В клетках млекопитающих известны четыре различных eIF2αK (Donnelly et al., 2013), каждый из которых активируется отдельным набором эндогенных или экзогенных стимулов. Регулируемая гемом киназа фактора инициации 2α (HRI; также известная как eIF2αK1) контролирует синтез глобиновых цепей, чтобы сбалансировать их с доступными уровнями гема во время созревания эритроцитов (McEwen et al., 2005), а также ощущает окислительный стресс. Протеинкиназа, активируемая РНК (PKR; также известная как eIF2αK2), представляет собой двухцепочечный РНК-зависимый eIF2αK, активируемый вирусной инфекцией, тепловым шоком и ультрафиолетовым облучением (Srivastava et al., 1998). PKR-подобная киназа эндоплазматического ретикулума (ER) (PERK; также известная как eIF2αK3) активируется нарушением белкового гомеостаза в просвете ER (Harding et al., 2000a,b). Общий контрольный недерепрессивный 2 (GCN2; также известный как eIF2αK4) отслеживает уровни аминокислот и активируется путем лишения аминокислот (Wek et al., 1995).

Второй стресс-чувствительный механизм инициации трансляции включает сборку комплекса eIF4F (т.е. eIF4E-eIF4G-eIF4A), который распознает структуру кэпа (m ⁷ GTP) на 5′-конце мРНК (Jackson et др., 2010). Формирование этого комплекса находится под строгим контролем фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) млекопитающих, мишени киназного каскада рапамицина (mTOR) (Laplante and Sabatini, 2013). В условиях роста каскад mTOR приводит к фосфорилированию eIF4E-связывающих белков (4E-BP) для поддержания его неактивной фосфорилированной формы (p-4E-BP).Стресс-индуцированная инактивация mTOR приводит к дефосфорилированию p-4E-BP и их превращению в активную форму, которая препятствует сборке eIF4F и ингибирует инициацию трансляции (Jackson et al., 2010). Следует также отметить, что помимо этих двух глобальных механизмов контроля трансляции, специфические РНК-связывающие белки вносят вклад в регуляцию трансляции выбранного подмножества мРНК.

Вследствие индуцированной стрессом остановки трансляции мРНК, высвобождаемые из разобранных полисом, могут активно направляться в дискретные цитоплазматические очаги, известные как стрессовые гранулы (SG) (Kedersha et al., 1999). SG представляют собой микроскопически видимые очаги, состоящие из матричных рибонуклеопротеидов (мРНП), включая мРНК, малые 40S рибосомальные субъединицы, мРНК-ассоциированные комплексы инициации трансляции и РНК-связывающие белки (Anderson and Kedersha, 2006, 2008; Anderson et al., 2015; Kedersha et al. др., 2013). SG представляют собой динамические объекты, находящиеся в равновесии с активно транслируемыми полисомами; таким образом, поступательное управление тесно связано со сборкой и разборкой СГ. Белки SG не только определяют судьбу специфических транскриптов, которые перемещаются внутрь и наружу SGs, но также модулируют различные сигнальные каскады в стрессовых клетках.Нарушение регуляции динамики SG вовлечено в патогенез ряда заболеваний человека, включая рак, воспалительные, нейродегенеративные и нервно-мышечные заболевания (Anderson and Kedersha, 2002, 2009; Anderson et al., 2015; Aulas and Vande Velde, 2015; Buchan, 2014). ; Иванов и Андерсон, 2013; Кедерша и др., 2013; Панас и др., 2016).

Фосфорилированные eIF2α (p-eIF2α)- и mTOR-опосредованные пути играют дополнительные роли «контрольных точек» в общем контроле трансляции, но также обеспечивают специализированный контроль для определенных подмножеств мРНК.Например, фосфорилирование eIF2α селективно усиливает трансляцию некоторых чувствительных к стрессу мРНК, несущих открытые рамки считывания (uORF) перед стартовым кодоном AUG кодирующей ORF (например, ATF4 у млекопитающих или транскриптов GCN4 у дрожжей; Holcik и Sonenberg, 2005; Ямасаки и Андерсон, 2008). Точно так же специфические мРНК, которые несут внутренний сайт посадки рибосомы (IRES) в своей 5′-нетранслируемой области (5′-UTR), избегают ингибирования, опосредованного 4E-BP, поскольку инициация их трансляции не зависит от сборки eIF4F на структурах кэпа мРНК.IRES обычно обнаруживаются в вирусах и используются как средство обеспечения того, чтобы вирусные транскрипты все еще транслировались в периоды времени, когда трансляция хозяина ингибируется (Pestova et al., 2001). IRES-подобные структуры также могут быть обнаружены в человеческих транскриптах, включая транскрипты, которые кодируют белки, связанные с апоптозом и реагирующие на стресс, хотя вопрос о том, являются ли эти структуры подлинными IRES, все еще является предметом споров (Shatsky et al., 2014, 2010). Молекулярные механизмы неканонической трансляции только начинают изучаться.

Для изучения молекулярных механизмов трансляционного контроля во время стресса мы искали клеточную модель, реагирующую на стресс, которую можно надежно использовать для биохимических исследований in vitro , а также генетически поддающуюся различным генетическим (например, с помощью РНКи или CRISPR/Cas9 ) и фармакологические манипуляции. Коммерчески доступные системы трансляции in vitro (IVT) на основе лизата ретикулоцитов кролика (RRL) широко используются для изучения механизмов трансляции у млекопитающих. Хотя эта система надежна и проста в использовании, она искусственная, нечеловеческая и не поддается генетическим манипуляциям.Что еще более важно, он не воспроизводит стимулирующие синергетические эффекты структуры кэпа и поли(А)-хвоста на трансляцию мРНК (Michel et al., 2000). В других системах IVT используются цитоплазматические экстракты эмбриональных фибробластов мыши (MEF) или асцитных клеток мыши Кребса-2. По сравнению с RRL, эти системы точно повторяют некоторые аспекты трансляции мРНК in vivo [например, Синергия 5′-кэпа и 3′-конца поли(А)-хвоста] (Michel et al., 2000). Однако эти системы являются мышиными и происходят из специализированных клеток (таким образом, они не воспроизводят многие аспекты соматических клеток, т.грамм. реакция на стресс) и трудно поддаются генетическим манипуляциям. Наконец, различные линии клеток человека можно использовать для изучения механизмов контроля трансляции при стрессе (Terenin et al., 2013). Эти клетки можно подвергать генетическим манипуляциям и использовать для приготовления трансляционно компетентных клеточных экстрактов. Однако они генетически гетерогенны (например, они часто содержат дополнительные хромосомы или большие участки хромосом), часто не поддаются эффективному подавлению генов (например, первичные клетки) и неудобны для микроскопических исследований [например,грамм. суспензии клеток для обнаружения белков SG с помощью иммуноокрашивания или транскриптов с помощью флуоресценции in situ гибридизации (FISH)] (Kedersha and Anderson, 2007).

Здесь мы используем почти гаплоидную клеточную линию HAP1 человека, полученную из клеток хронического миелогенного лейкоза (Carette et al., 2011), в качестве инструмента для изучения трансляционного контроля и реакции на стресс. Геном этих клеток был полностью секвенирован, поэтому клетки идеально подходят для генетических манипуляций, таких как делеция генов или сайт-специфический мутагенез (Carette et al., 2011), оба из которых легче облегчить отсутствием второго аллеля. Мы описываем свойства полученной из HAP1 системы трансляции мРНК in vitro , характеризуем сублинии, происходящие от HAP1, с генетически удаленными eIF2αKs HRI, PKR, PERK или GCN2, а также клетки с нокаутом HAP1, содержащие мутацию S51A в eIF2α- кодирующий ген (S51A HAP1). Мы определили полезность клеток HAP1 для мониторинга динамики SG в ответ на различные стрессы и выявили ранее недооцененные аспекты сборки SG и ингибирования трансляции.В частности, мы обнаружили, что некоторые стрессы строго зависят от фосфорилирования eIF2α для образования SG, а другие нет. Интересно, что рокагламид A (RocA), агент, который ингибирует трансляцию независимым от eIF2α способом посредством интерференции с РНК-хеликазой eIF4A, индуцирует образование цитоплазматических очагов, которые являются положительными для ядерных маркеров SG, но отрицательными для поли(А) мРНК. Точно так же обработка NaCl также не требует фосфорилирования eIF2α для ингибирования трансляции и индуцирует сборку поли(А)-позитивных цитоплазматических фокусов, которые по составу напоминают канонические SG (Kedersha et al., 2016). Однако очаги, индуцированные NaCl, устойчивы к лекарствам, которые отличают добросовестные SG от других гранул РНК. Из стрессов, зависящих от p-eIF2α, некоторые [например, тепловой шок и ингибитор протеасом MG132 (Mazroui et al., 2007)] активируют более одного eIF2αK, тогда как другие [например, арсенит натрия (SA) или тапсигаргин (Thaps) (Kedersha and Anderson, 2007)] активируют одиночный eIF2αK. УФ-свет запускает фосфорилирование eIF2α, но это не требуется для образования SG, а УФ-излучение лишь частично ингибирует трансляцию.Более того, УФ-индуцированные SG не являются каноническими, так как в них отсутствуют факторы инициации трансляции eIF4G и eIF3, и они лишь слабо рекрутируют поли(А) мРНК [обратите внимание, что такие очаги могут содержать деаденилированную мРНК, как в случае процессинговых телец (PBs)]. Эти данные указывают на то, что клетки млекопитающих собирают различные типы SG и SG-подобных гранул стресс-специфическим образом. Он также предостерегает от объявления стресс-индуцированных очагов SG на основании только одного или двух маркеров SG. Наши данные также показывают, что клетки, полученные из HAP1, и бесклеточные системы являются ценными инструментами для изучения аспектов синтеза белка, стрессовых реакций, связанных с трансляцией, и механизмов сборки гранул РНК.Они представляют собой идеальную систему для генетического и/или химического скрининга для изучения трансляционного контроля.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Мониторинг синтеза белка в клетках HAP1

Клетки HAP1 использовались в генетическом скрининге и исследованиях «потеря функции» для различных целей (Elling and Penninger, 2014). Чтобы определить, можно ли также использовать эти клетки для исследований, связанных с синтезом белка и сборкой гранул РНК, мы сначала изучили эффективность общей трансляции в клетках HAP1 с помощью рибопуромицилирования, анализа, который метит зарождающиеся пептидные цепи на удлиняющихся рибосомах (Panas et al., 2015). Мы сравнили клетки HAP1 с другими клеточными линиями, которые широко используются для изучения трансляции мРНК, и обнаружили, что клетки HAP1 эффективно поддерживают синтез белка de novo с эффективностью, сравнимой с эффективностью, наблюдаемой в клетках HeLa-S, COS7 и U2OS, и превышающей таковую у клеток МЭФ (А).

Клетки HAP1 подходят для анализа клеточной и in vitro трансляции. (A) Клетки HAP1, COS7, MEFs, HeLa-S и U2OS подвергали рибопуромицилированию для сравнения уровней базовой трансляции.Антитело против пуромицина (Puro) использовали для визуализации белков, синтезированных de novo . Актин – это контроль загрузки. Показано репрезентативное изображение ( n =3). (B) Схема репортеров мРНК люциферазы на основе NanoLuc со структурой кэпа (Cap-NanoLuc), поли(А) хвостом (NanoLuc-A50), кэпом и поли(А) (Cap-NanoLuc-A50) или без 5 ‘-кэп или 3′-поли(А) хвост (NanoLuc). (C) Система IVT на основе лизатов HAP1 использовалась для оценки синергии 5′-кэпа или 3’-поли(А) хвоста с использованием транскрибированных in vitro репортеров из B.Относительная эффективность трансляции мРНК NanoLuc установлена ​​как 1, n ≥3. * Р <0,05; ns, незначительно по сравнению с NanoLuc (непарный тест Стьюдента t -test). (D) Схема используемых бицистронных конструкций. Первая ORF, кодирующая люциферазу светлячка, транслируется кэп-зависимым образом, вторая ORF, кодирующая люциферазу NanoLuc, транслируется IRES-зависимым (для полиомиелита, EMCV или HCV IRES) образом. Контрольный репортер (без IRES) не содержит элемента IRES между ORF, кодирующей люциферазы светлячка и NanoLuc.(E) Система IVT на основе лизатов HAP1 использовалась для оценки трансляции in vitro транскрибированных бицистронных репортеров по сравнению с относительной эффективностью трансляции мРНК люциферазы светлячка (черные столбцы) или люциферазы NanoLuc (серый цвет), установленной за 1, соответственно. Показан относительный перевод IRES относительно No IRES. н ≥3; * Р <0,05; непарная Стьюдента т -тест. Количественные результаты представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего.

Бесклеточные системы IVT, использующие клеточные экстракты, обычно используются для анализа механизмов синтеза белка.Были разработаны различные системы, но многие из них не полностью отражают все аспекты трансляционного контроля и регуляции, которые, как известно, существуют. Чтобы определить, можно ли использовать клетки HAP1 для IVT, мы оценили трансляционную компетентность экстрактов HAP1 с использованием различных репортеров. В клетках млекопитающих трансляция мРНК значительно усиливается за счет наличия 5′-кэпа и 3′-поли(А)-хвоста. Мы проверили, проявляют ли эти элементы эти свойства в экстрактах HAP1, используя репортер мРНК, кодирующий люциферазу NanoLuc (NanoLuc) (B).Добавление 5′-кэпа или поли(А)-хвоста к некэпированной мРНК сильно усиливает ее трансляцию (С, сравните NanoLuc-A50 и Cap-NanoLuc с Nano-Luc). Важно отметить, что присутствие как 5′-кэпа, так и поли(А)-хвоста синергетически стимулирует трансляцию (С, сравните Cap-NanoLuc-A50 с NanoLuc-A50 и Cap-NanoLuc), что согласуется с общепринятыми моделями. Также следует отметить, что экстракты HAP1 не требуют предварительной обработки нуклеазами (например, микрококковой нуклеазой), что устраняет эндогенные клеточные транскрипты и приводит к неконкурентной и искусственной системе.

Затем мы спросили, поддерживают ли экстракты HAP1 трансляцию, управляемую различными вирусными IRES (D). Мы использовали бицистронные мРНК-репортеры, в которых первая ORF, кодирующая люциферазу светлячка, управляется кэп-зависимым (каноническим) образом, тогда как вторая ORF, кодирующая люциферазу NanoLuc, управляется IRES. Лизаты HAP1 эффективно транслируют IRES люциферазы, управляемой вирусом гепатита С (HCV), вирусом энцефаломиокардита (EMCV) и полиовирусом (PV), с эффективностью трансляции, сравнимой с таковой у кэпированных и поли(А) мРНК (Е).В совокупности наши данные показывают, что клетки HAP1 и производная от HAP1 система IVT могут быть использованы для изучения многих аспектов регуляции трансляции.

Клетки HAP1 образуют канонические SG в ответ на арсенит натрия

Поскольку ингибирование трансляции связано с образованием SG (Kimball et al., 2003), мы отслеживали динамику SG в клетках HAP1, подвергшихся окислительному стрессу. Клетки обрабатывали SA, наиболее часто используемым агентом для индукции окислительного стресса и сильным агентом, индуцирующим SG, в течение 1  часа, а затем возвращали в обычную среду.Клетки HAP1, обработанные SA, собирают SG, которые разбираются при снятии стресса в соответствии с временным характером SG (рис. S1A). Образование SG коррелирует с ингибированием трансляции, что измеряется рибопуромицилированием и фосфорилированием eIF2α во время лечения СА. Разборка SG параллельна восстановлению синтеза белка и дефосфорилированию eIF2α после снятия стресса (рис. S1B). Как видно из других клеточных линий млекопитающих, клетки HAP1 образуют канонические SA-индуцированные SG, содержащие SG-нуклеирующие белки G3BP1 и Caprin1, факторы инициации трансляции eIF4G и eIF3b, поли(А)-связывающий цитоплазматический белок 1 (PABPC1) и TIA- 1 (рис.С1С). Однако нам не удалось обнаружить TDP-43 (также известный как TARDBP) в индуцированных SA SG (рис. S1C). FISH с использованием зонда oligo(dT) показывает поли(A) мРНК, совместно локализованную с маркерами SG G3BP1 (рис. S1C, левое изображение). В совокупности эти данные указывают на то, что клетки HAP1, обработанные SA, образуют канонические SG, которые совпадают с ингибированием трансляции.

Оценка композиционного разнообразия SG и SG-подобных очагов в ответ на различные стрессовые стимулы

Список стимулирующих SG стимулов и клеточных линий, которые используются для исследований SG, обширен и продолжает расти (Aulas and Vande Velde, 2015) .В большинстве исследований предполагается, что SG одинаковы, несмотря на различия в стрессовых факторах или типах клеток. Однако некоторые данные показывают, что их состав меняется в зависимости от стресса (Kedersha et al., 1999). Эти различия не были систематически оценены в единой системе. Поэтому мы использовали панель клеток HAP1 для исследования специфичного для стресса композиционного разнообразия SG. Окислительный стресс (СА) (Kedersha et al., 1999), тепловой шок (Kedersha et al., 1999), ЭР-стресс (Thaps) (Kimball et al., 2003), ингибирование протеасом (MG132) (Mazroui et al., 2007), гиперосмотический стресс, вызванный NaCl (Kedersha et al., 2016), УФ-облучение (Kwon et al., 2007), ингибирование eIF4A через патеамин A ( PatA) (Dang et al., 2006) и RocA (Kedersha et al., 2016) индуцируют G3BP1-позитивные очаги в клетках HAP1. Частота индукции G3BP1-позитивных очагов варьирует и зависит от стресса: от 20% клеток, обработанных Thaps, MG132 и УФ, до более 90% в случае СА и гиперосмотического стресса (A, B).Поскольку поли(А) мРНК является определяющим компонентом добросовестных SG (Kedersha et al., 1999), мы исследовали различные индуцированные стрессом G3BP1-позитивные очаги, используя FISH для поли(А) мРНК с олиго(dT) зондом. Большинство стрессов способствуют рекрутированию поли(А) мРНК в G3BP1-позитивные очаги (А, В). Однако RocA- и УФ-индуцированные G3BP1-положительные очаги содержат мало полиаденилированной мРНК или вообще не содержат ее (A, B), что позволяет предположить, что эти G3BP1-положительные очаги не являются каноническими SG. Поскольку гистоновые мРНК содержат стволовую петлю вместо поли(А)-хвоста, мы оценили SG для белка, связывающего стволовую петлю (SLBP), белка, который связывается со стволовой петлей гистоновой мРНК (Marzluff et al., 2008). Только MG132, Thaps и осмотический стресс привлекают SLBP к SG (рис. S2), что указывает на присутствие гистоновой РНК в этих очагах. Остается определить, содержат ли очаги RocA и UV другие неполиаденилированные мРНК.

Состав стресс-индуцированных очагов. (A) Клетки HAP1 подвергали воздействию СК (200 мкМ, 1 ч), тепловому шоку (44°C, 1 ч), ингибитору протеасом MG132 (100 мкМ, 1 ч), стрессору эндоплазматического ретикулума Thaps (4 мкМ, 2 ч), ингибиторы eIF4A RocA (2 мкМ, 2 ч) и патеамин А (PatA, 0.5 мкМ, 1 ч) или подвергали осмотическому стрессу путем обработки NaCl (0,2 М, 1 ч). Не подвергавшиеся стрессу клетки (контроль) использовали в качестве контроля. Клетки исследовали на наличие основного маркера SG G3BP1 (иммунофлуоресценция с использованием G3BP1-специфического антитела) и поли(А) мРНК [FISH с использованием олиго(dT)-зонда]. Количественно определяли G3BP1- или олиго(dT)-положительные клетки. Результаты средние ± стандартная ошибка среднего. ( n =3). (B) Репрезентативные изображения клеток HAP1, окрашенных G3BP1 (зеленый) и олиго(dT) (красный) после того, как клетки подверглись специфическим стрессам.Область в рамке увеличена, и линейное сканирование используется для оценки колокализации (отдельные цвета показаны на графике) маркеров. (C) Репрезентативные изображения клеток HAP1, окрашенных G3BP1 (зеленый), eIF4G (красный) и eIF3B (синий) после того, как клетки подверглись специфическим стрессам или остались необработанными (контроль). Обрамленная область увеличена, и линейное сканирование используется для оценки колокализации (отдельные цвета показаны на графике) маркеров.

Мы также оценили наличие других белковых маркеров SG, включая eIF3b, eIF4G, PABP и TIA-1 (C, рис.С2). Мы обнаружили, что все испытанные стрессы индуцировали рекрутирование TIA-1 и G3BP1 в очаги, индуцированные стрессом (C; рис. S2, и данные не показаны), тогда как SG, индуцированные в ответ на RocA, MG132 и УФ, содержат меньше eIF3b и eIF4G (C ; рис. S2).

Мы также отслеживали образование ПБ, гранул цитоплазматической РНК, отличных от SG (Anderson and Kedersha, 2006; Anderson et al., 2015; Stoecklin and Kedersha, 2013), при различных стрессах с использованием двух разных маркеров ПБ (Hedls, также известных как EDC4 и Dcp1a) (фиг.S3А,Б). PB присутствуют в клетках HAP1 как в контрольных условиях, так и в условиях стресса (рис. S3A). SA и, в меньшей степени, NaCl способствуют образованию PB, в то время как обработка тепловым шоком, MG132, УФ и RocA снижает количество PB-положительных клеток. Напротив, Thaps и PatA не влияют на формирование PB (рис. S3B). Интересно, что при УФ-обработке ПБ присутствуют только в клетках, в которых отсутствуют какие-либо SG-подобные очаги (по оценке окрашивания TIA-1).

Связь между формированием SG-подобных фокусов и трансляцией

Формирование SG сопряжено с общей репрессией трансляции.Как eIF2α-зависимые, так и -независимые стимулы могут ингибировать инициацию трансляции и способствовать образованию SG (Dang et al., 2006; Kedersha et al., 1999). Рибосомы должны отделяться от транскриптов до того, как мРНП будут собраны в SG, в качестве лекарств, сохраняющих полисомы [например, обработка циклогексимидом (CHX)] или способствовать их разборке [например, обработка пуромицином (Puro)] ингибирует или способствует образованию SG соответственно (Kedersha et al., 2000). Соответственно, мы оценили, зависит ли стресс-специфическое образование SG и SG-подобных фокусов от фосфорилирования eIF2α и находится ли оно в динамическом равновесии с транслирующими полисомами.

CRISPR/Cas9 использовали для создания клеток HAP1, несущих только нефосфорилируемый вариант eIF2α (S51A) (рис. S4A, верхняя панель). Эти клетки не демонстрируют каких-либо обнаруживаемых различий в морфологии, скорости роста или жизнеспособности в условиях отсутствия стресса по сравнению с клетками HAP1 дикого типа (WT) (данные не показаны). Клетки HAP1 WT и S51A экспрессируют сходные уровни белка eIF2α (A, контроль), демонстрируют сопоставимые уровни базальной трансляции in vivo (A, контроль) и в лизатах IVT (B, контроль).Обработка клеток SA, которая запускает фосфорилирование eIF2α в клетках WT, но не в клетках S51A, сильно ингибирует трансляцию в лизатах, полученных из клеток WT, но не в клетках S51A HAP1 (B, правая панель).

Связь между стрессами, фосфорилированием eIF2α, ингибированием трансляции и образованием очагов стресса. (A) WT или eIF2α ^S51A (S51A) Клетки HAP1 подвергали обработке SA (200 мкМ, 1 ч), тепловому шоку (44°C, 1 ч), MG132 (100 мкМ, 1 ч), Thaps (4 мкМ, 2 ч), RocA (2 мкМ, 2 ч), PatA (0.5 мкМ, 1 ч) или NaCl (0,2 М, 1 ч). Клетки обрабатывали пуромицином в течение 5 мин и лизировали. Клеточные лизаты подвергали вестерн-блоттингу с использованием антител к пуромицину (Puro), p-eIF2α, тотальному eIF2α и актину. Показаны репрезентативные изображения ( n ≥3). (B) IVT-анализ мРНК-репортера NanoLuc на основе клеточных лизатов, полученных из клеток WT и S51A HAP1, которые были обработаны SA или не обработаны (контроль). Показаны относительные единицы люциферазы. н =3. * P ≤0,05 по сравнению с WT, обработанным SA (непарный критерий Стьюдента t ).(C) Клетки WT и S51A HAP1 оценивали на наличие G3BP1-позитивных очагов с помощью иммунофлуоресценции с использованием G3BP1. Показан процент клеток с G3BP1-положительными очагами. н ≥3. Количественные результаты представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего.

Затем мы сравнили клетки WT и S51A HAP1 после воздействия на них стресс-индуцирующих условий. Все стрессы резко подавляют трансляцию в клетках дикого типа, на что указывает рибопуромицилирование (А). Уровень репрессии трансляции коррелирует со способностью SA, теплового шока, MG132, Thaps и UV запускать фосфорилирование eIF2α в клетках дикого типа.Как и ожидалось из других исследований, RocA и осмотический стресс не влияют на уровни p-eIF2α (A), но все же ингибируют трансляцию. В то время как SA, тепловой шок, MG132 и Thaps не эффективно подавляют трансляцию в клетках S51A и, таким образом, зависят от p-eIF2α, УФ ингибирует трансляцию в клетках S51A, несмотря на запуск сильного фосфорилирования eIF2α в клетках WT. Таким образом, УФ, по-видимому, ингибирует трансляцию, используя как p-eIF2α-зависимый, так и -независимый механизмы. RocA и осмотический стресс также подавляют трансляцию в клетках S51A (A), подтверждая, что эти стрессы ингибируют трансляцию независимым от p-eIF2α образом.

Мы также наблюдали за образованием SG и SG-подобных очагов в клетках WT и S51A HAP1 (C) после их воздействия на панель стрессовых условий. WT, но не клетки S51A, легко способствуют образованию SG в ответ на SA (C и A-C), что согласуется с опубликованными данными. Подобный анализ показал, что SA, тепловой шок, MG132 и Thaps индуцируют образование стресс-индуцированных очагов p-eIF2α-зависимым образом, тогда как УФ, RocA, PatA и осмотический стресс вызывают образование стресс-индуцированных очагов в p-eIF2α. -независимая манера (С).Таким образом, наши данные показывают, что образование стресс-индуцированных очагов обычно коррелирует с индуцированной стрессом трансляционной репрессией.

Трансляционно-зависимая динамика СГ и стресс-индуцированных очагов. Клетки (A, B) WT (A) и S51A (B) HAP1 обрабатывали SA, тепловым шоком, MG132, Thaps, UV, RocA, PatA или NaCl, как описано ранее (C). За 30 мин до сбора клетки обрабатывали CHX (50 мкг/мл) или пуромицином (20 мкг/мл). Клетки оценивали с помощью окрашивания G3BP1 и наносили на графики в процентах в соответствии с цветовым кодом: серый, только стресс; синий, стресс с CHX; красный, стресс пуромицином.Результаты средние ± стандартная ошибка среднего, n ≥3. * P ≤0,05 по сравнению с одним только стрессом (непарный критерий Стьюдента t ). (C) Репрезентативные изображения клеток из B, окрашенных G3BP1, eIF4G и TIA-1.

Затем мы использовали лечение CHX или пуромицином, чтобы определить, находятся ли вызванные стрессом очаги в равновесии с полисомами. Как и ожидалось, CHX эффективно способствует принудительной разборке SA-индуцированных SGs, даже при постоянном присутствии SA в клетках WT (A, C, +CHX). Точно так же CHX эффективно индуцирует разборку других p-eIF2α-зависимых SG (MG132-, Thaps-, теплового шока) и частично разрушает PatA-, RocA- и УФ-индуцированные фокусы (A, B, +CHX), но не влияет на осмотически индуцированные очаги (A–C).В то время как образование SA-индуцированных (при более низкой концентрации, данные не показаны) и Thaps-индуцированных SG демонстрируют статистически значимое увеличение при обработке пуромицином, пуромицин существенно не увеличивает MG132-, УФ-, RocA- и PatA-индуцированную сборку SG (A, Б). Опять же, на осмотически индуцированные очаги лечение пуромицином не влияет (A–C).

Клетки HAP1 с нокаутом специфических eIF2αK

MEF, полученные на моделях мышей с нокаутом (KO) отдельных eIF2αK, использовали для изучения клеточных стрессовых реакций, механизмов ингибирования трансляции и образования SG.Однако такие KO MEF не являются человеческими и гетерогенными (происходят из разных генетических фонов). Здесь мы использовали коммерчески доступные варианты HAP1, в которых отсутствуют все известные eIF2αK, обозначенные как ΔHRI, ΔPKR, ΔPERK и ΔGCN2 (eIF2αK1–eIF2αK4), для изучения специфичности и избыточности каждого eIF2αK в ответ на определенные стрессы.

Мы подтвердили геномные изменения путем секвенирования интересующего локуса (рис. S4A), а также подтвердили отсутствие экспрессии белков PKR, PERK и GCN2 с помощью вестерн-блоттинга (рис.С4Б). К сожалению, мы не смогли найти HRI-специфическое антитело, которое бы стабильно работало (данные не показаны). Все клеточные линии KO демонстрируют сопоставимые уровни общей трансляции и демонстрируют отсутствие фосфорилирования eIF2α в базовых условиях (A, контрольная панель). Затем мы обработали клетки KO стрессами, вызывающими фосфорилирование eIF2α (SA, тепловой шок, Thaps, MG132 и UV), и отслеживали уровни трансляции в этих клетках. В ответ на СА все клеточные линии демонстрируют ингибированную трансляцию, за исключением клеток ΔHRI.Точно так же ингибирование трансляции с помощью Thaps и UV требует одного eIF2αK, PERK и GCN2 соответственно (A). Напротив, MG132 и тепловой шок эффективно ингибируют трансляцию в каждой клеточной линии KO, предполагая, что они активируют более одного eIF2αK или имеют другие независимые от eIF2α эффекты на трансляцию. Точно так же не наблюдалось общих различий в трансляции и уровне p-eIF2α между различными линиями клеток eIF2αK-KO и WT в случае теплового шока или обработки MG132 (A).

Определение активности eIF2αK в ответ на стресс. (A) Мутантные клетки WT, ΔHRI, ΔPKR, ΔPERK и ΔGCN2 подвергали воздействию SA, теплового шока, Thaps, MG132, УФ или NaCl, как описано на предыдущих рисунках. Клетки обрабатывали пуромицином в течение 5 минут перед лизисом. Экстракт цельных клеток анализировали вестерн-блоттингом на пуромицин, p-eIF2α, общий eIF2α и актин, n ≥3. (B) Клетки, положительные на окрашивание G3BP1, анализировали, как в B. Результаты представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего, n ≥3. * P ≤0,05 по сравнению с WT (непарный критерий Стьюдента t ).

Затем мы оценили способность клеток KO индуцировать SG или SG-подобные очаги стресс-специфическим образом (B). Для SA и Thaps киназа, участвующая в репрессии трансляции, также участвует в формировании SG (HRI и PERK соответственно). NaCl, используемый здесь в качестве контроля, индуцирует гиперосмотический стресс и ингибирует трансляцию независимым от p-eIF2α образом (Bevilacqua et al., 2010) и не требует никакого eIF2αK для стимуляции образования SG. MG132 вызывает снижение образования SG как в клеточных линиях ΔHRI, так и в клеточных линиях ΔPERK, что согласуется с его активацией более чем одного eIF2αK (B).После теплового шока ни одна из клеток KO не демонстрирует существенной разницы в их способности индуцировать SG (B), что согласуется с данными в A. Это предполагает, что тепловой шок активирует несколько eIF2αK или, возможно, инактивирует фосфатазы, которые дефосфорилируют p-eIF2α. Более того, тепловой шок может также работать через альтернативные пути, независимые от p-eIF2α, которые основаны на активации 4E-BP (Sukarieh et al., 2009).

Выживаемость клеток и SG

SG являются биомаркерами адаптивного ответа.В случае успеха адаптация к стрессу способствует выживанию, что позволяет предположить, что дефекты в формировании SG (либо отсутствие образования, либо отсутствие вторичной агрегации) могут приводить к снижению выживаемости клеток (Aulas and Vande Velde, 2015). Другие данные предполагают, что некоторые стрессы (такие как осмотический стресс) могут индуцировать «дефектные» SG в клетках, неспособных фосфорилировать eIF2α, что приводит к апоптозу вместо выживания (Bevilacqua et al., 2010). Мы проанализировали стресс-специфические различия в выживаемости клеток WT и S51A HAP1.Клетки подвергали острому стрессу, как описано, и клеточную среду заменяли, и клеткам давали возможность восстановиться в течение 24  часов перед оценкой гибели клеток посредством исключения трипанового синего. Стрессы, которые индуцируют стрессовые гранулы независимо от p-eIF2α (RocA, PatA и NaCl; ), не вызывали гибели клеток ни в клетках WT, ни в клетках S51A. Из стрессов, зависящих от p-eIF2α, SA, тепловой шок и Thaps не вызывали гибель клеток в клетках WT HAP1, в то время как MG132 и УФ вызывали. За исключением Thaps, все p-eIF2α-зависимые стрессы способствуют значительно большей гибели клеток в клетках S51A, чем в клетках WT.

Стресс-специфическое влияние на гибель клеток WT и S51A клеток HAP1. Мутантные клетки WT или eIF2α ^S51A подвергали воздействию SA, теплового шока, Thaps, MG132, УФ, PatA, RocA или NaCl. После стресса среду меняли и через 24  часа оценивали гибель клеток по исключению трипанового синего. Результаты средние ± стандартная ошибка среднего, n ≥3. * P ≤0,05 по сравнению с WT (непарный критерий Стьюдента t ).

ОБСУЖДЕНИЕ

Исторически сложилось так, что многие исследования SG проводились на различных клеточных линиях как человеческого, так и мышиного происхождения.Хотя такие исследования информативны, генетическое разнообразие клеточных линий мышей способствует наблюдаемой гетерогенности результатов. Кроме того, хотя некоторые крупные плоские клетки (например, клетки остеосаркомы U2OS, широко используемые для изучения гранул РНК) идеально подходят для изучения SG с помощью иммунофлуоресценции, их анеуплоидия усложняет использование генетических манипуляций для выделения молекулярных путей. Мы использовали человеческие гаплоидные клетки HAP1, геномы которых были полностью секвенированы и генетически поддаются обработке благодаря наличию только одного аллеля каждого гена, для изучения SG, механизмов трансляции и стрессовых реакций.В ответ на обработку SA, классический триггер образования SG, канонические SG сильно индуцируются почти в 100% клеток WT HAP1 (рис. S1A,C). СГ, индуцированные HAP1 SA, каноничны по своему составу, зависимости от p-eIF2α и динамическому поведению. Во-первых, SA-индуцированный состав SG неотличим от состава SG, зарегистрированного в других типах клеток (например, в клетках U2OS или HeLa). HAP1 SA-индуцированные SG содержат поли(A) мРНК, факторы инициации трансляции eIF4G, eIF3b, PABP и маркеры SG G3BP1, Caprin1 и TIA-1 (рис.С1С). После снятия стресса SA-индуцированные SG эффективно растворяются, демонстрируя свою динамичную и стресс-реактивную природу. Во-вторых, образование SA-индуцированных SG в клетках HAP1 коррелирует с усилением p-eIF2α и последующей репрессией трансляции (рис. S1B). В-третьих, лизаты IVT, происходящие от HAP1, поддерживают как каноническую [5′-кэп и 3′-поли(А)-хвост], так и неканоническую (IRES-управляемую) инициацию трансляции (14). Важно отметить, что система IVT на основе HAP1 точно повторяет синергию 5′-кэпа и поли(А) хвоста, важный аспект трансляции мРНК in vivo (B).Более того, репортеры мРНК эффективно транслировались в присутствии других конкурентных мРНК, поскольку наш протокол приготовления экстракта HAP1 не включает обработку микрококковой нуклеазой.

Хотя SG часто считают однородными объектами, образующимися при различных стрессах, их состав белков и мРНК различается. Например, HSP27 обнаруживается только в SG, индуцированных тепловым шоком, но отсутствует в SG, индуцированных SA (Kedersha et al., 1999). В то время как большая часть мРНК рекрутируется в SGs, индуцированные тепловым шоком, транскрипты, кодирующие белки HSP70, выборочно исключаются (Kedersha and Anderson, 2002).Транскрипты мРНК HSP90 активно исключаются из SA-индуцированных SG (Stöhr et al., 2006). Tristetraprolin (TTP, также известный как ZFP36) рекрутируется в SGs, индуцируемые энергетическим голоданием (индуцируемым FCCP) или зародышеобразование при сверхэкспрессии TTP (Stoecklin et al., 2004). Однако TTP и его мРНК-мишени активно экспортируются из SA-индуцированных SG, что является следствием SA-индуцированной активации MAPKAPK2, которая фосфорилирует два сайта на TTP, что приводит к рекрутированию белков 14-3-3 и изгнанию их из SG (Stoecklin et al. др., 2004). В совокупности эти исследования заключают, что очаги, образующиеся при различных стрессах, различны, а состав очагов зависит от стресса, который их вызвал. Таким образом, мы использовали панель клеток HAP1 для исследования специфических различий в составе SG в ответ на панель различных стрессов, включая окислительный и гиперосмотический стресс, тепловой шок, стресс ER, УФ-излучение, ингибирование протеасом (MG132) и ингибирование eIF4A (PatA и Рока). Неожиданно мы обнаружили, что некоторые стрессы, такие как гиперосмотический стресс, УФ и RocA, индуцируют очаги, лишь частично напоминающие по своему составу и поведению настоящие СГ.

Во-первых, мы показали, что УФ- и RocA-индуцированные очаги стресса не подходят под общее определение гранул РНК, поскольку они не содержат поли(А) мРНК, хотя они все еще могут содержать деаденилированные мРНК (аналогично тому, что наблюдается в ПБ). ) или транскрипты с короткими поли(А)-хвостами [промежуточные продукты укорочения поли(А)]. Эти очаги также неэффективно рекрутируют eIF3b и eIF4G, основные компоненты SG. Напротив, другие канонические маркеры SG, такие как G3BP1 и TIA-1, присутствуют в очагах стресса, индуцированных УФ и RocA.Более того, поскольку УФ- и RocA-индуцированные очаги частично разрушаются при обработке CHX и усиливаются при обработке пуромицином (1), они находятся в равновесии с полисомами (см. ниже). Таким образом, они могут содержать мРНК, не обнаруживаемую с помощью олиго(dT) FISH, возможно, мРНК с короткими поли(А)-хвостами или без них. Наши данные еще раз подчеркивают важность использования более чем одного маркера белка SG и FISH для обнаружения присутствия поли(А) РНК для классификации и, таким образом, понимания природы каждого подтипа стресс-индуцированных очагов.

Во-вторых, SG являются динамическими объектами, находящимися в равновесии с полисомами. Пуромицин усиливает образование SG, способствуя преждевременной разборке полисом, тогда как CHX ингибирует удлинение и предотвращает разборку полисом, тем самым предотвращая образование SG и принудительно разбирая ранее существовавшие SG. Все стресс-индуцированные очаги HAP1, за исключением индуцированных осмотическим стрессом, были, по крайней мере, частично растворены CHX. Насколько нам известно, осмотические SG представляют собой первые SG-подобные очаги (по составу), которые не могут быть обратимо вызваны к разборке в какой-либо степени при лечении CHX.Несмотря на то, что они не могут быть затронуты CHX или пуромицином после их образования, очаги, индуцированные NaCl, предотвращаются предварительной обработкой CHX (Kedersha et al., 2016), что позволяет предположить, что они более стабильны, чем канонические SG. Поскольку предполагаемый механизм их образования обусловлен скоплением молекул из-за осмотического стресса (Bounedjah et al., 2012) и поскольку их образование не зависит от p-eIF2α (Bevilacqua et al., 2010; Kedersha et al., 2016), их стабильность может свидетельствовать об энергетическом барьере для разборки СГ.

Это первое исследование, в котором проводится обширное сравнение множества различных стрессов на одном и том же клеточном фоне. Мы приводим доказательства того, что стресс-индуцированные очаги могут быть разными по составу, с точки зрения равновесия с полисомами и в отношении выживаемости клеток. Мы ожидаем, что система HAP1 предоставит ценные инструменты для выяснения биологии, морфологии и биохимии гранул РНК.

Материал и методы

клеточная культура, лечение лекарств

дикий тип, Δhri (кошка # hzhc000141c011), Δpkr (кошка # hzhc000338c010), Δphgc000338c010), ΔPHGC003), ΔGCN2 (CAT # HZHC001245C030) и EiF2α ^S51A HAP1 клетки (Horizon, специальный сервисный препарат) выдерживали при 37°C в инкубаторе CO ₂ в среде Игла, модифицированной Дульбекко (Gibco), с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (Sigma), HEPES (20 мМ, pH 7.0, Gibco) и 1% пенициллин-стрептомицин. U2OS, линия остеосаркомы, была получена от ATCC. Клетки HAP1 и U2OS размножали и замораживали отдельными аликвотами для будущего использования. В любой момент времени в боксе для тканевых культур используется только один тип клеток. Это помогает избежать загрязнения другими клеточными линиями. Ежемесячно клетки проверяют на наличие микоплазмы. Для индукции SG клетки выращивали до ~70% слияния, затем обрабатывали арсенитом натрия (SA, 200 мкМ, 1 ч), NaCl (0.2 М, 1 ч), тапсигаргин (Thaps, 4 мкМ, 2 ч), рокагламид А (RocA, 2 мкМ, 2 ч), MG132 (100 мкМ, 1 ч или 4 ч), патамин А (PatA, 0,5 мкМ, 1 ч), УФ (200 Дж/м ² с использованием Stratolinker, затем высвобождается 1 ч), тепловой шок (44°C, 1 ч). Обработку пуромицином (20 мкг/мл) и CHX (50 мкг/мл) проводили в течение 30 минут перед сбором покровных стекол или как описано в тексте. Для рибопуромицилирования (Panas et al., 2015) клетки обрабатывали пуромицином (5 мкг/мл) в течение 5 минут перед лизисом.

Генотипирование

Клетки промывали и лизировали в лизирующем буфере для генотипирования (10 мМ Tris-HCl, pH 7.5, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ NaCl, 0,5% ДСН, 10 мкг/мл протеиназы К) в течение 3  ч при 60°С. Затем к предыдущей смеси добавляли осаждающий буфер (150 мМ NaCl, 70 % этанола) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Образцы центрифугировали при 10 000 g в течение 15 мин при 4°C. ДНК промывали 70% этанолом, затем центрифугировали при 10000 g в течение 5 мин при 4°C. Конечный осадок ресуспендировали в элюирующем буфере и оценивали генотипы с использованием следующих праймеров: HRI, 5′-GGTGTTAAAAGAACCCCTACAACAG-3′ и 5′-GTAAAGAGGGGGTTTCGTCATGTTA-3′; PKR, ACTGTTTGAGGTGACTGCTTAAATG-3′ и 5′-TTGAATGTAAGGGAACGTGTGAATG-3′; PERK, 5′-CTCTTGTGGCATAAATCAGT-3′ и 5′-AATGCCATAACTTTCCAGTC-3′; GCN2, 5′-GAACGAATGGAAGCTGAGT-3′ и 5′-AACATCTATTGCTGATGTAG-3′; и eIF2α ^S51A , 5′-ATGTTTGCTCACTTCGGCAA-3′ и 5′-CCATTTGCCCCATTTTCATGC-3′.

Вестерн-блоттинг

После обработки препаратом клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и обрабатывали ультразвуком в лизирующем буфере (50 мМ Hepes, pH 7,6, 150 мМ NaCl, 0,5% NP40 и 5% глицерин) с Halt-фосфатазой и протеазой. ингибиторы (Thermo Scientific). Буфер для образцов Лэммли, дополненный 100 мМ дитиотреитола (ДТТ), добавляли к образцам до 1-кратной конечной концентрации. Образцы кипятили перед загрузкой на 4–20% трис-глициновый гель (BioRad) и переносили на нитроцеллюлозную мембрану.Мембраны блокировали трис-буферным солевым раствором с 0,1% Tween-20 (TBS-T) с 5% молока в течение не менее 30  мин при комнатной температуре. Антитела разводили в 5% нормальной лошадиной сыворотке в PBS. Первичные антитела инкубировали в течение ночи при 4°C, а вторичные антитела в течение 1 ч при комнатной температуре. Информация об антителах указана в Таблице S1. Обнаружение антител проводили с использованием хемилюминесцентного субстрата SuperSignal West Pico (Thermo Scientific). Сканирование и Photoshop использовали для количественного определения вестерн-блотов, которые использовали в анализе рибопуромицилирования.

Иммунофлуоресценция

3×10 ⁵ Клетки HAP1 выращивали на покровных стеклах, промывали PBS и затем фиксировали метанолом при -20°C в течение 15 мин. Некоторые антитела требовали фиксации 4% формальдегидом, и для них клетки пермеабилизировали 0,1% Triton X100 в течение 15  мин (таблица S1). Покровные стекла блокировали 5% нормальной лошадиной сывороткой не менее чем на 30  мин. Первичные антитела разводили блокирующим буфером и инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем добавляли вторичные антитела в разведении 1:250 вместе с Hoechst 33342 на 1 ч при комнатной температуре.Клетки тщательно промывали и помещали в среду для заливки Vinol.

Для гибридизации in situ клетки фиксировали 4% параформальдегидом в течение 15 мин, затем подвергали пермеабилизации метанолом при -20°C в течение 15 мин. Клетки инкубировали не менее ночи в 70% этаноле при 4°С. На следующий день клетки дважды промывали 2-кратным солевым раствором цитрата натрия (SSC), блокировали в буфере для гибридизации (Sigma) в течение 30 мин, затем проводили гибридизацию с использованием биотинилированного олиго(dT ₄₀ ) зонда (2 нг/мкл). ) разводят в гибридизационном буфере при 37°С.После обширных промывок 2× SSC при 37°C зонд выявляли с помощью Cy-конъюгированного стрептавидина (Jackson Immunoresearch Laboratories) с последующим иммуноокрашиванием, как описано выше.

Микроскопия

Широкопольную флуоресцентную микроскопию проводили с использованием микроскопа Eclipse E800 (Nikon), оснащенного эпифлуоресцентной оптикой и цифровой камерой (Spot Pursuit USB). Получение изображения выполняли с объективом 40× (PlanApo; Nikon).

Создание линейных сканов

Колокализация (линейные сканы) оценивалась с помощью ImageJ.Линия была проведена через SG, и интенсивность была измерена по линии с использованием параметра Plot Profile, и результаты были экспортированы в Excel для создания графиков. Произвольная интенсивность была построена в соответствии с произвольным расстоянием для каждого канала.

Количественное определение

Количественное определение процента SG-позитивных клеток выполняли с помощью ImageJ путем подсчета количества клеток с не менее чем двумя дискретными G3BP1-положительными очагами из >200 клеток на условие за эксперимент, по крайней мере, из трех независимых экспериментов.

Для получения экстрактов трансляции клетки трипсинизируют и промывают в буфере HBSS, а затем ресуспендируют в буфере для лизиса лизолецитина [20 мМ HEPES-KOH, pH 7,4, 100 мМ KOAc, 2,2 мМ 9O1 (2OAc) 2 , 2 мМ DTT и 0,1 мг/мл лизолецитина] в течение 1 мин и центрифугирование 10 с, 10000 г при 4°C. Осадок ресуспендировали в гипотоническом экстракционном буфере [20 мМ HEPES-KOH pH 7,4, 10 мМ KOAc, 1 мМ Mg(OAc) ₂ , 4 мМ DTT с ингибитором протеазы] и инкубировали на льду в течение 10 мин, затем пропускали через Иглу G-27 и центрифугировали в течение 10 мин при 10 000 г при 4°C.

Анализы трансляции проводили путем инкубации трансляционного экстракта с буфером реакции трансляции [20 мМ HEPES-KOH pH 7,6, 1 мМ DTT, 0,5 мМ спермидин-HCl, 0,6 мМ Mg(OAc) ₂ , 8 мМ креатинфосфат, 1 мМ АТФ, 0,2 мМ GTP, 120 мМ KOAc, 25 мкМ смеси аминокислот], 100 нг репортерной РНК и 2 U ингибитора РНКазы при 30°C в течение 1  часа. Анализы считывали с помощью GloMax EXPLORER (Promega).

Благодарности

Мы благодарим сотрудников лабораторий Иванова и Андерсона за полезные обсуждения и отзывы о рукописи.Мы благодарим лабораторию Лю (Медицинская школа Джона Хопкинса, Балтимор, ) за испытание патамина А и профессора Уильяма Марзлаффа (Университет Северной Каролины) за антитело против SLBP.

Сноски

Конкурирующие интересы

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих или финансовых интересов.

Вклад авторов

А.А., М.М.Ф., С.М.Л. и Н.К. помогал планировать, проводить и анализировать эксперименты. C.A.A. помогал проводить опыты.А.А., М.М.Ф. и С.М.Л. помог с рукописью и редактированием изображений. ПИ. задумал проект, помог спланировать эксперименты, проанализировал данные и написал рукопись. П.А. соавтором рукописи.

Финансирование

Эта работа поддерживается Национальным институтом здравоохранения [{«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«text»:»GM111700″,»term_id»:»221279729″, «term_text»:»GM111700″}}GM111700 и {«type»:»entrez-нуклеотид»,»attrs»:{«текст»:»CA168872″,»term_id»:»350

Доп. информация

Доп. . Заметно подчеркнуто: роль eIF2, TIA-1 и стрессовых гранул в трансляции белка. Шапероны клеточного стресса 7, 213-221. 10.1379/1466-1268(2002)007<0213:VSTROE>2.0.CO;2 [бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Индуцированная сонопорацией пермеабилизация клеточной мембраны и разборка цитоскелета при различных акустических параметрах и параметрах микропузырьков-клеток

COVID-19 и свобода человека Джозеф Э. Стиглиц

В условиях пандемии действия одного человека влияют на благополучие других.И всякий раз, когда есть такие внешние факторы, благополучие общества требует коллективных действий: правил, ограничивающих социально вредное поведение и поощряющих общественно полезное поведение.

НЬЮ-ЙОРК. Рост числа случаев COVID-19, госпитализаций и смертей в Соединенных Штатах служит горьким напоминанием о том, что пандемия еще не закончилась. Мировая экономика не вернется к нормальной жизни, пока болезнь не будет взята под контроль повсеместно.

1. Почему Орбан снова победил Политика ФЕРЕНЦ ИСЗА / AFP через Getty Images
2. Грядущее десятилетие безмирия PS Онпойнт Арис Мессинис/AFP через Getty Images

   Эксклюзивно для подписчиков

3. Отправить Меркель в Москву Политика Саша Мордовец / Getty Images

Но случай с США — это настоящая трагедия, потому что то, что сейчас здесь происходит, так ненужно.В то время как те, кто находится на развивающихся рынках и в развивающихся странах, жаждут получить вакцину (многие из них умирают, потому что не могут ее получить), поставок в США достаточно, чтобы обеспечить двойную дозу, а теперь и повторную прививку, всем жителям страны. И если почти все будут вакцинированы, COVID-19 почти наверняка просто «исчезнет», как незабываемо выразился бывший президент Дональд Трамп.

И все же недостаточно людей в США были вакцинированы, чтобы не допустить, чтобы высококонтагиозный вариант Delta привел к тому, что число случаев заболевания во многих областях достигло нового максимума.Как так много людей в стране с, казалось бы, хорошо образованными людьми поступают так иррационально, вопреки своим интересам, вопреки науке и вопреки урокам истории?

Частично ответ заключается в том, что страна, при всем ее богатстве, не так хорошо образована, как можно было бы ожидать, что отражено в сравнительных международных показателях страны по стандартизированным оценкам. Во многих частях страны, в том числе в районах с самым высоким уровнем устойчивости к вакцинации, научное образование находится на особо низком уровне из-за политизации фундаментальных вопросов, таких как эволюция и изменение климата, которые во многих случаях были исключены из школьных программ.

В этой среде дезинформация может получить поддержку многих людей. А платформы социальных сетей, огражденные от ответственности за то, что они передают, создали бизнес-модель максимального «вовлечения пользователей» путем распространения дезинформации, в том числе о COVID-19 и вакцинах.

Но ключевой частью ответа является глубоко неверное толкование, особенно правыми, свободы личности. Те, кто отказывается носить маски или соблюдать социальную дистанцию, часто утверждают, что требование сделать это ущемляет их свободу.Но свобода одного человека — это «несвобода» другого человека. Если их отказ носить маску или пройти вакцинацию приводит к тому, что другие заражаются COVID-19, их поведение лишает других более фундаментального права на саму жизнь.

PS События: Финансы 3.0

Криптовалюты и технологии на основе блокчейна никуда не денутся. Но как будет выглядеть их следующая глава?

Присоединяйтесь к нашему живому виртуальному мероприятию, Финансы 3.0 , чтобы услышать, как ведущие мировые эксперты обсуждают, как максимизировать преимущества и снизить риски растущей новой криптоиндустрии.

Зарегистрируйтесь сейчас

Суть дела в том, что есть большие экстерналии: В условиях пандемии действия одного человека влияют на самочувствие других. И всякий раз, когда есть такие внешние факторы, благополучие общества требует коллективных действий: правил, ограничивающих социально вредное поведение и поощряющих общественно полезное поведение.

Любое упорядоченное общество влечет за собой ограничения. Но хотя запреты на убийство, воровство и т. д. ограничивают свободу личности, все мы понимаем, что без них общество не могло бы функционировать. В нашем пост-COVID-мире мы могли бы интерпретировать Десять Заповедей так: «Не убий, в том числе путем распространения инфекционных заболеваний, когда этого можно избежать».

Аналогично: «Ты должен сделать прививку». Любое ущемление свободы человека, требующее безопасной и высокоэффективной вакцинации против COVID-19, меркнет по сравнению с социальными выгодами и, как следствие, экономическими выгодами общественного здравоохранения.Требовать вакцинации всех людей, за исключением некоторых медицинских случаев, не составляет труда. Хотя многие правительства кажутся слишком робкими, чтобы вводить это требование, работодатели, школы и общественные организации — любая организованная деятельность, которая сближает людей с другими, — должны это делать.

Как мы узнали за последние 18 месяцев, глобальное здравоохранение является глобальным общественным благом. Пока болезнь бушует в некоторых частях мира, растет риск более смертоносной, более заразной и более устойчивой к вакцинам мутации.

Однако в большинстве стран мира проблема не в устойчивости к вакцинации, а в острой нехватке вакцин. Очевидно, что частный сектор не в состоянии увеличить производство, чтобы обеспечить достаточное предложение. Это потому, что производителям вакцин не хватает капитала? Есть ли нехватка стеклянных флаконов или шприцев? Или это потому, что они надеются, что меньшее количество доз приведет к более высоким ценам и еще большей прибыли? Одним из основных препятствий на пути увеличения предложения является доступ к необходимой интеллектуальной собственности, поэтому отказ от прав интеллектуальной собственности, обсуждаемый во Всемирной торговой организации, так важен.

Учитывая срочность и масштаб проблемы, необходимо больше: среди шагов, которые может предпринять администрация президента США Джо Байдена, — применить Закон об оборонном производстве и использовать право собственности федерального правительства на ключевые патенты. США разрешают фармацевтическим компаниям свободно использовать этот общедоступный IP, в то время как они получают миллиарды долларов прибыли. США должны использовать все имеющиеся в их распоряжении инструменты для увеличения производства внутри страны и за рубежом.

Это тоже ежу понятно.Даже если затраты на глобальную вакцинацию составят десятки миллиардов долларов, эта сумма будет меркнуть по сравнению с ущербом от постоянных вспышек COVID-19 для жизней, средств к существованию и мировой экономики.

Электрическая безопасность

Части под напряжением, которым может подвергаться работник, должны быть обесточены до того, как работник начнет работать с ними или рядом с ними, за исключением случаев, когда обесточивание частей создает дополнительную или повышенную опасность или невозможно из-за конструкции оборудования или эксплуатационных ограничений.Примеры повышенных или дополнительных опасностей включают прерывание работы оборудования жизнеобеспечения, отключение систем аварийной сигнализации, отключение вентиляционного оборудования в опасных зонах или отключение освещения зоны. Детали под напряжением, которые работают при напряжении менее 50 вольт на землю, не нужно обесточивать, если нет повышенного риска электрических ожогов или взрывов из-за электрических дуг.

Обесточенные части

Когда сотрудники работают с обесточенными деталями или находятся достаточно близко к ним, чтобы подвергать сотрудников опасности поражения электрическим током, необходимо соблюдать следующие правила техники безопасности:

• Считать находящимися под напряжением любые проводники и части электрооборудования, которые были обесточены, но не были должным образом заблокированы или маркированы.
• В то время как любой работник подвергается контакту с частями стационарного электрического оборудования или цепями, которые были обесточены, цепи, питающие части, должны быть заблокированы или маркированы, или и то, и другое. Кроме того, необходимо контролировать опасность поражения электрическим током; квалифицированный специалист должен проверить цепь на отсутствие питания от всех источников напряжения.
• Перед обесточиванием цепей или оборудования необходимо определить безопасные процедуры обесточивания цепей и оборудования. Все источники электроэнергии должны быть отключены.Устройства цепи управления, такие как кнопки, электрические переключатели и блокировки, не должны использоваться в качестве единственного средства обесточивания цепей или оборудования. Блокировки не должны использоваться вместо процедур блокировки и маркировки.

Части под напряжением

Работники считаются работающими с частями, находящимися под напряжением, или рядом с ними, если они работают с открытыми токоведущими частями либо путем прямого контакта, либо с помощью инструментов или материалов, либо когда они работают достаточно близко к частям, находящимся под напряжением, чтобы подвергаться любой опасности, которую они представляют.Только квалифицированный персонал может работать с частями электрических цепей или оборудованием, которые не были обесточены (блокировка/маркировка). Квалифицированные лица способны безопасно работать с цепями под напряжением и знакомы с правильным использованием специальных мер предосторожности, средств индивидуальной защиты, изоляционных и экранирующих материалов, а также изолированных инструментов.

Воздушные линии

При проведении работ вблизи воздушных линий необходимо обесточить и заземлить линии или принять другие защитные меры до начала работ. Такие защитные меры, как ограждение, изоляция или изоляция, должны предотвращать контакт квалифицированного лица, выполняющего работу, с линиями любой частью своего тела или косвенно через проводящие материалы, инструменты или оборудование.

Неквалифицированным лицам, работающим на возвышенности вблизи воздушных линий, не разрешается приближаться или брать в руки токопроводящие предметы, которые могут соприкасаться или приближаться к любой неохраняемой, находящейся под напряжением воздушной линии, чем на следующие расстояния:

Неквалифицированным лицам, работающим на земле вблизи воздушных линий, не разрешается подносить токопроводящие предметы или любые изолированные предметы, не имеющие надлежащего класса изоляции, к неохраняемым воздушным линиям, находящимся под напряжением, на расстояние, указанное выше.

Квалифицированным лицам, работающим рядом с воздушными линиями, будь то на возвышении или на земле, не разрешается приближаться или брать любой проводящий объект без одобренной изолирующей ручки ближе к открытым частям под напряжением, которые указаны в таблице выше, расстояние приближения для Квалифицированные лица, если a.) Человек изолируется от части, находящейся под напряжением, с помощью соответствующих перчаток, при необходимости с рукавами, рассчитанными на используемое напряжение, или b.) Часть, находящаяся под напряжением, полностью изолирована от человека, или c.) Человек токопроводящие объекты при потенциале, отличном от находящейся под напряжением части.

недавняя диверсификация или сортировка предварительно адаптированных кладов?

%PDF-1.7 % 1 0 объект >/Метаданные 4 0 R/Страницы 2 0 R/StructTreeRoot 3 0 R/Тип/Каталог/ViewerPreferences 5 0 R>> эндообъект 4 0 объект >поток Приложение Microsoft® Word 2019/pdf

0000000 конечный поток эндообъект 2 0 объект > эндообъект 3 0 объект > эндообъект 5 0 объект > эндообъект 129 0 объект > эндообъект 130 0 объект > эндообъект 132 0 объект [164 0 R 165 0 R 166 0 R 366 0 R 367 0 R 368 0 R 369 0 R 370 0 R 370 0 R 370 0 R 370 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 371 0 R 372 0 R 372 0 R 372 0 R 372 0 R 373 0 R 374 0 R 374 0 R 374 0 R 374 0 R 375 0 R 376 0 R 377 0 R 378 0 R 378 0 R 378 0 R 378 0 R 379 0 R 168 0 R 380 0 R 381 0 R 382 0 R 170 0 R 171 0 R 172 0 R 173 0 R 174 0 R 175 0 R 176 0 R] эндообъект 133 0 объект > эндообъект 134 0 объект [177 0 R 399 0 R 400 0 R 401 0 R 402 0 R 179 0 R 180 0 R 181 0 R 182 0 R] эндообъект 135 0 объект [183 0 R 408 0 R 409 0 R 410 0 R 411 0 R 412 0 R 413 0 R 186 0 R 414 0 R 415 0 R 416 0 R 417 0 R 418 0 R 419 0 R] эндообъект 136 0 объект [188 0 R 420 0 R 421 0 R 422 0 R 192 0 R 423 0 R 424 0 R 191 0 R] эндообъект 137 0 объект [425 0 Р 426 0 Р 427 0 Р 428 0 Р 429 0 Р 430 0 Р 195 0 Р] эндообъект 138 0 объект [196 0 Ч 197 0 Ч 198 0 Ч 199 0 Ч 200 0 Ч 201 0 Ч] эндообъект 139 0 объект [202 0 Ч 204 0 Ч 206 0 Ч 203 0 Ч 431 0 Ч 432 0 Ч] эндообъект 140 0 объект [207 0 R 433 0 R 434 0 R 435 0 R 436 0 R 437 0 R 438 0 R 439 0 R 440 0 R 441 0 R 442 0 R 443 0 R 444 0 R 445 0 R 446 0 R 447 0 R 448 0 R 449 0 R 450 0 R 451 0 R 452 0 R 453 0 R 454 0 R 455 0 R 456 0 R 457 0 R 458 0 R 459 0 R 460 0 R 461 0 R 462 0 R 463 0 R 464 0 R 465 0 Р 466 0 Р 467 0 Р 468 0 Р 469 0 Р 470 0 Р 471 0 Р 472 0 Р 473 0 Р 474 0 Р 475 0 Р 476 0 Р 477 0 Р 478 0 Р 479 0 Р 480 0 Р 481 0 Р 482 0 Р 483 0 Р 484 0 Р 485 0 Р 486 0 Р 487 0 Р 488 0 Р 489 0 Р 490 0 Р 491 0 Р 492 0 Р 493 0 Р 494 0 Р 495 0 Р 496 0 Р 497 0 Р 498 0 R 499 0 R 500 0 R 501 0 R 502 0 R 503 0 R 504 0 R 505 0 R 506 0 R 507 0 R 508 0 R 509 0 R 510 0 R 511 0 R 512 0 R 513 0 R 514 0 R 515 0 Р 516 0 Р 517 0 Р 518 0 Р 519 0 Р 520 0 Р 521 0 Р 522 0 Р 523 0 Р 524 0 Р 525 0 Р 526 0 Р 527 0 Р 528 0 Р 529 0 Р 530 0 Р 531 0 Р 532 0 Р 533 0 Р 534 0 Р 535 0 Р 536 0 Р 537 0 Р 538 0 Р 539 0 Р 540 0 Р 541 0 Р 542 0 Р 543 0 Р 544 0 Р 545 0 Р 546 0 Р 547 0 Р 548 0 R 549 0 R 209 0 R 210 0 R 211 0 R 212 0 R] эндообъект 141 0 объект [213 0 R 214 0 R 215 0 R 216 0 R 217 0 R 218 0 R 219 0 R] эндообъект 142 0 объект [220 0 R 221 0 R 222 0 R 223 0 R 224 0 R 225 0 R] эндообъект 143 0 объект [226 0 R 227 0 R 228 0 R 229 0 R 230 0 R 231 0 R 232 0 R 233 0 R 234 0 R] эндообъект 144 0 объект [235 0 Р 236 0 Р 238 0 Р 239 0 Р 241 0 Р 237 0 Р 680 0 Р 681 0 Р] эндообъект 145 0 объект [242 0 Ч 243 0 Ч 682 0 Ч 683 0 Ч 245 0 Ч] эндообъект 146 0 объект [246 0 R 247 0 R 250 0 R 251 0 R 252 0 R 253 0 R 254 0 R 255 0 R 256 0 R 684 0 R 685 0 R 686 0 R 248 0 R] эндообъект 147 0 объект [257 0 Р 258 0 Р 259 0 Р] эндообъект 148 0 объект [260 0 Ч 261 0 Ч 262 0 Ч 263 0 Ч] эндообъект 149 0 объект [264 0 Ч 265 0 Ч 266 0 Ч 267 0 Ч] эндообъект 150 0 объект [268 0 Р 269 0 Р 270 0 Р 271 0 Р 272 0 Р 273 0 Р] эндообъект 151 0 объект [274 0 R 275 0 R 687 0 R 688 0 R 689 0 R 690 0 R 691 0 R 692 0 R 693 0 R 694 0 R 695 0 R 696 0 R 697 0 R 277 0 R] эндообъект 152 0 объект > эндообъект 153 0 объект > эндообъект 154 0 объект > эндообъект 155 0 объект > эндообъект 156 0 объект > эндообъект 157 0 объект [278 0 R 279 0 R 280 0 R 281 0 R 282 0 R 283 0 R 284 0 R 285 0 R 286 0 R 287 0 R 288 0 R 289 0 R 290 0 R] эндообъект 158 0 объект [291 0 R 292 0 R 293 0 R 294 0 R 295 0 R 296 0 R 297 0 R 298 0 R 299 0 R 300 0 R 301 0 R 302 0 R 303 0 R 304 0 R 305 0 R] эндообъект 159 0 объект [306 0 R 307 0 R 308 0 R 309 0 R 310 0 R 311 0 R 312 0 R 313 0 R 314 0 R 315 0 R 316 0 R 317 0 R 318 0 R] эндообъект 160 0 объект [319 0 R 320 0 R 321 0 R 322 0 R 323 0 R 324 0 R 325 0 R 326 0 R 327 0 R 328 0 R 329 0 R 330 0 R 331 0 R 332 0 R] эндообъект 161 0 объект [333 0 R 334 0 R 335 0 R 336 0 R 337 0 R 338 0 R 339 0 R 340 0 R 341 0 R 342 0 R 343 0 R 344 0 R 345 0 R] эндообъект 162 0 объект [346 0 R 347 0 R 348 0 R 349 ​​0 R 350 0 R 351 0 R 352 0 R 353 0 R 354 0 R 355 0 R 356 0 R 357 0 R 358 0 R 359 0 R] эндообъект 163 0 объект [360 0 R 361 0 R 362 0 R 363 0 R 703 0 R 704 0 R 705 0 R 706 0 R 707 0 R 708 0 R 709 0 R 710 0 R 711 0 R 365 0 R] эндообъект 360 0 объект > эндообъект 361 0 объект > эндообъект 362 0 объект > эндообъект 363 0 объект > эндообъект 703 0 объект > эндообъект 704 0 объект > эндообъект 705 0 объект > эндообъект 706 0 объект > эндообъект 707 0 объект > эндообъект 708 0 объект > эндообъект 709 0 объект > эндообъект 710 0 объект > эндообъект 711 0 объект > эндообъект 365 0 объект > эндообъект 131 0 объект > эндообъект 31 0 объект >/MediaBox[0 0 612 792]/Parent 2 0 R/Ресурсы>/Шрифт>/ProcSet[/PDF/Text]>>/StructParents 31/Tabs/S/Type/Page>> эндообъект 733 0 объект [737 0 Р 738 0 Р] эндообъект 734 0 объект >поток HW[H~Gp)\KlM’Qz(FLFn0c3*_͜}VƮs+{7:wӉ oٔw$~? M{ÏO:,p:O=ΈLC1′ l’mW7gâa о_5о*О ivRBNQcl4ơ6s+hFdnڿpeakVqNkq?kzNyyq 俼1#3q?CQy2edG]kv=8n;WWꅀn\lf= w۪24eOנY8J-FLV3′]8:tD8 ^Y /2(N=OS ^@WFOP.Дж! bNtˀ`5_f~/aѭJ;]Ou%,n9Leu_*\X>[oX{z?87W}-o70-‘jO؅ěMa|IZ]sQgBLǏ7 UQY «9#pN29_&[E05a>

Руководство по объективу камеры (объяснение деталей, функций и типов!)

Без объектива ваша камера не сможет снимать изображения.

Выбор правильного объектива важен, потому что он поможет вам достичь максимальной производительности вашей камеры. Без хорошего объектива камеры вы увидите потерю разрешения и качества изображения.

Прочтите наше руководство по объективам для фотоаппаратов, чтобы узнать всю необходимую информацию об объективах.

Объектив камеры важнее тела?

Объективы для фотоаппаратов, нравится вам это или нет, являются самой важной частью вашего комплекта.

Объектив камеры обозначает диапазон диафрагмы, который вы можете использовать, возможную глубину резкости и расстояние фокусировки.

Корпуса камер допускают другие настройки, такие как ISO и скорость затвора. Они влияют на качество изображения через разрешение. Но они не так важны, как линзы.

Обычно ваш объектив не может передать столько информации, сколько может предоставить ваша камера.Качество объектива определяет, сколько деталей он может передать. У вас может быть 40-мегапиксельная камера, но вы все равно не сможете ею воспользоваться. Как правило, для не очень дорогого корпуса лучше купить дорогой объектив. Таким образом, вы можете максимально увеличить разрешение изображения.

Анатомия объектива камеры

представляют собой фигурные стеклянные элементы, которые определенным образом преломляют свет. Каждый элемент имеет свою функцию, и они работают вместе в гармонии.

Некоторые из этих деталей прикреплены к оправе объектива, а другие подвижны.Они позволяют масштабировать, фокусировать или помогать в стабилизации изображения.

Что такое фокусное расстояние?

Когда свет проходит через вашу камеру, изображение переворачивается вверх ногами. Точно так же наши глаза видят мир. В нашем случае наш мозг вращает изображение.

Внутри камеры находится пентапризма, которая переворачивает изображение вверх. Как видите, внутри линзы есть пересечение. Это пересечение является конвергенцией между линиями света, которые мы получаем от нашего объекта.

В оптике эта точка пересечения называется «точкой схождения». Расстояние между этой точкой схождения и датчиком изображения или пленкой является фокусным расстоянием.

Почему важно фокусное расстояние?

Фокусное расстояние объектива определяет его поле зрения. Это то, что делает объектив широким, стандартным или телеобъективом.

Учитывайте расположение точки схождения. Чем ближе он к датчику изображения, тем меньше кажется объект.

Представьте, что точка схождения находится намного дальше от датчика изображения. Это заставит объект казаться намного больше.

Как видите, короткое фокусное расстояние создает широкое поле зрения. Объективы с более коротким фокусным расстоянием известны как «широкоугольные».

Верно и обратное. Большое фокусное расстояние создает узкое поле зрения. Эти объективы известны как телеобъективы.

Как кроп-сенсоры влияют на объектив камеры?

Пленочная плоскость в 35-мм пленочных камерах была одного размера.Это отверстие размером 24×36 мм позволяло правильно экспонировать пленку. В настоящее время, с цифровыми камерами, эти размеры сенсора имеют довольно широкий диапазон.

Здесь мы поговорим о том, как размер сенсора камеры влияет на кадрирование вашей сцены.

Что такое кроп-фактор

Вы можете слышать термины «полнокадровый», «эквивалент 35», APS-C или кропнутый сенсор. Большая разница в том, что вы на самом деле снимаете со своей сцены.

Полнокадровый или 35-мм аналог — это одно и то же.Если камера указана как полнокадровая, она имеет тот же размер сенсора, что и 35-мм аналоговые камеры: 36×24 мм.

APS-C, Micro Four Thirds и 1 дюйм обрезаны по сравнению с полнокадровым датчиком

• APS-C (кроме Canon) имеет размер 25,1×16,7 мм. Чтобы получить 36×24 мм, нужно умножить число на 1,5. Это дает APS-C кроп-фактор 1,5x.
• APS-C (Canon) имеет размер 22,5×15 мм. Чтобы получить размер 36×24 мм, нужно умножить число на 1.6. Это дает APS-C кроп-фактор 1,6x.
• Micro Four Thirds (MFT) имеет сенсор размером 18×13,5 мм. Чтобы получить 36×24 мм, вам нужно умножить число на 2. Это дает системам Four-Thirds кроп-фактор, равный 2x.

Принцип работы кроп-сенсора заключается в том, что он увеличивает фокусное расстояние объектива. Объектив 35 мм становится 50 мм с кроп-фактором Nikon 1,5x.

Разница между зум-объективами и объективами с фиксированным фокусным расстоянием

Широкоугольный, стандартный или телеобъектив — каждый объектив относится к одной из двух категорий; зум или премьер.

позволяют точке схождения перемещаться ближе или дальше от сенсора.

Объектив с фиксированным фокусным расстоянием является постоянным объективом.

Сложность зум-объективов приводит к потере качества. Кроме того, они не позволяют открывать диафрагму так же широко, как объективы с фиксированным фокусным расстоянием.

Вы должны потратить больше на зум-объектив с тем же качеством изображения и яркостью, что и у фикс-объектива.

Диафрагма объектива

— еще одна причина, по которой фотографы предпочитают один объектив другим.Слово диафрагма означает отверстие, отверстие или зазор и описывает размер кольца диафрагмы объектива.

Через это место проходит свет, попадая на датчик камеры. Диафрагма работает как зрачок в наших глазах. Они оба контролируют количество света, попадающего в камеру или в глаз.

Числа диафрагмы представляют собой долю диаметра апертуры и фокусного расстояния объектива. Мы видим, что диафрагмы записываются как f/2 или f/11.

Если вы снимаете сцену с объективом с фокусным расстоянием 100 мм и f/2, диаметр вашего объектива составляет 50 мм в поперечнике.

Число f увеличивается, но диафрагма уменьшается. Значение f/2 больше, чем f/4, что на два шага ярче, чем f/8.

Как диафрагма влияет на объективы?

При выборе объектива самым важным фактором является максимальная светосила. Этот номер написан на объективе и включен в его технические характеристики.

Самая большая диафрагма — это выражение того, насколько «ярок» объектив. Ярче лучше.

Часто меньшее число f означает лучшее качество изображения.Например, вы можете ожидать, что объектив с диафрагмой f/1.2 превзойдет объектив с диафрагмой f/1.8 с точки зрения разрешающей способности.

Что такое переменная диафрагма?

Переменная диафрагма — это различные максимальные значения диафрагмы (наименьшая диафрагма), которую может использовать ваш объектив. Это зависит от степени увеличения, которую вы используете.

Диафрагма может создавать некоторые препятствия, когда речь идет о зум-объективах. В качестве примера возьмем объектив 70–300 мм f/4–5,6. На 70 мм вы можете использовать диафрагму f/4. 70 разделить на 4 равно 17,5 мм.

При максимальном увеличении мы переходим от фокусного расстояния от 70 мм к 300 мм.Снятые вами изображения увеличиваются на 4,3%. На 300 мм максимальная диафрагма составляет f/5,6, а диаметр — 5,4 мм.

Но почему объектив не может быть f/4 во всем диапазоне зума? При 300 мм диафрагма f/4 составит 75 мм. Это слишком много, чтобы поместиться в тонкий корпус объектива.

Многие фотографы считают эти объективы низшими и избегают их. Эти линзы предлагают больше вариативности, но и у них есть свои недостатки. Как правило, вы жертвуете качеством изображения.

с постоянной апертурой обладают рядом существенных преимуществ.Они имеют лучшее изображение и качество сборки, чем их аналоги.

Маркировка объектива камеры

Все числа, которые вы найдете на объективе, очень важны. Первое число обычно является фокусным расстоянием объектива. Это число представлено в миллиметрах.

Если вы видите одну цифру, а не диапазон, это означает, что это объектив с постоянным фокусным расстоянием. Это может быть 24 мм, 50 мм, 85 мм или что-то подобное.

Диапазон фокусных расстояний будет состоять из двух чисел, разделенных тире.24-70мм хороший пример.

Второе число, которое вы найдете на объективе, обычно означает максимальную диафрагму объектива. Если у вас есть одно число, это означает, что ваш зум-объектив имеет фиксированную максимальную диафрагму.

Prime не имеют переменной максимальной диафрагмы.

Если у вас два числа, разделенные тире, это означает, что ваш зум-объектив имеет переменную максимальную диафрагму. Это будет выглядеть примерно так: f/4-5.6.

Какие еще маркировки можно найти на объективе?

• ∞ – 0.5 м — Иногда вы можете найти символ бесконечности, затем тире, а затем индикатор расстояния. Это диапазон фокусировки объектива. Это указывает на ближайшее расстояние фокусировки объектива.
• IS (Canon) / VR (Nikon) / OSS (Sony) — эти обозначения означают стабилизацию изображения, подавление вибраций и оптический стабилизатор SteadyShot. Это означает, что ваш объектив имеет встроенный плавающий элемент, а также моторы и электронику. Эти линзы воспринимают и противодействуют любому движению или сотрясению.
• Ø — за символом ø на линзе обычно следует цифра. Это диаметр передней части объектива. Он также отмечает размер фильтра, который вы можете использовать на объективе. Этот номер необходимо знать при покупке ввинчивающихся фильтров.
• Asph / ASP — означает асферический. Это показывает, что линза имеет некруглые линзы внутри. Эти линзы можно использовать для уменьшения сферических аберраций.
• Macro / CRC (Коррекция на близком расстоянии) — эта маркировка означает, что объектив специально разработан для обеспечения резкости на близком расстоянии.
• USM/HSM/SWM — Ультразвуковой двигатель, Высокоскоростной двигатель и Бесшумный волновой двигатель — это ультразвуковые вибрационные двигатели, которые позволяют выполнять автофокусировку быстрее. Те, которые используются в более дорогих продуктах, намного тише, чем в более дешевых объективах.
• DX (Nikon) / EF-S (Canon) / E (Sony) — эти объективы были специально созданы для камер меньшего размера, чем полнокадровые. Датчики размера APS-C имеют кроп-фактор. Эти линзы дают вам фокусное расстояние с учетом меньшего сенсора.Они меньше и легче своих братьев и сестер, но их нельзя использовать на полнокадровых камерах.
• Другое – Производители объективов используют множество маркировок на своих объективах. Canon любит маркировать свои профессиональные объективы красной буквой «L», а Sigma использует EX для своих профессиональных и эксклюзивных объективов.

Что такое фокусировка объектива?

Линзы имеют точку, в которой сходятся проходящие через них световые лучи. Она называется фокусной точкой.

Фокусировка происходит внутри объектива.Это происходит путем перемещения одного или нескольких элементов объектива ближе или дальше от датчика изображения вашей камеры.

Линза «изгибает» свет и заставляет его сходиться на разных расстояниях от сенсора.

Идеальная конвергенция должна точно соответствовать вашему датчику. Когда вы этого добьетесь, у вас будет идеально сфокусированное изображение или объект.

Как работает автофокус?

Автофокусировка — это всего лишь один из способов получить четкую фокусировку. В этом режиме камера сигнализирует объективу, заставляя его изменить свое фокусное положение.То, какая часть вашей сцены находится в фокусе, зависит от трех разных факторов: настройки диафрагмы, расстояния между вами и элементами сцены и их пространственных отношений.

Многие современные камеры имеют множество точек фокусировки, разбросанных по вашему видоискателю. Их можно перемещать или даже работать в группах, чтобы выбрать более прогрессивное одеяло для фокусировки.

В настоящее время вы можете выбирать между режимами фокусировки в камере, которые влияют на выравнивание точек фокусировки и скорость фокусировки.

Как работает ручная фокусировка?

Помимо того, что фокусировка остается за камерой, есть возможность ручной фокусировки.

Перефокусировка — пустая трата времени, когда объект захватывается в одной фокальной плоскости, а не приближается или удаляется. У вашей камеры также могут быть проблемы с автофокусировкой в ​​других ситуациях, например, в сценах с очень низким контрастом или при слабом освещении. Съемка через стекло — отличный пример проблем с автофокусом. В это время вам нужно будет установить фокус вручную.

У старых камер был фокусировочный экран, который помогал ручной фокусировке. Современные камеры создают красный ореол вокруг объектов, когда они находятся в фокусе.Это называется фокус-пикингом. В беззеркальных системах это можно сделать и в электронном видоискателе.

позволяют вам фокусироваться в режиме просмотра в реальном времени, что означает, что вы можете увеличивать изображение на ЖК-экране.

Как использовать автофокусировку в ручном режиме?

Многие объективы имеют специальную функцию, позволяющую автофокусировать камеру, а затем изменять результат вручную.

Некоторые объективы не позволяют вручную настраивать фокус в режиме автофокуса. Прочтите руководство пользователя, чтобы узнать, способен ли ваш объектив на это.Можно сломать кольцо фокусировки, если на него надавить.

Что такое внутренняя и внешняя фокусировка?

Существует два различных типа фокусировки — внутренняя и внешняя. Вы узнаете, есть ли у вас внешняя фокусировка, так как передний элемент объектива будет выдвигаться, когда вы фокусируетесь.

Это полезно знать для фильтров, особенно поляризационных фильтров. Если ваш объектив поворачивается при фокусировке, вам нужно будет сфокусироваться, прежде чем настраивать фильтры на желаемый эффект.

Что такое индикаторы расстояния?

, особенно аналоги, имеют встроенные индикаторы расстояния.Это для фокусировки, особенно когда нужно сфокусироваться до бесконечности. Они не совсем точны. Но они являются хорошим ориентиром для того, чтобы узнать, в какую сторону повернуть объектив, чтобы сфокусироваться на определенном расстоянии.

Что такое индикаторы глубины резкости?

Объективы с индикаторами расстояния обычно также имеют индикаторы глубины резкости. Они обозначены как «22», «11» и «8». Эти цифры могут отличаться в зависимости от объектива, его конструкции и свойств.

Эти отметки обозначают, какая часть вашей сцены будет в фокусе при определенной диафрагме.Они всегда относятся к индикаторам расстояния и кольцу диафрагмы. Поэтому всегда проверяйте их вместе.

Что такое крепления объектива?

Ваш объектив соединяется с корпусом камеры через крепления объектива. Существует три основных типа крепления — винтовое (в аналоговых камерах), в среднеформатных аналогах используется стопорное кольцо, а третий — байонетное.

Первые два сейчас очень редко используются, но вы можете встретить их на винтажных объективах.

Преимущества байонетного соединения позволяют быстрее менять линзы.Они крепятся к корпусу камеры гораздо более безопасным способом. Байонетные фитинги также обеспечивают электронное соединение между камерой и объективом. Именно это позволяет осуществлять автофокусировку и электронное управление диафрагмой.

У каждого производителя камер свои крепления объектива. За исключением крепления Four-Thirds, которое поддерживается и используется несколькими производителями. Также можно купить адаптеры, чтобы объективы одного производителя можно было использовать на корпусах камер других производителей.

Что такое стабилизация изображения?

Многие объективы современных фотоаппаратов имеют встроенную стабилизацию изображения.Эта функция позволяет снимать сцены с рук, которые раньше были сложными. В этой технологии используются новейшие гироскопические датчики и двигатели для стабилизации любого движения элементов объектива.

— это объективы со стабилизацией изображения. Это связано с тем, что более длинные фокусные расстояния хуже страдают от дрожания камеры, чем от дрожания рук. Ваши изображения могут быть размытыми.

Правило — снимать с выдержкой не ниже вашего фокусного расстояния. Объектив 50 мм имеет предел 1/60 секунды, а объектив 300 мм имеет диапазон 1/250-1/300.IS позволяет вам свести эту настройку к чему-то более удобному.

Некоторые камеры имеют встроенную стабилизацию изображения. Это превращает каждую из ваших линз в стабилизированный глаз.

Стабилизация изображения подавляет не все вибрации. Существует предел тому, насколько далеко может перемещаться этот плавающий элемент объектива.

Кроме того, движения камеры, которые вы хотели бы сохранить, могут быть удалены. Например, панорамные снимки не будут работать так хорошо.

Стабилизация изображения довольно энергоемкая.Ваши батареи могут работать не так долго, как обычно. Выключайте его, когда не используете.

Для чего подходят фильтры?

Большинство объективов имеют резьбу для фильтра на передней панели. Фильтры охватывают ряд различных параметров, включая добавление оттенков или затемнение сцены.

Резьба фильтра

Каждый фильтр с резьбой имеет разный размер, поэтому очень важно выбрать правильный фильтр. На фильтре вы увидите размер резьбы, который будет выглядеть примерно как Ø=68 мм.Существенным преимуществом здесь является то, что вы можете использовать эти фильтры в качестве защиты объектива.

Многие фотографы добавляют световой люк или УФ-фильтр спереди. Это предотвратит появление царапин, краски, грязи или ударов на передней линзе объектива.

.

Вставные фильтры

Вставные фильтры или квадратные фильтры помещаются в держатель — держатель ввинчивается в лицевую панель объектива.

Преимущество здесь в том, что каждый используемый фильтр не нужно вкручивать в объектив.Это более дешевый вариант, но менее универсальный, чем фильтрующая резьба.

Задние фильтры

Некоторые объективы не поддерживают фильтры на передней части объектива. Это особенно верно для специальных объективов, таких как сверхширокоугольные объективы/объективы типа «рыбий глаз».

Передняя часть этих линз закруглена, что не оставляет места для традиционного переднего фильтра. Некоторые из этих объективов имеют прорезь в задней части объектива, куда можно добавить фильтр.

Бленды объектива

Когда на объектив попадает прямой солнечный свет, он создает «блики» или «горячие точки».Солнце может падать под углом, потому что вы фотографируете солнце прямо. Бленда объектива не позволяет прямому окружающему свету испортить изображения.

Что-то подобное сложно контролировать при использовании широкоугольного объектива с полем зрения 84°. Некоторые сверхширокоугольные объективы уже имеют встроенную бленду.

Телеконвертеры

изменяют поведение используемого объектива.

Эти вторичные линзы располагаются между корпусом камеры и объективом.В них есть оптический элемент, который перефокусирует свет.

Перефокусируя свет, они эффективно расширяют диапазон вашего фокусного расстояния.

Наиболее распространены телеконвертеры 1,4х и 2х. 1,4-кратный телеконвертер на объективе 70–200 мм даст эффективное фокусное расстояние 98–280 мм.

Недостатком является то, что вы теряете немного света, так как минимальное значение диафрагмы также увеличивается в том же отношении. F/2.8 становится f/4 и f/5.6 соответственно. Это также приводит к потере качества.

Как можно сфокусироваться на близких объектах?

У каждого объектива есть минимальная дистанция фокусировки. Это означает, что вы можете разместить объектив только на определенном расстоянии от объекта, прежде чем вы больше не сможете фокусироваться.

Использование макрообъективов — это лишь один из способов приблизиться к объекту. Есть еще три способа захвата мелких объектов с соотношением сторон 1:1 и ближе.

Как использовать макрофильтры

Объектив для макросъемки (также известный как фильтр для макросъемки или макрофильтр) — это способ приблизиться к объектам съемки.Этот дополнительный объектив позволяет делать макросъемку без использования специального объектива.

Линзы для макросъемки работают так же, как очки для чтения. Они позволяют объективу сфокусироваться ближе, чем обычно. Они просты в использовании. Просто завинтите резьбу на передней части объектива, и все готово.

Преимущество здесь в том, что вы можете сложить их и использовать несколько фильтров вместе. +1, +2 и +4 дадут вам +7 шагов близости.

Как пользоваться удлинителями

Макроудлинители — это проставки для линз.В них нет оптических элементов, как в телеконвертерах, что является дешевым вариантом.

Обычно они бывают трех размеров: 7 мм, 14 мм и 28 мм. Вы можете сложить их вместе. 7 мм + 14 мм + 28 мм = 49 мм удлинитель.

работают за счет уменьшения диапазона фокусировки используемого объектива. Вы можете приблизить свои объекты к камере. Однако вы теряете возможность фокусировки на бесконечность.

Как перевернуть объектив

Другим экономичным вариантом является переворачивание линзы, которая у вас уже есть.Это может быть странно, но это работает хорошо. Снимите объектив и поверните его так, чтобы передний элемент объектива был направлен внутрь камеры. Теперь вы сможете очень внимательно сфокусироваться на предметах.

Имеются реверсивные кольца объектива, позволяющие присоединить крепление камеры к перевернутому объективу.

Что нужно знать об аберрациях и искажениях

Аберрации

Когда свет проходит через линзу, он сталкивается со стеклом внутри и преломляется.Не весь свет преломляется одинаково. Некоторые цвета затронуты больше, чем другие. Они могут быть связаны с незначительными дефектами, дифракцией или преломлением света.

Аберрации укладываются в два понятия. Те, которые работают с цветом (хроматические аберрации) и с отдельными точками света (монохроматические аберрации).

Кроме того, виньетирование означает, что яркость и насыщенность изображения уменьшаются к краям изображения.

Искажения

Каждый объектив имеет разную степень дисторсии.Как правило, вы найдете меньшее количество при использовании объективов с фиксированным фокусным расстоянием. Это связано с меньшим количеством элементов, необходимых для работы объектива.

Постоянное совершенствование технологий помогает свести искажения к минимуму. Объективы с наклоном и сдвигом также являются отличным решением этих проблем.

Существует два основных типа искажений. Бочкообразная дисторсия заставляет центр изображения казаться ближе, чем края. Подушкообразное искажение заставляет центр казаться намного дальше, чем края.

Широкоугольные объективы страдают дисторсией.Их широкое поле зрения должно поместиться на небольшой прямоугольной поверхности. Вы заметите, что центр кажется незатронутым. Но ожидайте, что прямые линии будут изгибаться, когда вы дойдете до краев кадра.

И если у вас есть смесь двух вышеупомянутых, вы получите искажение усов.

Что может повлиять на резкость?

Резкость имеет решающее значение, если вы хотите получать качественные фотографии. Вот почему важно знать, что и как может на это повлиять.

Центр Против.Кромки

Резкость ваших изображений зависит от того, насколько хорош ваш объектив. Кроме того, для оптимальной резкости необходимо правильно использовать объектив.

Объективы, как правило, более резкие в центре. Края и углы находятся дальше всего от сенсора и могут иметь некоторые потери. Более высокая резкость по краям часто проявляется в более дорогих объективах.

Диапазон увеличения

Одной из самых больших проблем с объективами с переменным фокусным расстоянием или зум-объективами является их диапазон резкости. В зум-объективе приходится искать компромисс между многими функциями, поэтому универсальность выдвигает резкость на первое место.

Не всегда понятно, где находится оптимальная резкость. Некоторые объективы имеют максимальную резкость в крайних точках своего диапазона. Другие объективы могут быть более резкими в центре диапазона. Есть несколько объективов, у которых самые острые области появляются и исчезают по всему диапазону фокусных расстояний. Чтобы узнать, делает это ваш объектив или нет, нужно привыкнуть к чтению кривых ЧКХ.

Диапазон диафрагмы

Еще одна важная вещь, которую вам нужно понять, это то, что кривая резкости объектива меняется в зависимости от диапазона диафрагмы.При съемке с открытой диафрагмы ваша зона фокусировки меньше.

Спуститесь на несколько остановок вниз, и вы заметите огромную разницу. После пика ваш объектив становится все менее и менее резким, но это постепенное изменение.

Здесь следует упомянуть и линзовую дифракцию. Меньшая апертура может вызвать его, в результате чего происходит потеря резкости, когда световые волны встречают на своем пути преграду, меняется их поведение. Это происходит, когда они попадают в маленькую дырочку. Отверстие преграждает им путь.

Специальные линзы

Помимо зум-объективов или объективов с фиксированным фокусным расстоянием, даже если выйти за рамки широкоугольных, стандартных или телеобъективов, есть и другие объективы, о которых нам нужно поговорить.

Эти специальные линзы были созданы по особым причинам.

Что такое объектив Tilt-Shift?

Объектив с наклоном и сдвигом — это объектив, созданный для имитации возможностей широкоформатной камеры.

Перспективное искажение создается из-за того, что большое здание находится на все большем расстоянии от вашей камеры. Верх дальше от вас, чем низ. Создается ошибка параллакса.

Эти линзы позволяют изменять фокальную плоскость в соответствии с относительным расстоянием здания от камеры.Этот переход от перпендикулярной фокальной плоскости к параллельной решает проблему.

Что такое объектив «рыбий глаз»?

«рыбий глаз» — это сверхширокоугольные объективы. Они попадают в категорию фокусных расстояний ниже 14 мм включительно. Эти линзы создают очень необычную перспективу в фотографии, обычно приводя к круглому изображению.

Когда мы используем линзы, вызывающие бочкообразную дисторсию, мы корректируем их, чтобы создать более реалистичное изображение. Мы принимаем искажения и используем их для создания чего-то творческого.Вы можете использовать их, например, для спортивных мероприятий, вечеринок или фотосъемки недвижимости.

Что нужно знать о макрообъективах

— это специальная стеклянная посуда, позволяющая снимать небольшие объекты и увеличивать их до невероятных размеров.

Макрообъективы — это телеобъективы, имеющие близкую ближнюю точку. Ближняя точка — это ближайшая к объективу точка, в которой объект находится в фокусе. Вот почему они могут фокусироваться от 1 см до бесконечности.

Эти объективы имеют свою цену, но, к счастью, их можно использовать не только для макросъемки.Они функционируют как стандартные линзы.

Заключение

Объективы для фотоаппаратов — неотъемлемая часть вашего снаряжения. Они также могут быть одними из самых дорогих. Стоит знать, какие объективы вам нужны и на какие особенности обратить внимание.

Иногда можно использовать фильтры или преобразователи, чтобы сэкономить деньги и сделать объектив более универсальным. Изучение нескольких приемов из нашего руководства по объективам окупится.

Отключите автоматический режим и делайте потрясающие фотографии на всю жизнь с нашим курсом «Фотография разблокирована»!