Разобрать по составу начнут: Начнут разбор слова по составу

Содержание

Ситуация на Украине и в Донбассе. 26 марта. Хроника событий

фото Константин Михальчевский. РИА /Новости

Вооруженные силы России продолжают проводить специальную военную операцию по защите ДНР и ЛНР. О событиях, произошедших сегодня вокруг Украины сообщает наш информационный партнёр «Российская газета».

____________________________________________________________________________________________________

20:50

В Одессе националисты заминировали и готовятся взорвать дамбу: районы затопит

Текст: Иван Петров

В Краматорске националисты из минометов обстреляли автомобиль, доставивший питьевую воду мирным жителям. Об этом в субботу рассказал начальник Национального центра управления обороной (НЦУО) РФ генерал-полковник Михаил Мизинцев. По его словам, 3 человека в итоге получили ранения, ещё двое были контужены. При этом обстрел цинично производился в момент раздачи воды местному населению, отметил генерал.

В то же время в Одессе по указанию областного губернатора была заминирована Хаджибейская дамба. В дальнейшем неонацисты планируют ее взорвать. «После реализации преступных действий в зоне затопления окажутся густонаселенные районы города вместе с горожанами. Попытка же представителя госслужбы Украины по чрезвычайным ситуациям предотвратить это безумное решение была грубо и жестко пресечена — вплоть до угрозы его расстрела», — рассказал начальник НЦУО.

Отмечается, что таким образом, киевская власть повсеместно демонстрирует «полное безразличие к собственному народу и готовность пожертвовать людьми в угоду реализации геополитических целей своих западных хозяев».

22:15

ДНР: Группировка ВСУ заблокирована на заводе «Азовсталь» в Мариуполе

Текст: Александр Саможнев

Группировка ВСУ заблокирована на заводе «Азовсталь» в Мариуполе, сообщил представитель Народной милиции Эдуард Басурин.

По его словам, украинские националисты выбиты из жилых кварталов и теперь сопротивляются на заводе «Азовсталь».

По оценкам военных, сложность заключается в том, что территория предприятия большая, в отдельных местах есть тайные ходы. Это позволяет неожиданно совершать нападения.

Ранее штаб территориальной обороны ДНР передал, что в субботу из Мариуполя были эвакуированы 183 человека, включая 50 детей.

19:39

Минобороны РФ показало, как работают наши саперы на Украине

Текст: Юрий Гаврилов

В субботу Минобороны РФ распространило видеокадры того, как российские саперы проводят разминирование дорог и местности в Херсонской области Украины.

Фото: РИА Новости

Военнослужащие инженерных подразделений продолжают гуманитарное разминирование Херсонской области

Автор: Минобороны РФ

Вообще без инженерной разведки не обходится ни одно передвижение наших войск и техники в ходе специальной военной операции, будь то передислокация, патрулирование, или движение гуманитарной колонны. Отступая, националисты и ВСУ очень часто минировали дороги. Вдоль трасс наши саперы ежедневно находят несколько установленных фугасов. Те, которые извлечь нельзя, уничтожают на месте.

На видео запечатлено, как извлекается из земли взрывное устройство, в основе которого танковый снаряд, обмотанный целлофановым пакетом с металлическим наполнителем внутри. Эти болты и металлические обрезки использованы в качестве поражающих элементов. Прежде чем обезвреживать фугас, сапер проверяет, нет ли под ним «сюрприза» в виде другого взрывного устройства. Мин-ловушек достаточно много. Но в это раз все чисто. Снаряд уносят подальше от дороги и уничтожают.

Самые сложные для работы саперов — так называемые «смешанные» поля. Там установлены вперемешку противотанковые и противопехотные мины. Безопасный проход в них обозначен черно-белой лентой, которую сапер тянет за собой.

Когда есть сомнения в безопасности находящейся впереди местности, первыми ее пересекают инженерные войска. Точнее говоря, туда высылают самоходную установку разминирования УР-77, больше известную в войсках, как «Горыныч». Она несет два мощных заряда, после выстрела которыми по минному полю взрывная волна уничтожает вокруг все мины. Так саперы создают проход для танков. Также было и во время наступления 24 февраля, когда показанный на видео экипаж УР-77 был в первых рядах наших войск.

Кроме боевых задач, инженерные подразделения решают в ходе спецоперации и другие, не менее важные. Например, в сюжете упоминается место, где всего в ста метрах от пропускного пункта «Каланчак» до недавнего времени стояла дамба. Несколько лет назад националисты возводили ее прямо на глазах у российских пограничников. Демонстративно строили и другое сооружение — отвод днепровской воды в море.

С началом военной операции воду в Крым снова вернули. Но перед этим все препятствия на ее пути устранили саперы 11-й отдельной гвардейской инженерной бригады Южного военного округа.

16:59

Полковник Росгвардии вывел из засады 100 бойцов

Текст: Михаил Фалалеев

В ходе специальной военной операции на Украине подразделение Росгвардии было внезапно атаковано из засады украинскими националистами. В бронетранспортер, где находился офицер Росгвардии полковник И. Масалов, попал выстрел из гранатомета, часть военнослужащих получила ранения, машина загорелась. Несмотря на полученную контузию, полковник организовал эвакуацию десанта и экипажа и продолжил руководить отражением нападения. Подавив несколько огневых точек противника, И. Масалов организовал перегруппировку своего подразделения и оказание помощи раненым.

Кстати, офицер под огнем националистов вернулся к горящей боевой машине за своим краповым беретом, который там остался при эвакуации. Забравшись в подбитый бронетранспортер, он нашел и сохранил символ доблести и чести спецназа Росгвардии. Благодаря смелым и решительным действиям полковника И. Масалова удалось организовать отпор противнику, вывести из-под огня около 100 бойцов, большое количество боевой техники и, оказав медицинскую помощь раненым, эвакуировать их в безопасное место.

В пресс-службе Росгвардии рассказали о многих героических поступках росгвардейцев. Так, полковник полиции Р. Тарасенко, командуя группой спецназа при форсировании реки, организовал штурм стратегически важного плацдарма. В ходе боя, вызвав на себя огонь основных сил противника, вскрыл систему огня на участке обороны и обеспечил возможность соседним подразделениям продвинуться на главном направлении наступления. Он корректировал огонь артиллерии, что позволило уничтожить бандгруппу националистов и арсенал вооружения.

Военнослужащий Росгвардии прапорщик Р. Галямов при штурме объектов, занятых националистическими бандгруппами, под непрерывным огнем противника первым перебрался на другой берег реки и, прикрывая перемещение сослуживцев, обеспечил возможность захвата плацдарма. Тяжело раненный, жертвуя собой, спецназовец до последнего держал оборону.

Росгвардейцы старший сержант Д. Дербинский, ефрейторы А. Данилов и Р. Алыкечев в течение суток удерживали тактически важный рубеж под непрекращающимся огнем противника. В ходе яростного боя спецназовцам удалось подавить огневые точки боевиков и отразить атаки неприятеля. В результате штурмовой отряд Росгвардии занял плацдарм.

Спецподразделение капитана Ю. Миланина на марше попало под обстрел националистов. Получив ранение, росгвардеец продолжил командовать подразделением, что позволило отразить атаку превосходящих сил противника. Указом Президента РФ за мужество и героизм, проявленные при исполнении воинского долга, капитан Ю. Миланин награжден медалью ордена «За заслуги перед Отечеством» II степени с мечами.

11:15

Британия зачищает следы: YouTube удалил канал пранкеров Вована и Лексуса

Текст: Александр Саможнев

Британцы зачищают следы беседы российских пранкеров Лексуса и Вована с министром обороны Великобритании Беном Уоллесом, в которой он раскрыл некоторые детали военной помощи Украине. По требованию британского минобороны Youtube удалил канал почти со 150 тысячами подписчиков, говорится в Telegram-канале пранкеров.

Однако британские власти не учли, что на платформе Rutube содержится полная коллекция записей пранкеров, включая и разговор с Уоллесом.

Напомним, пранкеры Владимир Кузнецов (Вован) и Алексей Столяров (Лексус) разыграли Уоллеса, позвонив ему от имени премьера Украины Дениса Шмыгаля. В ходе разговора обсуждался статус Украины в НАТО, поставки вооружений, участия иностранных наемников в боевых действиях на Украине, а также вероятность приобретения Киевом ядерного оружия.

Ранее, 15 марта, российские пранкеры от имени премьер-министра Украины Дениса Шмыгаля позвонили также глава МВД Британии Прити Пател. Полная версия разговора была опубликована 25 марта. В ходе разговора Пател заявила, что британские семьи «готовы принимать и всячески помогать украинским националистам и неонацистам».

14:07

Комплекс «Искандер» уничтожил позиции ЗРК «Бук» под Киевом

Текст: Александр Степанов

Комплекс «Искандер» уничтожил позиции украинского ЗРК «Бук» под Киевом

Автор: Минобороны РФ

В Киевской области ударом высокоточного ракетного оружия комплекса «Искандер» уничтожен зенитно-ракетного комплекса «Бук» ВСУ Украины. Кадры объективного контроля уничтожения военного объекта опубликовало Минобороны РФ.

Удар ракетой оперативно-тактического комплекса «Искандер» был нанесен после проведенной разведки, которая обнаружила позиции ЗРК «Бук». Контроль попадания осуществлялся российским беспилотником. Точным попаданием в цель комплекс был уничтожен.

В пригороде Киева сдались более 60 украинских военнослужащих

Текст: Иван Петров

В поселке Николаевка под Киевом российские военнослужащие взяли под контроль защищенный заглубленный командный пункт вооруженных сил Украины (ВСУ). Видеоподтверждение в субботу опубликовало Минобороны РФ.

Отмечается, что 61 украинский военнослужащий, служившие там, добровольно сдались в плен. Из них больше половины — старшие офицеры ВСУ.

По данным Минобороны России, украинские военнослужащие сложили оружие в связи с острой нехваткой материальных средств, боеприпасов и продуктов питания. Об этом они сами рассказали.

«Все сложившие оружие военные были эвакуированы из зоны боевых действий. При необходимости им была оказана медицинская помощь. Всех обеспечили продуктами питания», — говорится в сообщении военного ведомства.

12:43

Текст: Юрий Гаврилов

В субботу раненым военнослужащим, отличившимся в ходе специальной военной операции на Украине, вручили государственные награды. Ордена Мужества и медали «За отвагу» в общей сложности получили 17 солдат и офицеров.

Фото: РИА Новости

В филиале 3-го Центрального военного клинического госпиталя имени А.А. Вишневского награды мужественным военнослужащим прикрепил к груди заместитель министра обороны генерал-полковник Александр Фомин. Из его рук ордена Мужества получили 9 человек, чьи смелость и высокий профессионализм отмечены в Указе президента России. Замминистра поблагодарил этих людей за безукоризненное исполнение воинского долга и пожелал им скорейшего выздоровления.

А в Главном военном клиническом госпитале имени Н. Н. Бурденко церемонию награждения провел заместитель министра обороны генерал-полковник Юнус-Бек Евкуров. Шести военнослужащим он вручил ордена Мужества. Еще двум — медали «За отвагу».

В Минобороны РФ сообщили, что после выписки из госпиталей раненые участники специальной военной операции на Украине для полного восстановления здоровья пройдут медицинскую реабилитацию в ведомственных медцентрах и санаториях.

В эту программу включен весь арсенал современных методов лечебной физкультуры. В том числе, с использованием тренажеров с биологически обратной связью. А также курсы лечебной гимнастики и более 40 методов физиотерапии, мануальной и иглорефлексотерапии, остеопатии и различных видов массажа.

«Реабилитационные программы специалисты мультидисциплинарной команды врачей составляют индивидуально для каждого пациента», — подчеркнули в ведомстве.

10:54

МО показало залповый пуск ракет «Калибр» по украинским военным объектам

Текст: Александр Степанов

Запуск «Калибров» по объектам ВСУ из акватории Черного моря

Автор: Минобороны РФ

Видеокадры ракетного удара крылатыми ракетами «Калибр» морского базирования по объектам военной инфраструктуры Украины продемонстрировало минобороны РФ.

Залповый пуск четырьмя крылатыми ракетами «Калибр» произвел экипаж малого ракетного корабля из акватории Черного моря.

В результате точного попадания уничтожен арсенал с вооружением и военной техникой на территории Житомирской области.

10:38

Высокоточной ракетой «Оникс» уничтожена база горючего в районе Николаева

Текст: Александр Степанов

Вооруженные силы РФ уничтожили высокоточной крылатой ракетой «Оникс» базу горючего в районе города Николаев. Как сообщил официальный представитель Минобороны России генерал-майор Игорь Конашенков, с этой базы велось снабжение топливом украинской военной группировки в южной части Украины.

Он отметил, что за сутки авиация ВКС РФ уничтожила 117 военных объектов Украины, в том числе шесть командных пунктов, три установки РСЗО и ЗРК С-300.и

Кроме того, авиацией было поражено девять складов с вооружением и боеприпасами, два с ГСМ, а также 92 опорных пункта украинских подразделений и националистических батальонов.

10:30

МО РФ: Ракетами «Калибр» уничтожен склад с оружием и боеприпасами в Житомирской области

Текст: Александр Степанов

Высокоточные крылатые ракеты морского базирования «Калибр» уничтожили склад с боеприпасами и вооружением в районе поселка Великие Коровницы Житомирской области. Об этом сообщил официальный представитель Минобороны России генерал-майор Игорь Конашенков. По его словам, склад был уничтожен в течение дня 25 марта.

Конашенков отметил, что с начала проведения операции были уничтожены 267 беспилотников, 207 зенитных ракетных комплексов, 1618 танков и других боевых бронированных машин.

10:12

Шойгу призвал сохранить темпы поставок в войска перспективного вооружения

Текст: Александр Степанов

Учитывая проведение специальной военной операции на Украине, в 2022 году необходимо сохранить темпы поставки в войска перспективного вооружения. Об этом заявил министр обороны РФ Сергей Шойгу в ходе рабочего совещания с руководством Минобороны России.

Он подчеркнул, что эти поставки должны включать роботизированные комплексы, средств информационного обеспечения и радиоэлектронной борьбы. «Также, естественно, как это было всегда, материально-техническое обеспечение», — сказал Шойгу.

Министр отметил, что сейчас продолжается опережающая поставка вооружения и техники с применением кредитов, а приоритетами являются высокоточное оружие большой дальности, авиационная техника, а также поддержание боевой готовности стратегических ядерных сил. По словам Шойгу, несмотря на антироссийские санкции, уровень заключения госконтрактов составляет 85 процентов, гособоронзаказ выполняется в плановом порядке.

 10:09

Специальные корреспонденты «РГ» побывали на улицах Мариуполя

Текст: Руслан Мельников

На окраине Мариуполя на автостоянке супермаркета «Метро» начал действовать Центр помощи жителям города. Проезжаем мимо растянувшейся более чем на километр извилистый хвост очереди за гуманитаркой.

Сюда приходят люди из ближайших районов. Территорию контролируют ополченцы и возле суперпаркета относительно безопасно, хотя неподалеку часто ухают взрывы.

Углубляемся дальше в город. Шум боя здесь громче, взрывы раздаются совсем рядом. Иногда отчетливо слышится свист пролетающей мины и автоматные очереди.

— Здесь еще более-менее, — говорит сопровождающий нас ополченец Андрей. — А вот дальше по улице перекресток, к которому лучше не ходить. Там настоящая война.

Идем мимо разрушенных, сгоревших домов. Признаюсь, я даже не подозревал, что панельные многоэтажки могут так сильно гореть. На обочине — смятый, словно пластилиновый трактор, у поворота — изрешеченный троллейбус на спущенных колесах. Раздавленные легковушки, по которым проехалась тяжелая военная техника. Еще одна машина, заваленная обломками здания. Развороченные взрывной волной ворота церковной ограды. За ними — побитый взрывами и посеченный осколками храм.

фото: Владимир Аносов

Службы здесь сейчас не проводятся. Настоятель занят: помогает эвакуировать людей из города. Но мариупольцы все равно приходят в храм помолиться и обрести хоть какое-то утешение. Говорят, что только вера многим помогает сейчас выживать.

На церковном дворе — свежие могилки. Над некоторым — сбитые наспех кресты. Это захоронения погибших недавно горожан.

— Батюшка благословил не препятствовать, если кто-то здесь будет хоронить своих близких. Это люди из соседних домов. Правда, пока таблички и надписи не из чего сделать, — говорит Татьяна, живущая сейчас при храме.

Такие же захоронения есть и в жилых дворах. Особенно много свежих могилок появилось на бульваре Шевченко.

Идем дальше. Возле областной больницы интенсивного лечения собрались люди. Сюда тоже завозят гуманитарку и воду. Кроме того, в больнице остались несколько врачей и медсестер. В больнице снова начали принимать пациентов.

Корреспонденты «РГ» поговорили с жителями Мариуполя, пришедшими за гуманитарной помощью

Автор: Владимир Аносов

— Из Донецка привозят лекарства, мы оказываем посильную медпомощь, делаем операции, перевязки, принимаем роды, при необходимости проводим кесарево сечение. Работы очень много. Устаем, конечно, — говорит операционная сестра Анна. — Сейчас обращается много раненных, примерно по 30 человек в день. Осколочные ранения, травмы лица, оторванные конечности. Самое страшное, когда привозят маленьких детей с оторванными руками,

Заходим в больницу. Уже в фойе здесь лежат люди.

Ощущается запах смерти, который ни с чем не спутать. Да, трупов много. Их хоронят на больничном дворе, но всех — не успевают. Поднимаемся по лестнице. Вижу на ступеньках потеки крови, ведущие к дверям хирургического отделения. Кто-то ищет родственника, попавшего в больницу. Врач объясняет, что пациента на скорой вывезли в Донецк.

Сверху из больницы хорошо видны мариупольские кварталы. Над городом поднимается дым, гремят взрывы и трещат автоматные очереди. Часто чернеют пятна сгоревших многоэтажек. Нам советуют не стоять близко к окнам.

09:57

Вертолеты Ка-52 уничтожили командный пункт украинской армии ракетами «Вихрь»

Текст: Александр Степанов

Вертолеты Ка-52 армейской авиации ВКС России нанесли авиаудар противотанковой управляемой ракетой по командному пункту вооруженных сил Украины. Кадры уничтожения командного пункта опубликовало Минобороны РФ.

Вертолеты Ка-52 уничтожили командный пункт ВСУ ракетами «Вихрь»

Автор: Минобороны РФ

Военный объект был ликвидирован противотанковым ракетным комплексом «Вихрь». На кадрах видно, что атаку осуществляет звено вертолетов Ка-52, которое поддерживает наступающие войска. Командный пункт был уничтожен с режима висения, без входа в зону поражения ПВО противника с расстояния свыше 7 тысяч метров.

Вертолеты ВКС РФ в ходе специальной военной операции сопровождают военные колонны, уничтожают бронетехнику, доставляют десант, военные грузы. Кроме того, они оказывают авиационную поддержку подразделениям, выполняющим задачи в рамках спецоперации.

 07:30

Мурадов сообщил о новых военно-гражданских администрациях на юге Украины

На юге Украины начали формировать новые военно-гражданские администрации. Об этом РИА Новости рассказал постоянный представитель Крыма при президенте России Георгий Мурадов.

По его словам, в Херсонской области и на юге Запорожской области началась трансляция российских телевизионных каналов. Люди там все чаще используют российские рубли при расчетах. «Все это — шаги в верном направлении, ведь юго-восток Украины всегда являлся важной частью русской цивилизации, был Таврической губернией», — подчеркнул Мурадов.

Речь идет о населенных пунктах, которые под контролем российских военных. Среди них Мелитополь и Бердянск.

«Эти регионы всегда составляли единый хозяйственный комплекс с Крымом, который обеспечивал продовольствием прибывающих на полуостров туристов», — напомнил постпред президента.

Ранее сообщалось, что Крым и Донбасс связал сухопутный коридор. В рамках специальной военной операции под контроль была взята автомобильная дорога от Крыма до Мариуполя.

07:04

Украинские военные обстреляли из «Градов» Ясиноватую в ДНР

Украинские войска рано утром в субботу обстреляли из «Градов» Ясиноватую в Донецкой народной республике. В 5:55 по населенному пункту было выпущено 40 ракет.

В полночь подразделения ВСУ нанесли удары по Еленовке (8 снарядов). Обстрел велся из Новомихайловки.

Вечером 25 марта официальный представитель Народной милиции ДНР Эдуард Басурин заявил, что националисты продолжают методично бить по жилым кварталам и объектам гражданской инфраструктуры.

За сутки по территории ДНР было выпущено больше 200 снарядов и мин. Один мирный житель погиб, 23 человека пострадали. Повреждено 12 жилых домов и один объект инфраструктуры.

05:28

Посол Антонов: Россия делает все, чтобы пресечь военные преступления

Россия делает все, чтобы пресечь военные преступления на Украине.

«Специальная операция призвана положить конец геноциду мирного населения в ДНР и ЛНР, разоружить неонацистов», — напомнил посол РФ в Вашингтоне Анатолий Антонов. Он назвал неприемлемой циничную риторику заместителя госсекретаря США Виктории Нуланд о причастности России к гибели тысяч украинцев

«Вашингтону следовало бы предъявить счет себе за разрушенные города и десятки тысяч человеческих жизней, загубленных в Югославии, Афганистане, Ираке, Ливии и Сирии», — добавил дипломат.

00:01

В Минобороны РФ рассказали еще о трех героях спецоперации на Украине

Текст: Юрий Гаврилов

Стали известны фамилии еще трех офицеров, отличившихся в ходе специальной военной операции на Украине. Это два лейтенанта и полковник. Последний служит в военной полиции, а об ее участии в боевых действиях в Минобороны РФ прежде не рассказывали.

Чем же отличились эти военнослужащие при выполнении специальных задач? Танковый взвод лейтенанта Артема Гладского в составе батальонной тактической группы мотострелкового полка участвовал в боях за один из украинских военных аэродромов. В ходе наступления наши танкисты с ходу уничтожили блокпост противника и две его долговременные огневые точки, устроенные на подступах к летному полю. Однако затем попали под обстрел противотанковыми управляемыми ракетами.

Экипаж лейтенанта Гладского, умело маневрируя и уклоняясь от поражения, сумел выйти на огневые позиции противника и уничтожить три его танка, два БМП и большое количество украинских националистов. Развивая наступление, взвод офицера захватил плацдарм на западной окраине аэродрома и танковым огнем подавил обороняющегося противника. Эти действия обеспечили успешный проход на летное поле основных сил.

«Благодаря самоотверженности лейтенанта Артема Гладского и его грамотному руководству подчиненными экипажами, российской группировке удалось разгромить значительно превосходящие силы противника и обеспечить освобождение аэродрома от националистов», — отметили в Минобороны РФ.

А десантно-штурмовой взвод лейтенанта Расима Ильязова отличился во время удержания стратегически важного моста. Офицер умело организовал и руководил его обороной, передавал точные координаты противника нашим артиллерийским подразделениям и авиации. В результате было отражено 8 попыток националистов овладеть транспортным объектом.

Кроме того, подразделение Ильязова в боях уничтожило 12 танков, 8 боевых машин, одну гаубицу Д-30, вертолет Ми-8, две минометных батареи противника. А еще десантники захватили две гаубицы Д-30, которые потом использовали против ВСУ. Вражеские потери при этом составили около 500 человек. Противник, в том числе, потерял двух корректировщиков артиллерийского и минометного огня.

Начальник регионального управления военной полиции полковник Алексей Литвиненко участвует в специальной военной операции на Украине с ее первого дня. Офицер в том числе отвечает за безопасное движение колонн российской автомобильной и бронетанковой техники. Задача не просто сложная, но и опасная, поскольку на такие колонны постоянно пытаются напасть диверсионно-разведывательные группы украинских националистов

Несмотря на это, полковник в одну из ночей сумел развернуть на маршруте более десятка постов дорожно-комендантской службы и не допустил потерь среди личного состава.

В другой раз военные полицейские под руководством Литвиненко под огнем противника несколько дней охраняли мосты и отбивали атаки мобильных и хорошо вооруженных диверсионно-разведывательных групп противника. Еще полковник обеспечил безопасность более чем 300 автомобилей и российской бронетехники на маршрутах протяженностью более 100 км.

Колонны несколько раз пересекали реки, и умело организованное Литвиненко движение по мостам позволило избежать там заторов. Использовать их для атаки или обстрела наших военных противник не смог.

____________________________________________________________________________________________________

Российские моряки с судна Millenial Spirit вернулись с Украины в Россию

Текст: Михаил Фалалеев

Одиннадцать членов экипажа судна Millenial Spirit, которое в феврале было повреждено в нейтральных водах Черного моря около Одессы, вернулись в Россию. Как сообщило ТАСС, российские гражданские моряки были обменены на украинских гражданских моряков со спасательного судна «Сапфир».

С вернувшимися моряками в Москве встретилась уполномоченный по правам человека в РФ Татьяна Москалькова.

Выяснилось, что у семерых из них не оказалось по разным причинам никаких документов. Чтобы они смогли добраться домой, сотрудники ГУВМ МВД России и УВМ ГУ МВД России по Москве при содействии аппарата уполномоченного по правам человека экстренно выдали им временные удостоверения личности гражданина Российской Федерации.

В пресс-центре МВД России заверили, что по месту жительства территориальные органы МВД России окажут морякам содействие в выдаче им российских паспортов.

Напомним, в четверг стало известно, что между Россией и Украиной произошел обмен пленными — 10 удерживаемых на территории Украины российских военнослужащих обменяли на 10 украинских.

Мельбурн Сити — Веллингтон Феникс прогноз профессионала на матч 01.04.22

Футболисты клуба Мельбурн Сити пообещали 01.04.2022 на своем поле взять реванш у ФК Веллингтон Феникс за недавнее гостевое поражение со счетом 1-4. Организаторы данного турнира собираются начать поединок в 11:45 по Москве. В целом, футбольный клуб Мельбурн Сити является фаворитом, исходя из статистики предыдущих матчей, ведь имеет 35 побед в 59 встречах. Но, в последнее время хозяева не лучшим образом играют с данным соперником, потерпев два поражения в трех матчах и сыграв один раз вничью.

br>

Долгожданный футбольный матч, в котором соперниками будут команда Мельбурн Сити и Веллингтон Феникс, начнется уже совсем скоро. Естественно, наши прогнозисты не смогли оставить такое спортивное событие без внимания, поэтому решили предложить свое видение развития событий в этом матче. Учитывая все кадровые перестановки, которые произошли в клубах в межсезонье, а также учитывая результаты матчей первых туров, мы полагаем, что фаворитами в этом противостоянии должны быть хозяева поля. И здесь мы полностью согласны с теми коэффициентами, которые предлагают букмекеры. Команда Мельбурн Сити сейчас выглядит более сыгранной и более подготовленной, чем их соперники, тем более что команда Веллингтон Феникс прибыла на матч не в оптимальном составе. Так что, относительно победителя этого матча, то мы за хозяев поля. Учитывая, что в прошлом сезоне оба клуба действовали в атакующем стиле, и им удалось сохранить основной костяк исполнителей, и, самое главное – менеджеров, то в нынешнем сезоне команды тоже, скорее всего, будут играть в атакующий футбол. А это означает, что в сегодняшнем противостоянии мы увидим много атак, следовательно, будет много забитых голов, так что, общий тотал голов в этом матче мы советуем играть на больше. Неплохим предложением букмекеров нам видится ставка на то, что обе команды забьют в матче. Команда Мельбурн Сити и команда Веллингтон Феникс всегда славились мощным нападением и полузащитой, а вот в обороне редко когда играют без ошибок.

СТАВКИ/КОЭФФИЦИЕНТЫ БУКМЕКЕРСКИХ КОНТОР НА МАТЧ Мельбурн Сити — Веллингтон Феникс:

В случае выигрыша футбольного клуба Мельбурн Сити сыграет коэффициент 1.51, при победе ФК Веллингтон Феникс букмекеры выплатят выигрыш по ставкам на 5.6, а вероятность ничьи составляет 4.

Прогноз на матч Мельбурн Сити – Веллингтон Феникс (Чемпионат Австралии, матч национального перевентсва, воскресенье, 01.04.2022):Футбольный клуб Мельбурн Сити получил от букмекеров на свою победу котировку 1.51, а по коэффициенту 5.6 можно сделать ставку на выигрыш ФК Веллингтон Феникс. По котировке [kefdrew] принимаются ставки на ничью.

История личных встреч

Очень сложный матч предстоит сыграть футбольным клубам – команда Мельбурн Сити и команда Веллингтон Феникс – амбициозные соперники, которые в матчах с другими командами всегда считаются фаворитами, поэтому им трудно противостоять друг другу, так как считается, что этим матчем определяется лучшая команда чемпионата. Нет необходимости напоминать, что в составах обеих команд выступают известные футболисты, которые знамениты на весь мир. Учитывая, что ценники на футболистов в последнее время взлетели до небес, стоимость этих футболистов, выступающих в составе команды Мельбурн Сити и команды Веллингтон Феникс – просто сложно представить. Они не только на бумаге настоящие лидеры своих команд, но и на деле доказывают свою полезность, забивая важные мячи и участвуя в важнейших голевых комбинациях. Оба клуба можно рассматривать с точки зрения машин, где каждый футболист – механизм, отвечающий за работоспособность определенного участка. Поэтому эти команды крайне редко приобретают новых футболистов, а если это и происходит, то вводят их в основной состав постепенно. Так что не стоит удивляться тому, что в матче команды Мельбурн Сити и команды Веллингтон Феникс практически не будет новых лиц по сравнению с предыдущим сезоном. Однако сама игра от этого не станет менее зрелищной. Команда Мельбурн Сити и команда Веллингтон Феникс всегда стараются навязать свою игру сопернику все 90-то минут матча. За этим очень интересно наблюдать, но это очень сложно прогнозировать. Однако наши эксперты постарались, и ниже можно увидеть плоды наших трудов, и воспользоваться ими.

До 01.04.2022 еще много времени, но, несмотря на это, букмекерские конторы полным ходом ведут прием ставок на футбольный поединок Мельбурн Сити — Веллингтон Феникс. Тем, кто хочет сделать ставку на данный матч, необходимо это сделать до 11:45 по Москве. Исходя из статистики предыдущих встреч, фаворитом поединка считаются хозяева, которые одержали семь побед в последних пяти матчах, а проиграли только однажды. Причем, данное поражение было еще четырехлетней давности. В этом сезоне команды между собой еще не играли.

Предматчевый анализ и прогнозы букмекеров

Статистика – важнейший инструмент, который используют эксперты нашего ресурса при составлении прогнозов на футбольные матчи. В матче команды Мельбурн Сити и команды Веллингтон Феникс, который состоится в ближайшем туре чемпионата, мы тоже использовали статистику для составления интересных прогнозов. Пока, судя по тем результатам, которые команды демонстрируют в нынешнем сезоне, складывается впечатление, что руководство клубов поставило перед ними серьезные задачи. Оба клуба играют в атакующем стиле, что подразумевает большое количество ударов по воротам соперника. Вообще, игра команд в нынешнем сезоне полностью заточена под атаку, что можно увидеть, взглянув на составы команд. Менеджеры сделали ставку не только на мощное нападение, но и на полузащиту, футболисты полузащиты активно подключаются к атакам команды и забивают не меньше нападающих. При этом серьезное внимание было уделено и построению хорошей обороны, которая во многих матчах сезона выглядит надежно и неприступно. В общем, сегодня команда Мельбурн Сити и команда Веллингтон Феникс представляют собой крепкие орешки, которые могут испортить нервы любому клубу. Между собой эти команды всегда играют результативно. С первых и до последних минут матча клубы атакуют ворота друг друга, стараясь забить как можно больше мячей. Сейчас борьба в турнирной таблице обострена до предела, и чтобы занимать достойное место, командам необходимо показывать, в первую очередь, результат. Поэтому, по словам менеджеров клуба, в ближайшем матче их подопечные будут играть только на победу, следовательно, болельщиков ждет интересное противостояние.

В линии букмекерских контор, по мнению экспертов нашего ресурса, верно отражены шансы команды Мельбурн Сити и команды Веллингтон Феникс на успех в очном противостоянии. Напомним, что эти команды встретятся в рамках очередного тура чемпионата, где будут определять сильнейшего. К этому матчу хозяева поля подходят в отличном настроении, у клуба нет серьезных кадровых потерь перед матчем, а статистика последних игр говорит о том, что команда Мельбурн Сити находится в прекрасной форме. Гости тоже показали хорошие результаты в последних матчах. Клуб добился важных побед, что позволило ему улучшить свои позиции в турнирной таблице. Однако для команды Веллингтон Феникс выездные матчи в нынешнем сезоне складываются не так хорошо, как игры на родном стадионе. В выездных матчах, по словам самих футболистов команды Веллингтон Феникс, они чувствуют себя не так уверенно, как в домашних стенах. Поэтому, сегодня наши эксперты рекомендуют ставить на победу команды Мельбурн Сити, так как хозяева поля сейчас находятся в отличной форме, а родные трибуны должны помочь клубу продемонстрировать отличный футбол и добиться победы. Общий тотал матча мы рекомендуем играть на больше, так как оба клуба действуют в атакующем стиле, поэтому в этом матче мы ждем много голов. Общий тотал нарушений и желтых карточек тоже следует играть на больше, так как эта встреча является принципиальной для обеих команд, следовательно, футболисты будут часто нарушать правила. А вот угловые мы рассматриваем на меньше, так как команда Мельбурн Сити и команда Веллингтон Феникс не так часто задействуют фланги при атаках.

Мельбурн Сити

В прошлом сезоне футбольный клуб Мельбурн Сити неожиданно финишировал в зоне Лиги Чемпионов, но оказалось, что успехи команды были кратковременными. Это связано с тем, что руководство не захотело усиливать состав в преддверии более сложного сезона, а наоборот, отпустило некоторых ключевых игроков. В итоге, хозяева сейчас идут только восьмыми в турнирной таблице, и снова пробиться в Лигу Чемпионов вряд ли получится, так как от нее отставание составляет уже двенадцать очков. Для футбольного клуба Мельбурн Сити сейчас приоритетная задача хотя бы пробиться в Лигу Европы, от которой хозяева отстают только на два очка. Хотя дома команда играет лучше, чем в гостях, все равно нет уверенной игры в родных стенах, так что получилось выиграть менее половины домашних матчей. Если в прошлом месяце футбольный клуб Мельбурн Сити выиграл все четыре тура, то в этом месяце начался спад, ведь была только одна победа при двух поражениях. Дисквалификацию отбывает правый защитник, а травмированы в составе гостей левый и двое центральных полузащитников.

Веллингтон Феникс

В этом сезоне футболисты клуба Веллингтон Феникс сильно разочаровывают своих болельщиков, ведь если раньше команда была постоянным участником еврокубков, то в данный момент она пребывает в нижней части турнирной таблицы, занимая только тринадцатую строчку. Футбольный клуб Веллингтон Феникс много проигрывает не только на выезде, но и в родных стенах, а проблемы гостей заключаются в слабой обороне, которая практически в каждом матче пропускает по два гола. За команду играет один из лучших нападающих чемпионата, за которым охотятся местные гранды, но даже его двадцать забитых голов не помогают футбольному клубу Веллингтон Феникс подняться выше в турнирной таблице. Уже второй месяц команда находится в кризисе, так как на протяжении девяти туров не может выиграть. В этой безвыигрышной серии было пять поражений и четыре ничейных результата. Президент уже заявил главному тренеру, что если и в этом поединке футбольный клуб Веллингтон Феникс не сможет одержать победу, то ему грозит отставка. В составе гостей на поле не выйдут травмированные центральный и опорный полузащитники.

Наши эксперты полагают, что букмекеры выставили несколько завышенные коэффициенты на победу команды Веллингтон Феникс в матче с футболистами команды Мельбурн Сити. Хозяева поля уже решили все свои задачи в чемпионате. Несмотря на то, что у клуба есть неплохие шансы, чтобы занять высокое место в турнирной таблице, которое позволит ему выступать в престижном клубном турнире в будущем сезоне, президент клуба заявил, что у команды нет средств, чтобы разрываться на два турнира, да и с составом у хозяев поля намечаются определенные проблемы, так как уже летом клуб планирует продать ряд футболистов. В связи с этим, в следующих матчах, скорее всего, менеджер будет наигрывать молодежь, чтобы определиться с составом на будущий сезон. А вот у гостей полный порядок и с финансированием, и со скамейкой. В составе команды выступают высококлассные футболисты, и не менее высококлассные игроки могут усилить игру в любой момент со скамейки запасных. Из-за того, что клуб неудачно начал чемпионат, он пока не занял достойного места, гарантирующего участие в престижном клубном турнире. Глядя на календарь матчей команды Веллингтон Феникс, можно утверждать, что со своими соперниками команда должна разбираться без особых проблем. Исходя из этого, мы рекомендуем делать ставки на то, что команда Веллингтон Феникс победит в этом противостоянии. Также в этом матче мы ждем большого количества забитых мячей, так как оба клуба играют в атакующий футбол, поэтому вряд ли будут отсиживаться в обороне, а с первых минут начнут атаковать ворота друг друга. Общий тотал желтых карточек выставлен правильно, поэтому мы рекомендуем не делать ставок в этом направлении.

Игра закончится победой Мельбурн Сити — 1.51, нет победителей в игре — 4, игра закончится победой Веллингтон Феникс — 5.6.

Букмекеры полагают, что команда Мельбурн Сити и команда Веллингтон Феникс в очном противостоянии, которое состоится в ближайшем туре чемпионата, сыграют вничью. Скорее всего, это мнение букмекеров основано на том, что в турнирной таблице клубы уже решили свои задачи, следовательно, могут просто поделиться очками без ущерба для турнирного положения друг друга. Наши эксперты, тщательно изучив статистические данные матча, пришли к выводу, что соперники вполне способны на то, чтобы разделить очки. Напомним, что команды поддерживают неплохие отношения, а в чемпионате довольно часто расходятся миром. Естественно, мы призываем не выдумывать велосипед, а делать ставки на наиболее вероятный результат в этом матче – а это ничья. Да, коэффициент слегка маловат, однако эта ставка надежная. Общий тотал забитых мячей – темный лес, команды редко забивают много, да еще и в матчах, результат которых не принципиален, поэтому, рискнем здесь предположить, что команды разойдутся миром со счетом 1:1, то есть, можно делать ставки на то, что оба клуба забьют в этом матче. Общий тотал угловых мы рекомендуем играть на меньше, так как команда Мельбурн Сити и команда Веллингтон Феникс не являются рекордсменами чемпионата по количеству угловых, да и в матчах между собой подают много угловых редко. Нарушения правил и желтые карточки, непременно, в этом противостоянии будут, однако, смогут команды пробить заявленные тоталы или нет – предположить сложно, поэтому от этих ставок мы рекомендуем воздержаться.

«Мельбурн Сити»

Еще недавно футбольный клуб Мельбурн Сити находился на последнем месте в чемпионате, и не было никаких надежд, что удастся спастись от вылета. Но, после того как поменялся главный тренер, игра аутсайдера намного улучшилась, так что в пяти турах под его руководством было лишь одно поражение, причем от представителя ТОП-5 чемпионата, а в остальных матчах хозяева одержали две победы над более сильными соперниками и дважды сыграли вничью. Это позволило подняться с последнего места и футбольный клуб Мельбурн Сити даже покинул зону вылета, но остальных аутсайдеров команда опережает исключительно за счет лучшей разницы по забитым и пропущенным мячам. Главное, чтобы эффект от смены наставника продержался как можно дольше, тогда хозяева смогут набрать больше очков и отдалиться от опасной зоны. Но, даже, несмотря на то, что форма футбольного клуба Мельбурн Сити улучшилась, он все равно остается самой малозабивающей командой в чемпионате.

«Веллингтон Феникс»

В этом сезоне футбольный клуб Веллингтон Феникс показывает намного лучшую игру, чем в прошлые годы, но все равно команда не может вести борьбу за чемпионский титул. Правда, гости и так идут вторыми в чемпионате, что уже является существенным прогрессом, ведь болельщики уже начали забывать, когда их команда занимала такую высокую позицию. Отставание от лидера слишком большое, так что шансы догнать его лишь теоретические. Тем более, что футбольный клуб Веллингтон Феникс периодически также допускает потери очков, а значит воспользоваться ошибками фаворита вряд ли получится. Игра на выезде уступает домашним результатам, ведь хуже игра в обороне, да и нападение в гостевых поединках действует не настолько результативно. В последних пяти турах гости одержали четыре сухих победы, но и уступили на выезде 2-0 команде с пятой строчки. Серьезных кадровых потерь у футбольного клуба Веллингтон Феникс нет, ведь хоть и травмированы три полузащитника и один защитник, хорошая глубина состава позволит найти им достойную замену.

Статистика и личные встречи

Наши эксперты постоянно мониторят линии букмекерских контор в поисках интересных матчей. Если рассматривать футбольные матчи с практической точки зрения, то составить прогноз можно на любой футбольный матч, независимо от того, к какому чемпиону он относится. Это может быть даже самая неизвестная лига третьесортного чемпионата. Однако наши эксперты занимаются тем, что прогнозируют исходы и статистику тех футбольных матчей, смотреть которые предпочитают все любители футбола. Матчи топ-чемпионатов, которые собирают целые стадионы преданных болельщиков, а также многомиллионную армию болельщиков у экранов телевизоров – вот настоящая страсть наших экспертов. Нельзя сказать, что прогнозировать легко – нет, это тяжелый труд, требующий концентрации и тщательно анализа многочисленных факторов, которые могут оказать влияние на результат матча, однако нам нравится заниматься своим делом и делиться своими трудами с любителями футбола. Сегодня мы решили разобрать матч, соперниками в котором будут команда Мельбурн Сити и команда Веллингтон Феникс. Для обеих команд результат матча чрезвычайно важен, поэтому команды будут играть на встречных курсах, тем более что защита – не самая сильная сторона обеих команд. В текущем сезоне оба клуба сыграли большинство своих матчей на тотал больше, поэтому вряд ли в принципиальной игре они станут использовать защитную тактику, скорее всего, тренеры вновь будут играть в атакующий футбол, поэтому болельщиков ждет большое количество забитых мячей.

Мельбурн Сити — Веллингтон Феникс. Прогноз на футбол (01.04.22)

Эксперты нашего портала и аналитики букмекерских контор сошлись во мнении относительно того, кто должен быть фаворитам футбольного матча между футболистами команды Мельбурн Сити и футболистами команды Веллингтон Феникс. Сейчас, когда чемпионат подходит к концу, хозяевам поля необходимо побеждать, чтобы оставаться в числе клубов, претендующих на высокие места чемпионата. А вот гости уже свою задачу в нынешнем сезоне выполнили, клуб хоть и находится во второй части турнирной таблицы, однако уже гарантировал себе участие в чемпионате на будущий сезон, так что, менеджер команды Веллингтон Феникс может позволить себе дать отдых ведущим футболистам команды. А вот хозяевам поля придется играть сильнейшим составом, так как клуб не может позволить себе отступить. Из этого получается, что сегодня команда Мельбурн Сити не просто победит, но и сделает это крупно, следовательно, стоит пробовать заигрывать фору хозяев поля. Общий тотал матча наши эксперты видят на больше, так как хозяева имеют великолепных футболистов атаки, которые с первых минут будут беспокоить оборону соперника, прибывшего на матч в ослабленном составе. Так что, и общий, и индивидуальный тотал команды Мельбурн Сити в этом матче мы рекомендуем играть на больше. Вряд ли в матче будет много нарушений, так как уже в принципе понятно, кто победит, так что, футболисты не будут лишний раз наносить друг другу травмы. Исходя из этого, общий тотал фолов и желтых карточек мы рекомендуем играть на меньше. А вот угловых в матче мы видим много, так как оба клуба вряд ли будут играть в защитный футбол, а при атаке и команда Мельбурн Сити, и команда Веллингтон Феникс активно использует фланги, поэтому тотал угловых, скорее всего, перебьют.

Футбольные матчи издавна притягивали не только любителей наблюдать за этим великолепным действием, но и любителей легкой наживы. Сегодня букмекерские конторы открывают новые офисы и представительства буквально ежедневно. Они стараются заманить новых клиентов, предлагая разнообразный выбор ставок, среди которых ставки не только до, но и во время матча. Букмекеры становятся спонсорами отдельных футбольных клубов, чтобы иметь возможность предлагать только свои ставки на стадионе этого клуба. В общем, теперь спорт и букмекерские конторы стали неразлучными понятиями, которые идут рука об руку. Однако наши эксперты полагают, что хватит кормить букмекеров, хватит делать ставки ради развлечения, необходимо серьезно наказывать букмекеров за их просчеты. Именно поэтому мы делимся с бетторами своими прогнозами на футбол. В основном это прогнозы на статистику, реже прогнозы на исходы. Мы профессионально анализируем свои ставки, стараясь предложить бетторам только лучшие, вероятность проходимости которых очень велика. Наши эксперты постоянно мониторят линии букмекеров в поисках отличных ставок, чтобы бетторы могли наслаждаться футболом и выигрывать деньги.

Ведущие отечественные прогнозисты в футбольном матче Мельбурн Сити — Веллингтон Феникс ожидают доминирования гостей, из-за чего настроены поставить на их победу по угловым ударам.

Мельбурн Сити – Веллингтон Феникс: статистика и история личных встреч

Наши эксперты всегда стараются выбирать наиболее интересные с точки зрения зрелищности футбольные матчи для прогнозирования. В ближайшее время состоится матч между двумя футбольными клубами, которые показывают прекрасные результаты в нынешнем сезоне. Команда Мельбурн Сити и команда Веллингтон Феникс являются непримиримыми соперниками уже довольно длительное время. Вместе с этим, эти футбольные коллективы показывают просто потрясающий футбол в личных встречах. Матчи между этими футбольными клубами запоминаются надолго, так как футболисты играют с полной самоотдачей, старясь продемонстрировать максимум своих возможностей. Менеджеры команды тоже готовят сюрпризы друг другу, используя необычную тактику. В общем, на футбольном поле происходит настоящее шоу, от которого болельщики пребывают в неописуемом восторге. Чего-то подобного мы ждем и в этом матче. По словам менеджеров команд, все ключевые футболисты готовы принять участие в матче с первых минут встречи. Это означает, что сегодня болельщиков ждет непредсказуемая игра, так как лидеры команд могут придумать нестандартное решение в любой игровой ситуации. Наши эксперты приготовили прогнозы на этот матч, с ними можно детально ознакомиться ниже. Мы рекомендуем делать ставки на это противостояние не только до матча, но и во время игры, так как, возможно, букмекеры сделают неплохое предложение по высокому коэффициенту.

http://evolvegame.ru/cat0-541630-kerns-taypans-melburn-feniks-prognoz-i-stavki-ot-specialista-na-basketbol-25-03-22/

Морфологический разбор глагола «начнут» онлайн. План разбора.

Для слова «начнут» найден 1 вариант морфологического разбора

  1. Часть речи. Общее значение
    Часть речи слова «начнут» — глагол
  2. Морфологические признаки.
    1. начать (инфинитив)
    2. Постоянные признаки:
      • 1-е спряжение
      • переходный
      • совершенный вид
      Непостоянные признаки:
      • изъявительное наклонение
      • множественное число
      • будущее время
      • 3-е лицо.
  3. Дети будут в толпе крестьянских детей приучаться жить в обществе человеческом, начнут понимать, что такое жизнь.

    Выполняет роль сказуемого.

Поделитесь страницей с друзьями — это

лучшая благодарность

Морфологический разбор другого слова

План разбора глагола

  1. Часть речи. Общее значение
  2. Морфологические признаки.
    1. Начальная форма (инфинитив)
    2. Постоянные признаки:
      • Вид (совершенный (что сделать?) или несовершенный (что делать?)
      • переходный (употребляется с сущeствительным в винительном падеже без предлога)/ непереходный (не употребляется с существительным в винительном падеже без предлога).
      • Спряжение
      Непостоянные признаки:
      • Наклонение в зависимости от вопроса:
        • Изъявительное — что делал? что делает? что сделает?
        • Повелительное — что делай?
        • условное — что делал бы? что сделал бы?
      • Число
      • Время (если есть)
      • Лицо (если есть)
      • Род (если есть)
  3. Синтаксическая роль (подчеркнуть как член предложения, является главным или второстепенным членом предложения)

Поделитесь страницей с друзьями — это

лучшая благодарность

Оцени материал

12 голосов, оценка 4.333 из 5

План разбора составлен на основе общих правил, в зависимости от класса и предпочтений учителя ответ может отличаться. Если ваш план разбора отличается от представленного, просто сопоставьте его с данными нашего ответа.

Если морфологический разбор глагола «начнут» имеет несколько вариантов, то выберите наиболее подходящий вариант разбора исходя из контекста предложения.

 Разборы производились исходя из заложенного программного алгоритма, результаты в редких случаях могут быть недостоверны, если вы нашли несоответствие пожалуйста сообщите нам. Представленный результат используется вами на свой страх и риск.

границ | Фитохром А опосредует разборку перерабатывающих органов в дальнем красном свете

Введение

На протяжении всего своего жизненного цикла растения подвержены постоянно меняющимся условиям окружающей среды в том месте, где они проросли. Чтобы справиться с колебаниями в окружающей среде, растения воспринимают и интегрируют сигналы окружающей среды и реагируют с высоким уровнем пластичности, чтобы соответствующим образом адаптировать свой рост и развитие (Chevin and Lande, 2015). Эта интеграция происходит на разных уровнях, включая экспрессию генов (Peschke and Kretsch, 2011), трансляцию и деградацию белков (Wu et al., 2019), а также модификации механических свойств клеточных стенок (Falcioni et al., 2020). Сигналы окружающей среды могут быстро меняться, поэтому время реакции является критическим фактором. Механизм преодоления потребности в синтезе мРНК перед трансляцией белка заключается в хранении мРНК в трансляционно неактивном состоянии (Merchante et al., 2017). Формирование и разборка процессирующих телец (p-тел), подкласса РНК-гранул, представляет собой механизм хранения мРНК с остановленной трансляцией и высвобождения их в ответ на определенные условия, который недавно привлек внимание в различных модельных организмах и контекстах (Decker и Паркер, 2012 г., Wang et al., 2018; Джанг и др., 2019).

Гранулы

РНК представляют собой цитоплазматические немембранные органеллы, образованные путем фазового разделения (Sachdev et al., 2019). Их можно условно разделить на стрессовые гранулы, p-тела и нейрональные гранулы (Anderson and Kedersha, 2006). Насколько нам известно, первое морфологическое описание гранул РНК относится к 1865 г. (Mecznikoff, 1865), хотя их состав и функция оставались неизвестными. Позже были охарактеризованы p-тела дрожжей, и было показано, что они состоят в основном из РНК и белков, предположительно участвующих в деградации мРНК (Sheth and Parker, 2003; Parker and Sheth, 2007).Эксперименты также показали, что в p-телах растений в основном присутствуют белки, разрушающие мРНК, что указывает на консервативную роль во всем типе эукариот (Maldonado-Bonilla, 2014).

Новаторская работа Hubstenberger et al. (2017) имело особое значение для понимания белкового состава р-тел. Все больше данных свидетельствуют о том, что первичная роль p-тел заключается в хранении остановленных мРНК. P-тела могут быть разобраны под действием различных стимулов, высвобождая эти остановленные мРНК и обеспечивая трансляцию транскриптов, изначально хранившихся в p-телах (Brengues et al., 2005; Айзер и др., 2014; Хабстенбергер и др., 2017). Это обеспечивает кратчайший путь для быстрых изменений протеома в ответ на сигналы окружающей среды, избегая необходимости транскрипции, сплайсинга, экспорта и созревания мРНК de novo . У растений эта разборка, вызванная стимулом, играет роль в процессах развития и адаптации к окружающей среде. Было показано, что условия освещения, которым подвергаются растения, определяют количество и размер р-тел и, таким образом, высвобождение мРНК для трансляции, включая GUN5 и OE33 (Jang et al., 2019). Белки, кодируемые этими мРНК, имеют отношение к созданию полностью развитых хлоропластов и помогают растениям адаптироваться к свету.

Свет — один из важнейших факторов, определяющих жизнь растения (Paik, Huq, 2019). Чтобы получать информацию об условиях освещения в окружающей среде, растения развили набор фоторецепторов, которые контролируют световой спектр от УФ-В до дальнего красного (FR) света. Фитохромы опосредуют передачу световых сигналов в красном (R) и FR диапазоне светового спектра (Legris et al., 2019). Они синтезируются в неактивной форме Pr и могут преобразовываться в активную форму Pfr при поглощении света. Pfr может превращаться в Pr либо при поглощении света, либо в результате термической релаксации (Klose et al., 2015a). Такое поведение образует молекулярный тумблер, позволяющий фитохромам определять соотношение R:FR в окружающей среде. PhyB играет доминирующую роль в R-свете, тогда как phyA является единственным фоторецептором в Arabidopsis thaliana , который опосредует ответы на FR-свет.Фотоактивированные фитохромы перемещаются в ядро, где они взаимодействуют с множеством сигнальных компонентов, чтобы контролировать экспрессию генов (Legris et al., 2019). Канонический, хорошо изученный путь передачи сигналов фитохрома зависит от PHYTOCHROME INTERACTING FACTORs (PIFs), набора транскрипционных факторов bHLH. При связывании PIF с фитохромами в ядре ДНК-связывающая активность PIF подавляется (Legris et al., 2019). Другим ключевым компонентом передачи сигналов фитохрома является комплекс CONSTITUTIVELY PHOTOMORPHOGENIC 1/SUPPRESSOR OF PHYA-105 (COP1/SPA), который нацелен на положительные факторы фотоморфогенеза, такие как ELONGATED HYPOCOTYL 5 (HY5), для деградации в темноте.Этот комплекс реорганизуется и инактивируется при связывании фотоактивированных фитохромов, позволяя накапливаться положительным факторам фотоморфогенеза (Sheerin, Hiltbrunner, 2017). Джанг и др. (2019) показали, что мутант hy2 неспособен реагировать на белый свет уменьшением числа р-тел. У этого мутанта дефицит синтеза фитохромомобилина и, следовательно, отсутствуют фотоактивные фитохромы (Kohchi et al., 2001). Кроме того, было показано, что мутация в COP1 , cop1-6 приводит к уменьшению количества р-тел в темноте.Это согласуется со светонезависимой активацией передачи световых сигналов у мутанта cop1-6 (Ma et al., 2002). Эти результаты указывают на участие сигнальной системы фитохромов в разборке р-тел в ответ на свет. Тем не менее, зависимость разборки p-тела от длины волны и скорости потока энергии не исследована, и до сих пор неизвестно, какие конкретные фитохромы участвуют в этом процессе.

В нашей недавней работе мы описали NOT9B как локализованный белок р-тела.NOT9B является частью комплекса CCR4-NOT, многобелкового комплекса, локализованного в p-тельцах и ядре (Maldonado-Bonilla, 2014; Collart, 2016). Этот комплекс выполняет множество различных функций в растениях и в последние годы привлек внимание в науке о растениях. Лишь недавно было показано, что комплекс как таковой существует у растений (Arae et al., 2019; Zhou et al., 2020; Schwenk et al., 2021). Компоненты комплекса были описаны как регуляторы транскрипции и интеграторы стрессов окружающей среды (Liang et al., 2009; Уолли и др., 2010 г.; Судзуки и др., 2015). Здесь мы использовали YFP-меченый NOT9B в качестве маркера p-тел для дальнейшего изучения роли передачи световых сигналов в разборке p-тел. Мы определили основные физиологические параметры, контролирующие этот процесс, такие как интенсивность и качество света. Разборка P-тела в различных мутантных и трансгенных фонах была проанализирована для оценки зависимости этого процесса от фоторецепторов.

Результаты

Свет различных длин волн вызывает разборку p-тела

Как показали Jang et al.(2019), длительное воздействие белого света вызывает уменьшение количества р-телец в семядолях. Чтобы дополнительно исследовать этот эффект, мы провели аналогичные эксперименты с использованием линий Arabidopsis thaliana , стабильно экспрессирующих локализованный в p-теле белок NOT9B, слитый на N-конце с HA-YFP. Мы обнаружили, что 4-часовое воздействие FR или R-света уменьшало количество р-тел в клетках эпидермиса гипокотиля (рис. 1А). Этот эффект не зависит от ткани, поскольку мы также наблюдали зависящее от FR уменьшение количества p-тел в корнях и семядолях трансгенной линии HA-YFP-NOT9B (рис. 1B, C).Воздействие FR света на p-тела, возможно, не зависит от фотосинтеза и энергетического статуса, так как FR свет слабо фотосинтетически активен. Поддерживая это мнение, мы обнаружили, что добавление сахарозы в среду роста не оказывает никакого влияния на количество р-тел (дополнительная фигура 1). Чтобы исследовать возможность того, что свет влияет на уровень белка NOT9B, мы проанализировали стабильность HA-YFP-NOT9B в R- и FR-свете с помощью вестерн-блоттинга. На количество NOT9B не влияют или лишь незначительно влияют световые процедуры, вызывающие разборку p-тела.Различия в уровнях HA-YFP-NOT9B не превышали 30%, и не было тенденции к более низким уровням после более длительного воздействия света (дополнительная фигура 2). Следовательно, более низкое содержание p-тел на свету нельзя объяснить сниженным уровнем HA-YFP-NOT9B (рис. 1D).

Рисунок 1. Различные длины волн запускают разборку p-тела. (A–C) HA-YFP-NOT9B меченые p-тела в разных условиях освещения в разных тканях. Проростки, экспрессирующие p35S:HA-YFP-NOT9B , выращивали в течение 4 дней в темноте, а затем в течение 4 ч при освещении указанного качества при плотности потока энергии 40 мкмоль·м –2 с –1 (FR) или 20 мкмоль м –2 с –1 (R).Проростки фотографировали и оценивали 15 снимков. Показан один репрезентативный эксперимент из трех независимых экспериментов. Отображаются репрезентативные изображения микроскопа для каждого лечения. Разные буквы обозначают значительные различия между группами, определенные с помощью однофакторного дисперсионного анализа, за которым следует HSD Тьюки. Р < 0,05. Масштабная линейка представляет 10 мкм. Количество р-тел количественно определяли в (А) клетках эпидермиса гипокотиля, (В) клетках мезофилла семядолей и (С) клетках эпидермиса корня. (D) Уровни белка HA-YFP-NOT9B остаются постоянными при обработке светом. 4-дневные темновыращенные проростки, экспрессирующие HA-YFP-NOT9B, обрабатывали светом (40 мкмоль м –2 с –1 FR или 20 мкмоль м –2 с –1 R) для указанное время. Общий белок экстрагировали и анализировали вестерн-блоттингом; HA-YFP-NOT9B выявляли с использованием антител αHA; мембрана, окрашенная Amido Black, показана в качестве контроля загрузки.

Используя другой маркер р-тела, DCP1-CFP, мы также наблюдали уменьшение числа р-тел в ответ на свет FR, аналогичное р-телам, меченным HA-YFP-NOT9B.Это указывает на то, что свет специально не вызывает исключение HA-YFP-NOT9B из p-тел, а скорее способствует общей разборке p-тел (дополнительная фигура 3).

Разборка P-тела в дальнем красном и красном свете зависит от фитохрома A и B соответственно

До сих пор было неясно, какой фоторецептор опосредует разборку p-тел в ответ на разные качества света. Мы скрестили экспрессирующую линию HA-YFP-NOT9B с мутантами phyA-211 , phyB-9 и phyA-211 phyB-9 и количественно определили снижение числа p-тел в ответ на R и FR свет.Уменьшение числа p-тел в ответ на R-свет зависело от phyB, тогда как уменьшение количества FR-света требовало phyA. Двойной мутант phyA-211 phyB-9 не был способен реагировать ни на одно из этих световых качеств с точки зрения уменьшения числа p-тел (рис. 2A–C). Такое поведение соответствует канонической функции phyA и phyB как первичных рецепторов FR и R света соответственно.

Рис. 2. R и FR вызванное светом снижение количества р-тел зависит от фитохромов. (A–C) p35S:HA-YFP-NOT9B , экспрессирующие проростки на указанном генетическом фоне, выращивали в течение 4 дней в темноте. Численность p-тел определяли перед воздействием света (A) или после 4-часового воздействия света FR (B) или R (C) . Интенсивность света была установлена ​​​​на плотность потока 40 мкмоль м -2 с -1 (FR) или 20 мкмоль м -2 с -1 (R). Сфотографировали клетки эпидермиса гипокотилей проростков и оценили 15 изображений.Показан один репрезентативный эксперимент из трех независимых экспериментов. Отображаются репрезентативные изображения микроскопа для каждого лечения. Разные буквы обозначают значительные различия между группами, определенные с помощью однофакторного дисперсионного анализа, за которым следует HSD Тьюки. Р < 0,05. Масштабная линейка представляет 10 мкм.

NOT9B напрямую взаимодействует с phyA, что повышает вероятность того, что phyA-индуцированная разборка p-тел зависит от этого взаимодействия. Поэтому мы воспользовались преимуществом точечного мутанта NOT9B, NOT9B ΔPNB, у которого отсутствует способность связывания phyA, для изучения эффекта прямого физического взаимодействия phyA с маркером p-тела NOT9B (Schwenk et al., 2021). Как показано на дополнительной фигуре 4, количество p-тел в FR-свете было уменьшено в той же степени в линиях, экспрессирующих HA-YFP-NOT9B ΔPNB или HA-YFP-NOT9B, что указывает на то, что разборка p-тел в FR-свете не зависит от прямого взаимодействия NOT9B с phyA, даже если оно зависит от присутствия phyA.

Разборка P-тела в ответ на свет зависит от времени и интенсивности освещения

Многие реакции, опосредованные фитохромами, например ингибирование удлинения гипокотиля, зависят от интенсивности потока и качества света (Casal et al., 2014). Чтобы исследовать эти характеристики в контексте разборки p-тела, мы обрабатывали растения в течение разных промежутков времени R-, FR- или W-светом. Освещение в течение 1 часа не привело к значительному уменьшению количества p-тел, однако 4-часовое воздействие света R, FR или W вызвало прибл. 50%-е сокращение численности р-тела; воздействие света на проростки в течение 24 часов не привело к дальнейшему снижению количества р-тел (рис. 3А). Реакция через 4 часа известна для некоторых реакций, опосредованных фитохромами, например.g., усиление экспрессии генов ( ELIP1/2 , CHS ) (Peschke and Kretsch, 2011) или развертывание семядолей (Kretsch, 2010). Чтобы выяснить, зависит ли уменьшение разборки p-тела от интенсивности используемого для освещения FR-света, мы обрабатывали растения в течение 4 ч FR-светом различной интенсивности. Наблюдалась четкая зависимость от дозы с точкой насыщения от 5 до 20 мкмоль м –2 с –1 (рис. 3В). Это похоже на канонические реакции, такие как ингибирование роста гипокотиля в свете FR.Ненасыщающий эффект более низких интенсивностей может быть связан с уменьшением общей плотности энергии. Чтобы проверить это, мы увеличили освещенность до 24 часов, получив результаты, очень похожие на 4 часа (дополнительный рисунок 5). Это указывает на то, что уровень плотности потока энергии, а не общий поток энергии, определяет степень разборки p-тела в свете FR, предполагая, что эта реакция является реакцией высокой освещенности (HIR), опосредованной phyA.

Рис. 3. FR Светозависимое снижение количества p-тел зависит от времени и плотности потока энергии. (A) р-кинетика разборки кузова. 4-дневные, выращенные в темноте проростки , экспрессирующие p35S:HA-YFP-NOT9B , выращивали при указанных условиях освещения в течение различных периодов времени. Интенсивность света была установлена ​​​​на плотность потока 40 мкмоль м -2 с -1 (FR) или 20 мкмоль м -2 с -1 (R). Сфотографировали клетки эпидермиса гипокотилей проростков и оценили 15 изображений. Показан один репрезентативный эксперимент из трех независимых экспериментов.Отображаются репрезентативные микрофотографии для каждого лечения. Разные буквы обозначают значительные различия между группами, определенные с помощью однофакторного дисперсионного анализа, за которым следует HSD Тьюки. Р < 0,05. Масштабная линейка представляет 10 мкм. (B) Зависимость от скорости потока при разборке p-тела. 4-дневные, выращенные в темноте проростки, экспрессирующие p35S:HA-YFP-NOT9B , подвергались воздействию FR-света с различной плотностью энергии в течение 4 часов. Клетки эпидермиса в гипокотилях проростков были визуализированы и оценены 15 изображений.Показан один репрезентативный эксперимент из трех независимых экспериментов. Отображаются репрезентативные изображения микроскопа для каждого лечения. Разные буквы обозначают значительные различия между группами, определенные с помощью однофакторного дисперсионного анализа, за которым следует HSD Тьюки. Р < 0,05. Масштабная линейка представляет 10 мкм.

Цитоплазматический phyA достаточен для уменьшения количества процессинговых органов

На сегодняшний день большинство phyA-опосредованных ответов, которые были исследованы, зависят от локализованного в ядре, активируемого светом phyA, тогда как лишь очень немногие ответы, такие как контроль трансляции мРНК PORA , описаны как опосредуемые. с помощью цитоплазматического phyA (Paik et al., 2012; Хьюз, 2013). Поскольку p-тела локализованы в цитоплазме, возникает вопрос, опосредована ли разборка p-тел цитоплазматическим сигнальным путем или осуществляется через ядро, например, посредством транскрипции фактора, активного в цитоплазме. Ядерный импорт PhyA при восприятии света зависит от FHY1 и FHL (Hiltbrunner et al., 2006), что делает мутант fhy1-3 fhl-1 идеальным инструментом для решения этого вопроса.

Линию, экспрессирующую HA-YFP-NOT9B на фоне мутанта fhy1-3 fhl-1 , оценивали на предмет зависимого от FR снижения количества p-тела.Отсутствие ядерного транспорта phyA не оказало существенного влияния на общее количество p-тел, а снижение ответа на 4-часовую световую обработку FR было в диапазоне линии, экспрессирующей HA-YFP-NOT9B, на фоне WT (рис. 4A). . Это указывало на то, что цитоплазматического phyA достаточно, чтобы индуцировать разборку р-тела. Чтобы проверить, требуется ли цитоплазматический phyA для этого ответа, мы исследовали разборку p-тела в двойной трансгенной линии Arabidopsis, коэкспрессирующей p35S:HA-YFP-NOT9B и pPHYA:PHYA-NLS-YFP в phyA- 211 фон.Мы не смогли наблюдать какого-либо уменьшения количества p-тел в ответ на воздействие FR света в этой линии, содержащей исключительно локализованный в ядре phyA (Rausenberger et al., 2011). Это указывало на то, что ядерная фракция phyA не играет роли в этом процессе в FR-свете (рис. 4А). Чтобы подтвердить, что меченная на С-конце версия phyA, как правило, способна опосредовать разборку p-тел, мы скрестили p35S:HA-YFP-NOT9B с phyA-211 pPHYA:PHYA-CFP .В этой линии уменьшение количества p-тел в ответ на свет было похоже на фон Col-0 (дополнительная фигура 6).

Рис. 4. Цитоплазматический phyA достаточен и необходим для светозависимой ФР уменьшения количества р-тел. Линии растений, экспрессирующие p35S:HA-YFP-NOT9B (A) , скрещивали с phyA-211 pPHYA:PHYA-NLS-YFP и fhy1-3 fhl-1 . 4-дневные проростки, выращенные в темноте, обрабатывали в течение 4 ч FR-светом (40 мкмоль м –2 с –1 ) и анализировали.Клетки эпидермиса в гипокотилях проростков визуализировали и оценивали 15 изображений, уделяя особое внимание цитоплазматической фракции р-тела, маркированной HA-YFP-NOT9B. Показан один репрезентативный эксперимент из трех независимых экспериментов. Отображаются репрезентативные изображения микроскопа для каждого лечения. Разные буквы обозначают значительные различия между группами, определенные с помощью однофакторного дисперсионного анализа, за которым следует HSD Тьюки. Р < 0,05. Масштабная линейка представляет 10 мкм. (B) Гипотетическая модель разборки p-тела, опосредованной phyA.В темноте phyA локализуется в цитоплазме в неактивной форме Pr; FHY1 и FHL транспортируют часть активного phyA в ядро, в то время как оставшийся цитоплазматический Pfr phyA запускает разборку p-тела посредством цитоплазматического сигнального каскада.

Зависимость разборки p-тела от фитохромов повышает возможное участие канонических фитохромных нижестоящих сигнальных путей. Одним из ключевых факторов, которые опосредуют события передачи сигналов ниже по течению от phyA и phyB, является HY5. Поэтому мы скрестили линию, экспрессирующую HA-YFP-NOT9B, с мутантом hy5-215 и оценили реакцию на свет FR.Как показано на дополнительной фигуре 7, отсутствие функционального HY5 не влияет на уменьшение числа p-тел в ответ на свет FR. В совокупности мы заключаем, что эффект phyA на p-тела опосредуется исключительно цитоплазматической фракцией phyA (рис. 4В). Нокаут одного из наиболее важных факторов транскрипции в передаче световых сигналов, HY5, не влиял на разборку р-тела. Это согласуется с представлением о том, что нет необходимости в косвенной передаче сигналов посредством транскрипции de novo в ядре.В заключение, цитоплазматический phyA может напрямую контролировать количество р-тел.

Обсуждение

Световая сигнализация, опосредованная фитохромами, изучается более 70 лет, и до сих пор наши знания об этих процессах неполны. В своей новаторской работе Jang et al. (2019) показали, что мРНК, имеющие решающее значение для запуска фотосинтеза, останавливаются и сохраняются в DCP2-маркированных p-тельцах и высвобождаются при облучении светом, тем самым инициируя трансляцию этих мРНК. До сих пор было показано только, что маркерный белок DCP2 исключается из p-тел в ответ на свет.Здесь мы приводим доказательства того, что другие маркеры p-тела (DCP1 и NOT9B) демонстрируют такое же поведение, как DCP2. Это подтверждает представление о том, что p-тела действительно разбираются, а не о том, что конкретные факторы выборочно исключаются. Наши данные показывают, что процесс разборки p-тела контролируется фитохромами в R и FR свете, при этом phyB играет доминирующую роль в R и phyA в FR свете. Будущая работа должна будет раскрыть механизм, с помощью которого сигнал, воспринимаемый фоторецепторами, преобразуется в изменение состава и разборку р-тел.

Мы использовали трансгенные и мутантные линии, содержащие исключительно ядерный или цитоплазматический локализованный phyA, чтобы исследовать, какая фракция phyA необходима и достаточна для разборки p-телец в ответ на FR-свет. Поскольку цитоплазматическая фракция phyA достаточна, а ядерная фракция не вызывает разборки p-тел, мы заключаем, что этот механизм не реализуется через ядерную передачу сигналов фитохрома. До сегодняшнего дня сообщалось лишь о нескольких реакциях цитоплазматического фитохрома (Hughes, 2013).Например, было показано, что фитохром в активном состоянии Pfr связывается с PENTA 1 (PNT1) и тем самым репрессирует трансляцию мРНК, например, мРНК PORA (Paik et al., 2012).

До сих пор неясно, оказывает ли цитоплазматический phyB такой же эффект на p-тела в ответ на R-свет, как phyA в ответ на FR-свет. К сожалению, экспериментально ответить на этот вопрос для phyB гораздо труднее, чем для phyA, потому что ядерно-цитоплазматическое разделение phyB гораздо менее строгое, чем для phyA (Klose et al., 2015б). Дальнейшие исследования могут включать скрещивание маркерных линий p-тела с линией, экспрессирующей p35S:PHYB-NLS-GFP , на фоне phyB-9 , чтобы оценить, способен ли ядерный phyB запускать разборку p-тела. Поскольку не было идентифицировано никакого конкретного импортера ядерного транспорта phyB, обратный, гораздо более убедительный эксперимент затруднителен. Здесь слияния phyB с GR могут иметь значение для сохранения phyB в цитозоле и контроля ядерного импорта с помощью DEX (Huq et al., 2003).Многие ответы, опосредованные phyA и phyB, зависят от одних и тех же сигнальных компонентов (например, PIF и COP1/SPA), поэтому можно предположить, что передача сигнала ниже этих двух фоторецепторов также конвергентна, когда речь идет о регуляции разборки p-тела. Кроме того, будет интересно, если разборка p-тел в ответ на R- и FR-свет влияет на транслатом аналогичным образом или существуют эффекты, зависящие от длины волны. Джанг и др. (2019) показали, что мРНК, кодирующие OE33 и GUN5, белки, важные для образования хлоропластов, высвобождаются в результате разборки p-тела на свету и подвергаются трансляции.Поскольку FR-свет играет второстепенную роль в фотосинтезе по сравнению с R-светом, будет интересно оценить, высвобождается ли другой набор мРНК из p-тел в ответ на R- и FR-свет.

В темноте COP1, локализованный в ядре, вместе с белками SPA помечает специфические белки для деградации протеасомой. Однако COP1 также присутствует в цитозоле (Balcerowicz et al., 2017), и поэтому можно предположить, что цитозольный COP1 также может быть активным и нацеливаться на гипотетический белок X, который расщепляет РНК или белки в p-телах, необходимых для структурной целостности клеток. p-тела.Когда цитозольный COP1 ингибируется фотоактивированными фитохромами в цитозоле, такой белок X будет накапливаться и может влиять на состав и количество p-тела (дополнительная фигура 8). Однако на сегодняшний день идентичность белка X неизвестна, а также неизвестно, обладает ли COP1 активностью убиквитинлигазы E3 в цитозоле. Доказательством участия COP1 в разборке p-тела является тот факт, что у мутанта ·cop1-6  общее число p-тел уменьшается, и дальнейшее снижение не происходит после облучения светом (Jang et al., 2019). Выяснение механизма разборки p-тела будет иметь решающее значение для понимания того, как свет влияет на трансляцию мРНК. Недавние достижения в протеомных измерениях содержимого p-тел, очищенных от культур клеток млекопитающих, могут быть полезны для создания экспериментального протокола для сравнения p-тел, выделенных из растений, выращенных на свету и в темноте (Hubstenberger et al., 2017).

Как безмембранные органеллы, p-тельца образуются путем разделения фаз жидкость-жидкость (LLPS). Способность подвергаться LLPS зависит от различных факторов, включая повышенную локальную концентрацию белков с высокой внутренней неупорядоченностью.Кроме того, исследований in vitro показали, что рибонуклеопротеины (РНП), связанные с мРНК, могут придавать потенциал разделения фаз (Garcia-Jove Navarro et al., 2019). Процесс, который разбирает p-тела, по-видимому, снижает эту возможность фазового разделения путем либо выборочного, либо общего удаления факторов, придающих потенциал фазового разделения. Выявление этих факторов поможет понять, как сигналы окружающей среды, такие как свет, влияют на этот процесс.

Несмотря на то, что NOT9B является компонентом p-тел, участвующим в передаче световых сигналов и непосредственно взаимодействующим с фоторецептором FR phyA, нет доказательств того, что он механически участвует в сборке или разборке p-тел.Способность NOT9B связывать phyA не имеет отношения к сборке NOT9B в p-тела, поскольку мутация сайта PNB, который придает способность NOT9B связывать phyA, не приводит к измененному паттерну образования или разборки p-телец. Поскольку для человеческого гомолога NOT9B, CNOT9, была продемонстрирована способность связывания нуклеотидов in vitro (Garces et al., 2007), можно предположить, что связывание NOT9B с остановленными мРНК, локализованными в p-тельцах, может способствовать динамической активности NOT9B. ассоциации с p-телами.Другим потенциальным механизмом ассоциации NOT9B с р-телами может быть взаимодействие с белками GW-повторов, классом белков, содержащих глициновые/триптофановые повторы, которые, как известно, взаимодействуют с AGO, и человеческим гомологом NOT9B CNOT9 (Chen et al., 2014). ). Мутантная версия NOT9B, в которой отсутствуют сайты связывания GW, демонстрирует пониженную ассоциацию с p-телами (Schwenk et al., 2021).

Структурно CNOT9 состоит из домена повтора броненосца (ARM), фланкированного N-концевой и С-концевой неструктурированной гибкой областью (Garces et al., 2007), структура сохраняется в NOT9B. Эти области с высоким внутренним беспорядком можно рассматривать как домены низкой сложности, подобные доменам низкой сложности, участвующим в формировании гранул LLPS. В высокопроизводительных исследованиях было обнаружено, что неструктурированный N-концевой домен NOT9B фосфорилирован (Heazlewood et al., 2008; Reiland et al., 2009). Фосфорилирование может способствовать ядерно-цитоплазматическому разделению, а также ассоциации с p-тельцами при различных условиях освещения.Эксперименты с использованием различных усеченных и/или мутированных версий NOT9B помогут выяснить, является ли он структурным компонентом обрабатывающих органов.

При насыщении примерно через 4 часа разборка p-тела является быстрой реакцией. Первоначальное высвобождение мРНК для трансляции, вероятно, происходит еще быстрее, поскольку мы наблюдаем только окончательное исчезновение p-тел. Быстрая кинетика соответствует предполагаемой цели быстрого высвобождения мРНК для адаптации к меняющейся среде.Поэтому изучение кинетики разборки p-тела представляет значительный интерес, и зонды FISH для идентифицированных мРНК или микроРНК, локализованных в p-телах, могут помочь понять кинетику их высвобождения.

Заманчиво предположить, почему только около 50% р-тел разбираются после облучения светом, независимо от продолжительности и интенсивности световой обработки. В литературе описан гетерогенный состав р-тел, которые могут содержать различные структурные элементы с разной чувствительностью к разным раздражителям, например к гипоксии и свету (Sorenson, Bailey-Serres, 2014; Jang et al., 2019). Термин «процессорное тело» предположительно описывает гетерогенный класс различных гранул, имеющих частично специфическое, частично перекрывающееся содержимое и функции. Это может объяснить, как разные наборы РНК могут высвобождаться в ответ на разные стимулы и почему только примерно 50% p-тел разбираются в ответ на свет. Флуоресцентно-активированную сортировку частиц (FAPS) можно использовать для очистки p-тел от растительной ткани и отделения их от диффузной фракции. Эти очищенные тела могут быть проанализированы на содержание белка и РНК с использованием методов MS/MS и RNA-seq.Проведение этих экспериментов после обработки растений различными стимулами, уменьшающими количество р-тел, может помочь различить потенциальные подклассы р-тел и определить содержание в них РНК и белка. Опять же, зонды FISH могут оказаться незаменимым инструментом для исследования того, равномерно ли распределены виды мРНК в этих различных р-телах. Незнание содержимого и незнание того, как содержимое высвобождается из p-тел, является текущим недостатком в этой увлекательной области исследований, и можно ожидать глубокого понимания функции p-тел, как только эти вопросы будут решены.

В совокупности наши результаты показывают новую цитоплазматическую функцию phyA в высвобождении мРНК путем разборки p-тел в ответ на свет. Наше понимание p-тел в настоящее время сосредоточено на содержании в них РНК, однако молекулярный механизм разборки p-тел до сих пор неясен. Будет интересно выяснить, является ли свет единственным стимулом, запускающим высвобождение мРНК из р-тел, или же это общий механизм регуляции развития растений.

Материалы и методы

Рост растений

В экспериментальных целях растения выращивали на 1/2 мс, 1.2% агар. Семена подвергали поверхностной стерилизации путем инкубации в 1 мл 70% EtOH в течение 10 мин с последующей инкубацией в 1 мл 100% EtOH в течение 10 мин. Семена оставляли сушиться в стерильных условиях. После посева чашки выдерживали 48–72 ч при 4°С для стратификации. Для индукции прорастания семена обрабатывали 70 мкмоль м –2 с –1 белым светом в течение 6–8 ч и переносили обратно в Д на 4 сут. Дальнейшие световые обработки проводили, как описано в подписях к фигурам.

Для селекции и размножения растения выращивали на стандартном грунте в вегетационной камере в 100 мкмоль м –2 с –1 ФАР в условиях длинного дня (16 ч ЗТ, 22°С; 8 ч Т, 18 °С).

Световые процедуры и источники света

Для экспериментов использовались светодиоды с длиной волны 740 нм для FR-света, светодиоды с длиной волны 656 нм для R-света и люминесцентные лампы, установленные в шкафу Sanyo (Sanyo, Осака, Япония) для W-света. Для выращивания растений растения содержали под лампами дневного света. Спектры всех источников света можно найти на дополнительном рисунке 9.

Визуализация и подсчет обрабатываемых органов

Проростки

помещали в ddH 2 O в условиях зеленого света и подвергали эпифлуоресцентной микроскопии.Микроскопические изображения были получены с использованием микроскопа Zeiss Axioplan 2 MOT (Carl Zeiss, Гёттинген, Германия), оснащенного 12-битной монохромной ПЗС-камерой Photometrics CoolSNAP-HQ (Roper Scientific, Тусон, Аризона, США), колесами внешних фильтров (LUDL, Hawthorne). , Нью-Йорк, США) и наборы фильтров для YFP (F31-028, возбуждение 500 нм, эмиссия 515 нм; AHF Analysentechnik, Тюбинген, Германия) или CFP (F31-044, возбуждение 436 нм, эмиссия 455 нм; AHF Analysentechnik , Тюбинген, Германия).

Для визуализации использовалась верхняя треть гипокотиля.Здесь был сфокусирован самый верхний слой эпидермиса и были сделаны три последовательных изображения вдоль гипокотиля. Для каждого изображения была выбрана область 350 × 200 пикселей таким образом, чтобы было включено как можно больше p-тел. Используя ImageJ, было подсчитано количество p-тел.

Экстракция белков и вестерн-блоттинг

Растения выращивали в течение 4 дней в среде D с последующими указанными световыми обработками. Собирали 100 мг растительного сырья и измельчали ​​в жидком азоте. 250 мкл буфера для образцов SDS при 95°C [65 мМ Tris/HCl, pH 7.3, 4 М мочевины, 3% SDS, 10% глицерина, 0,05% бромфенолового синего, 20 мМ DTT, 1× коктейль ингибиторов протеазы (Sigma-Aldrich, кат. №: I3911)] и образцы инкубировали при энергичном встряхивании при 95°С в течение 10 мин. Нерастворимый мусор осаждали центрифугированием (15 мин, 20 000 × г ). Супернатант переносили в новую пробирку и определяли содержание белка методом Amido Black (Попов и др., 1975).

Равные количества белков разделяли на 10% SDS-PAGE и переносили на мембрану PVDF.Мембраны блокировали 5% обезжиренным молоком в PBS-T (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 3 , 1,8 мМ KH 2 PO 4 , pH 7,4, 0,5% Tween). -20). Одинаковая нагрузка была показана окрашиванием амидо-черным или обнаружением ACT. Мембраны исследовали с помощью анти-НА-антитела (мышиного, моноклонального, 1:1000 в PBS-T, BioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США, каталожный номер: 3) или анти-ACT-антитела (мышиного, моноклонального, 1 :5 000 в PBS-T, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США, кат. №: A0480), а затем вторичное антимышиное антитело (1:7 500 в PBS-T, Vector Laboratories, Burlingame, CA, United States) США, кат. номер: AP-2000-1).Иммунодетекцию проводили с использованием CDP-STAR (Sigma-Aldrich, кат. номер: 1175

01) в соответствии с инструкциями производителя. Количественную оценку проводили, как описано ранее (Schwenk et al., 2021).

Визуализация данных

Микроскопические изображения были обрезаны, а яркость/контраст отрегулированы с помощью ImageJ. Графики были созданы с использованием пакета Matplotlib в Python 3.7.6 с использованием Spyder IDE v4.0.1. На прямоугольных диаграммах отображаются следующие характеристики наборов данных: белая линия указывает медианное значение, а прямоугольник указывает пределы квартиля 1 (Q1) и квартиля 3 (Q3).Межквартильный размах (IQR) определяется как Q3 – Q1. Усы обозначают Q1–1,5 × IQR и Q3 + 1,5 × IQR. Кружками обозначены выбросы, которые не попадают в диапазон усов.

Фигурки собраны в Inkscape. Статистический анализ проводили, как указано в подписях к рисункам.

Плазмидные конструкции и линии растений, использованные в этом исследовании

Все плазмидные конструкции и линии растений, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительных таблицах 1, 2 (Genoud et al., 2008; Rausenberger et al., 2011; Менон и др., 2020 г.; Швенк и др., 2021).

Заявление о доступности данных

Оригинальные материалы, представленные в исследовании, включены в статью/дополнительный материал, дальнейшие запросы можно направлять соответствующему автору/авторам.

Вклад авторов

PS и AH: концептуализация, визуализация, написание – первоначальный проект, написание – проверка и редактирование, получение финансирования. ПС: расследование. АХ: администрация проекта. Оба автора внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.

Финансирование

Это исследование было поддержано Немецким исследовательским фондом (DFG) в рамках Стратегии превосходства Германии (GSC-4/Высшая школа биологии и медицины им. Шпемана для PS; CIBSS – EXC-2189 – ID проекта 3984, проект C1 и Импульсные фонды CIBSS для AH ), HI 1369/10-1 (ID проекта 453030721) и частично Министерством науки, исследований и искусств земли Баден-Вюртемберг.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Примечание издателя

Все претензии, изложенные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно представляют претензии их дочерних организаций или издателя, редакторов и рецензентов. Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или претензии, которые могут быть сделаны его производителем, не гарантируются и не поддерживаются издателем.

Благодарности

Мы благодарны М. Кренцу и Т. Альбонетти за техническую помощь.Мы признательны за поддержку Фонда публикаций открытого доступа Фрайбургского университета.

Дополнительный материал

Дополнительный материал к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2022.828529/full#supplementary-material

.

Дополнительная таблица 1 | Список плазмидных конструкций, использованных в этом исследовании.

Дополнительная таблица 2 | Список линий растений A. thaliana , использованных в этом исследовании.

Ссылки

Айзер А., Кало А., Кафри П., Шрага А., Бен-Ишай Р., Джейкоб А. и др. (2014). Количественная оценка нацеливания мРНК на P-тела в живых клетках человека показывает их двойную роль в распаде и хранении мРНК. J. Cell Sci. 127, 4443–4456. doi: 10.1242/jcs.152975

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Андерсон П. и Кедерша Н. (2006). гранулы РНК. J. Cell Biol. 172, 803–808.

Академия Google

Араэ, Т., Морита К., Имахори Р., Судзуки Ю., Ясуда С., Сато Т. и др. (2019). Идентификация комплексов CCR4-NOT Arabidopsis с РНК-связывающими белками Pumilio, APUM5 и APUM2. Физиология клеток растений. 60, 2015–2025 гг. doi: 10.1093/pcp/pcz089

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Бальцерович, М., Кернер, К., Шенкель, К., и Хеккер, У. (2017). Белки SPA влияют на субклеточную локализацию COP1 в комплексе убиквитинлигазы COP1/SPA во время фотоморфогенеза. Завод физиол. 174, 1314–1321. doi: 10.1104/pp.17.00488

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Бренгес, М., Тейшейра, Д., и Паркер, Р. (2005). Движение эукариотических мРНК между полисомами и цитоплазматическими процессинговыми телами. Наука 310, 486–489. doi: 10.1126/science.1115791

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чен Ю., Боланд А., Кузуоглу-Озтюрк Д., Баванкар П., Лох Б., Chang, C.-T., et al. (2014). Комплекс DDX6-CNOT1 и карманы для связывания W в CNOT9 обнаруживают прямую связь между распознаванием мишеней miRNA и молчанием. Мол. Мобильный 54, 737–750. doi: 10.1016/j.molcel.2014.03.034

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Декер, Си Джей, и Паркер, Р. (2012). P-тела и стрессовые гранулы: возможная роль в контроле трансляции и деградации мРНК. Гавань Колд Спринг. Перспектива. биол. 4:а012286.doi: 10.1101/cshperspect.a012286

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Falcioni, R., Moriwaki, T., Perez-Llorca, M., Munné-Bosch, S., Gibin, M.S., Sato, F., et al. (2020). На структуру и состав клеточной стенки влияет качество света у рассады томатов. J. Photochem. Фотобиол. Б 203:111745. doi: 10.1016/j.jphotobiol.2019.111745

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Гарсес, Р. Г., Гиллон, В.и Пай, Э. Ф. (2007). Атомная модель человеческого Rcd-1 выявляет броненосноподобный повторяющийся белок со свойствами связывания нуклеиновой кислоты in vitro. Науки о белках. 16, 176–188. doi: 10.1110/ps.062600507

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Garcia-Jove Navarro, M., Kashida, S., Chouaib, R., Souquere, S., Pierron, G., Weil, D., et al. (2019). РНК является критическим элементом для определения размера и состава фазово-разделенных РНК-белковых конденсатов. Нац.коммун. 10:3230. doi: 10.1038/s41467-019-11241-6

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Genoud, T., Schweizer, F., Tscheuschler, A., Debrieux, D., Casal, J.J., Schäfer, E., et al. (2008). FHY1 опосредует ядерный импорт активируемого светом фоторецептора фитохрома А. Генетика PLoS. 4:e1000143. doi: 10.1371/journal.pgen.1000143

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хизлвуд, Дж. Л., Дурек, П., Hummel, J., Selbig, J., Weckwerth, W., Walther, D., et al. (2008). PhosPhAt: база данных сайтов фосфорилирования у Arabidopsis thaliana и специфический для растений предиктор сайтов фосфорилирования. Рез. нуклеиновых кислот. 36, Д1015–Д1021. doi: 10.1093/nar/gkm812

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хилтбруннер А., Чеушлер А., Вициан А., Кункель Т., Кирхер С. и Шефер Э. (2006). FHY1 и FHL действуют вместе, опосредуя ядерное накопление фоторецептора фитохрома А. Физиология клеток растений. 47, 1023–1034. doi: 10.1093/pcp/pcj087

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Hubstenberger, A., Courel, M., Bénard, M., Souquere, S., Ernoult-Lange, M., Chouaib, R., et al. (2017). Очистка P-Body выявляет конденсацию регулонов регулонов репрессии мРНК. Мол. Ячейка 68, 144–157.e5. doi: 10.1016/j.molcel.2017.09.003

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Хьюз, Дж.(2013). Фитохромная цитоплазматическая сигнализация. год. Преподобный завод биол. 64, 377–402. doi: 10.1146/annurev-arplant-050312-120045

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Хук, Э., Аль-Сади, Б., и Куэйл, П. Х. (2003). Ядерная транслокация фоторецептора фитохрома В необходима для его биологической функции в фотоморфогенезе проростков. Завод J. 35, 660–664. doi: 10.1046/j.1365-313x.2003.01836.x

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Джанг, Г.-J., Yang, J.-Y., Hsieh, H.-L., and Wu, S.-H. (2019). Обрабатывающие органы контролируют избирательную трансляцию для оптимального развития молодых сеянцев арабидопсиса. Проц. Натл. акад. науч. США 116, 6451–6456. doi: 10.1073/pnas.1

4116

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Клозе, К., Венеция, Ф., Хуссонг, А., Кирхер, С., Шефер, Э., и Флек, К. (2015a). Систематический анализ того, как димеризация фитохрома В определяет его специфичность. Нац. Растения 1:15090.

Академия Google

Клозе, К., Вициан, А., Кирхер, С., Шефер, Э., и Надь, Ф. (2015b). Молекулярные механизмы опосредования светозависимого ядерно-цитоплазматического разделения фитохромных фоторецепторов. Новый Фитол. 206, 965–971. doi: 10.1111/nph.13207

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Кочи Т., Мукогава К., Франкенберг Н., Масуда М., Йокота А. и Лагариас Дж. К. (2001). Ген HY2 арабидопсиса кодирует фитохромомобилинсинтазу, ферредоксин-зависимую биливердинредуктазу. Растительная клетка 13, 425–436. doi: 10.1105/tpc.13.2.425

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Легрис, М., и Инс, Ю.Ч., и Фанкхаузер, К. (2019). Молекулярные механизмы, лежащие в основе фитохром-контролируемого морфогенеза растений. Нац. коммун. 10:5219. doi: 10.1038/s41467-019-13045-0

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Лян, В., Ли, К., Лю, Ф., Цзян, Х., Ли, С., Сунь, Дж., и др. (2009).Гомологи фактора 1, ассоциированного с CCR4, Arabidopsis проявляют активность деаденилирования мРНК и играют роль в защитных реакциях растений. Сотовые Res. 19, 307–316. doi: 10.1038/cr.2008.317

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ma, L., Gao, Y., Qu, L., Chen, Z., Li, J., Zhao, H., et al. (2002). Геномные доказательства COP1 как репрессора экспрессии и развития регулируемых светом генов у арабидопсиса. Растительная клетка 14, 2383–2398. дои: 10.1105/тпк.004416

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мальдонадо-Бонилья, Л. Д. (2014). Состав и функция телец P у Arabidopsis thaliana . Фронт. Растениевод. 5:201.

Академия Google

Мечников, Э. (1865 г.). Über die Entwicklung der Cecidomyienlarve aus dem Pseudovum. Арх. Натургеш. 31, 304–311.

Академия Google

Менон К., Клозе К. и Хилтбруннер А.(2020). FHY1 и FHY1-LIKE арабидопсиса не требуются для передачи сигнала фитохрома А в ядре. Завод общ. 1:100007. doi: 10.1016/j.xplc.2019.100007

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Мерчанте, К., Степанова, А.Н., и Алонсо, Дж.М. (2017). Регуляция трансляции у растений: интересное прошлое, захватывающее настоящее и многообещающее будущее. Завод J. 90, 628–653. doi: 10.1111/tpj.13520

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Пайк И.и Хук, Э. (2019). Фоторецепторы растений: многофункциональные сенсорные белки и их сигнальные сети. Семин. Сотовый Дев. биол. 92, 114–121. doi: 10.1016/j.semcdb.2019.03.007

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Паркер, Р., и Шет, У. (2007). Тела P и контроль трансляции и деградации мРНК. Мол. Мобильный 25, 635–646. doi: 10.1016/j.molcel.2007.02.011

Полнотекстовая перекрестная ссылка | Академия Google

Пешке, Ф.и Креч, Т. (2011). Полногеномный анализ моделей накопления светозависимых транскриптов на ранних стадиях деэтиоляции проростков арабидопсиса. Завод физиол. 155, 1353–1366. doi: 10.1104/стр.110.166801

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Попов Н., Шмитт М., Шульцек С. и Маттис Х. (1975). Eine störungsfreie Mikromethode zur Bestimmung des Proteingehaltes in Gewebehomogenaten. Акта Биол. Мед. нем. 34, 1441–1446.

Академия Google

Rausenberger, J., Tscheuschler, A., Nordmeier, W., Wüst, F., Timmer, J., Schäfer, E., et al. (2011). Циклы фотоконверсии и переноса ядер определяют профиль реакции фитохрома А на дальний красный свет. Сотовый 146, 813–825. doi: 10.1016/j.cell.2011.07.023

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Reiland, S., Messerli, G., Baerenfaller, K., Gerrits, B., Endler, A., Grossmann, J., et al. (2009).Крупномасштабное профилирование фосфопротеома арабидопсиса выявляет новые субстраты хлоропластной киназы и сети фосфорилирования. Завод физиол. 150, 889–903. doi: 10.1104/стр.109.138677

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Sachdev, R., Hondele, M., Linsenmeier, M., Vallotton, P., Mugler, C.F., Arosio, P., et al. (2019). Pat1 способствует сборке тела процессинга за счет усиления фазового разделения АТФазы DEAD-box Dhh2 и РНК. eLife 8:e41415.doi: 10.7554/eLife.41415

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Швенк П., Ширин Д. Дж., Понну Дж., Штаудт А.-М., Леш К. Л., Лихтенберг Э. и соавт. (2021). Раскрытие новой функции комплекса CCR4-NOT в опосредованной фитохромом А передаче световых сигналов у растений. eLife 10:e63697. doi: 10.7554/eLife.63697

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Соренсон, Р., и Бейли-Серрес, Дж. (2014).Избирательная секвестрация мРНК с помощью OLIGOURIDYLATE-BINDING PROTEIN 1 способствует трансляционному контролю во время гипоксии у Arabidopsis. Проц. Натл. акад. науч. США 111, 2373–2378. doi: 10.1073/pnas.1314851111

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Судзуки Ю., Араэ Т., Грин П. Дж., Ямагути Дж. и Тиба Ю. (2015). AtCCR4a и AtCCR4b участвуют в определении длины поли(А) транскрипта синтазы крахмала 1, связанного с гранулами, и в модуляции метаболизма сахарозы и крахмала у Arabidopsis thaliana . Физиология клеток растений. 56, 863–874. doi: 10.1093/pcp/pcv012

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Уолли, Дж. В., Келли, Д. Р., Несторова, Г., Хиршберг, Д. Л., и Дехеш, К. (2010). Деаденилазы арабидопсиса AtCAF1a и AtCAF1b играют перекрывающиеся и разные роли в опосредовании реакций на стресс окружающей среды. Завод физиол. 152, 866–875. doi: 10.1104/стр.109.149005

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Ван, К., Шмих Ф., Сриватса С., Вайднер Дж., Беренвинкель Н. и Спанг А. (2018). Контекстно-зависимое отложение и регуляция мРНК в Р-телах. eLife 7:e29815.

Академия Google

Wu, G.-Z., Meyer, E.H., Richter, A.S., Schuster, M., Ling, Q., Schöttler, M.A., et al. (2019). Контроль ретроградной передачи сигналов за счет импорта белка и стресса цитозольной укладки. Нац. Растения 5, 525–538. doi: 10.1038/s41477-019-0415-y

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Чжоу, Х., Lin, R., Huang, H., Li, L., Cai, T., Zhu, J., et al. (2020). Компонент комплекса CCR4-NOT NOT1 регулирует РНК-направленное метилирование ДНК и сайленсинг транскрипции, облегчая Pol IV-зависимую продукцию siRNA. Завод J. 103, 1503–1515. doi: 10.1111/tpj.14818

Реферат PubMed | Полный текст перекрестной ссылки | Академия Google

Состав, протеолиз и разборка аденовирусов, изученные с помощью углубленной качественной и количественной протеомики | Интернет-исследования в области здравоохранения и окружающей среды (HERO)

ID ГЕРОЯ

7006946

Тип ссылки

Журнальная статья

Заголовок

Состав, протеолиз и разборка аденовирусов, изученные с помощью углубленной качественной и количественной протеомики

Авторы)

Беневенто, М; Ди Пальма, С.; Снайдер, Дж.; Мойер, CL; Редди, В.С.; Немеров, Г.Р.; Хек, AJR; ,

Год

2014

Рецензируется ли эксперт?

да

Журнал

Журнал биологической химии
ISSN: 0021-9258
EISSN: 1083-351X

Издатель

AMER SOC BIOCHEMISTRY MOLECULAR BIOLOGY INC.

Место нахождения

БЕТЕСДА

Номера страниц

11421-11430

PMID

245

DOI

10.1074/jbc.M113.537498

Идентификатор Web of Science

WOS:000334638500043

Абстрактный

Справочная информация: Аденовирусы (AdV) широко используются в качестве векторов доставки генов. Результаты. Были измерены числа копий всех белков AdV и исследовано высвобождение белков при тепловом стрессе.Заключение. Вирусная протеаза играет особую роль в сегментированном высвобождении белков AdV. Значимость: наша характеристика с помощью масс-спектрометрии дает новое представление о разборке HAdV во время проникновения в клетки-хозяева. Используя протеомику высокого разрешения на основе МС в сочетании с множественным расщеплением протеазами, мы составили профили со средним покрытием последовательностей 90%, все 13 присутствующих вирусных белков в векторе аденовируса человека (HAdV). Этот подробный профиль предоставил множество основанных на пептидах доказательств внутренней протеазной активности, влияющей на несколько белков HAdV.Затем сгенерированная библиотека пептидов была использована для разработки целевого метода протеомики с использованием мониторинга выбранных реакций (SRM), направленного на количественное профилирование стехиометрии всех 13 белков, присутствующих в HAdV. Мы также использовали этот метод для исследования высвобождения специфических вирусных белков, инициированного термической стимуляцией, имитируя раннюю стадию разборки HAdV во время проникновения в клетки-хозяева. Мы подтвердили количество копий наиболее хорошо охарактеризованных компонентов вирусного капсида и установили количество копий для белков, стехиометрия которых до сих пор точно не определена.Мы также обнаружили, что нагревание HAdV вызывает полное высвобождение пентонного основания и волокнистых белков, а также существенное высвобождение белков VIII и VI. Для этих последних белков протеолиз созревания аденовирусной протеазой приводит к дифференцированному высвобождению фрагментов, при этом одни пептиды полностью высвобождаются, а другие в значительной степени сохраняются в частицах AdV. Эта информация, вероятно, будет полезна для текущей интерпретации криоЭМ высокого разрешения и рентгеновских карт электронной плотности.

Выделение факторов, необходимых для разборки сплайсосомы, и выявление продуктов ее диссоциации с использованием очищенной системы сплайсинга

  1. Райнхард Люрманн1,4
  1. 1 Кафедра клеточной биохимии, Институт биофизической химии Макса Планка, D-37077 Геттинген, Германия;
  2. 2 Кафедра молекулярной структурной биологии, Институт микробиологии и генетики, Геттингенский университет им. Георга Августа, D-37077 Геттинген, Германия;
  3. 3 Группа биоаналитической масс-спектрометрии, Институт биофизической химии им. Макса Планка, D-37077 Геттинген, Германия

    Аннотация

    Сплайсосома представляет собой фермент с одним оборотом, который необходимо демонтировать после катализа, чтобы как высвободить мРНК, так и рециркулировать малые ядерные рибонуклеопротеины (мяРНП) для последующих раундов сплайсинга пре-мРНК.События ремоделирования RNP, происходящие во время разборки сплайсосомы плохо изучены, а состав высвобождаемых мяРНП известен лишь приблизительно. С использованием очищая компоненты in vitro, мы создали посткаталитические сплайсосомы, которые могут диссоциировать на мРНК и интрон-лариат сплайсосомы (ILS) путем добавления РНК-хеликазы Prp22 плюс АТФ и без необходимости добавления белков этапа 2 Slu7 и Prp18. Инкубация выделенной ILS с РНК-хеликазой Prp43 плюс Ntr1/Ntr2 и АТФ приводит к определенной диссоциации сплайсосом продукты: интрон-лариат, мяРНК U6, мяРНП 20–25S U2, содержащий SF3a/b, мяРНП 18S U5 и «комплекс девятнадцати», связанный с как с высвобождаемым мяРНП U2, так и с интрон-лариатной РНК.Наша система воспроизводит всю упорядоченную фазу разборки сплайсосомы. с очищенными компонентами, что определяет минимальный набор агентов, необходимых для данного процесса. Это позволило нам охарактеризовать белки ILS с помощью масс-спектрометрии и идентифицируют АТФазное действие Prp43 как необходимое и достаточное для диссоциации ILS без участия АТФазы Brr2.

    • Поступила в редакцию 13.10.2012 г.
    • Принят 15 января 2013 г.
    • Copyright © 2013 by Cold Spring Harbour Laboratory Press

    Регуляция состава и разборки фокальных комплексов с помощью кальций-зависимой протеазы кальпаин | Журнал клеточной науки

    Чтобы изучить, как кальпаин модулирует организацию и разборку участков адгезивного контакта, мы исследовали влияние ингибирования кальпаином на локализацию различных компонентов фокальной адгезии.В отличие от других исследованных компонентов (зиксин, FAK, паксиллин, интегрин, талин и винкулин), актин-связывающий белок α-актинин показал сниженную локализацию в сайтах адгезивных контактов после ингибирования кальпаином в клетках CHOK1 (рис. 5). α-Actinin представляет собой актин-связывающий белок, который сшивает актиновые филаменты и интегрин-содержащие адгезивные комплексы и локализуется как вдоль актиновых стрессовых волокон, так и в очаговых спайках (Otey et al., 1993). Используя как окрашивание антителами на α-актинин, так и экспрессию слитого белка EGFP-α-актинин, мы обнаружили, что α-актинин демонстрировал сниженную локализацию в сайтах адгезивных комплексов после ингибирования кальпаина с помощью ALLN или кальпастатина (рис.5). После ингибирования кальпаином мы обнаружили локализацию α-актинина по периферии клетки. В исследованиях живой визуализации с использованием клеток CHOK1, совместно трансфицированных EGFP-α-актинином и контрольным вектором или кальпастатином, ингибирование кальпаина ингибировало динамику и локализацию α-актинина в участках адгезивных комплексов (рис. 5). В контрольных клетках EGFP-α-актинин был высокодинамичным и локализовался в участках адгезивных комплексов в центре и на периферии клетки. Напротив, экспрессия кальпастатина индуцировала периферическое распределение α-актинина и ингибировала динамику α-актинина.Интересно, что в отличие от α-актинина, зиксин, который обычно локализуется как в фокальных комплексах, так и в актиновом цитоскелете, присутствовал преимущественно в фокальных комплексах после ингибирования кальпаином, а его совместная локализация с α-актинином была снижена в клетках CHOK1 (рис. 6). ). В контрольных клетках α-актинин показал совместную локализацию с зиксином на 80%, но после обработки проницаемыми для клеток ингибиторами кальпаина наблюдалась совместная локализация только на 31%. Иммунофлуоресценцию или котрансфекцию использовали для характеристики зиксинсодержащих структур.Мы обнаружили, что как в контрольных клетках, так и в клетках, обработанных ALLN, комплексы зиксина содержали α5-GFP-интегрин (Laukaitis et al., 2001) (рис. 7a), винкулин (рис. 7b), паксиллин, FAK и талин (данные не показано). Примечательно, что локализация α5-интегрина и винкулина в периферических фокальных комплексах была более заметной в клетках, обработанных ALLN. Чтобы определить, приводит ли неспецифическое разрушение актинового цитоскелета к аналогичным изменениям в локализации α-актинина и зиксина, клетки обрабатывали препаратом, разрушающим актин, цитохалазином D.Мы обнаружили, что, в отличие от ингибирования кальпаином, цитохалазин D нарушал формирование фокального комплекса с потерей фокальных адгезий как в центре клетки, так и на периферии, и не приводил к специфическому нарушению совместной локализации α-актинина и зиксина (данные не показано). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что кальпаин регулирует состав фокальных спаек и специфическую локализацию α-актинина в участках адгезивных комплексов.

    Крупные самособирающиеся клатриновые решетки спонтанно разбираются без достаточного количества адапторных белков

    Abstract

    Покрытые клатрином структуры должны собираться на клеточных мембранах для интернализации рецепторов, при этом клатриновый белок связан с мембраной только через адаптерные белки.Эти структуры могут вырастать на удивление большими, содержащими более 20 клатрин, однако они часто не могут образовывать продуктивные везикулы, вместо этого прерываясь и разбираясь. Мы показываем, что клатриновые структуры такого размера могут как образовываться, так и разбирать спонтанно, когда доступность адапторного белка низкая, несмотря на высокое содержание клатрина. Здесь мы объединяем недавние кинетические измерения in vitro с микроскопическим моделированием реакции-диффузии и теорией, чтобы дифференцировать механизмы стабильной и нестабильной сборки клатрина на мембранах.В то время как условия in vitro стимулируют сборку надежных, стабильных решеток, мы показываем, что концентрации, геометрия и уменьшение размеров в физиологических условиях не поддерживают нуклеацию, если включен только ключевой адаптер AP-2 из-за его недостаточного количества. Для нуклеации требуется, чтобы стехиометрия адаптера к клатрину превышала 1:1, а это означает, что для успешного и эффективного формирования решеток необходимы дополнительные типы адаптеров. Мы показываем, что критическое ядро ​​содержит ~ 25 клатрина, что очень похоже на размеры переходных и абортивных структур, наблюдаемых in vivo .Наконец, мы количественно оцениваем стоимость изгиба мембраны под нашими изогнутыми клатриновыми решетками, используя модель сплошной мембраны. Мы обнаружили, что стоимость изгиба мембраны может быть в значительной степени компенсирована энергетическим преимуществом формирования изогнутых, а не плоских структур, с цифрами, сравнимыми с экспериментами. Наша модель предсказывает, как плотность адаптера может настраивать покрытые клатрином структуры от переходного состояния к стабильному, показывая, что активное потребление энергии, следовательно, не требуется для разборки или ремоделирования решетки во время роста, что является важным шагом вперед в прогнозировании образования продуктивных пузырьков.

    Резюме автора

    Стохастическая самосборка покрытых клатрином структур на плазматической мембране необходима для транспорта в клетки. Здесь мы показываем, что даже при большом количестве доступного клатрина надежное зародышеобразование и рост в стабильные структуры на мембранах невозможны без достаточного количества адапторных белков. Таким образом, наши результаты обеспечивают количественное обоснование того, почему структуры, которые, как наблюдается, формируют in vivo , все еще могут спонтанно распадаться в течение многих секунд.Хотя разборка клатрина после образования продуктивных везикул требует работы АТФаз, наше исследование показывает, что для контроля ремоделирования во время роста не требуется активного ввода энергии. С параметризацией относительно кинетики сборки in vitro на мембранах наша модель реакции-диффузии обеспечивает мощный и расширяемый инструмент для установления детерминант продуктивной сборки в клетках.

    Образец цитирования: Guo S-K, Sodt AJ, Johnson ME (2022) Большие самособирающиеся решетки клатрина спонтанно разбираются без достаточного количества адапторных белков.PLoS Comput Biol 18(3): е1009969. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009969

    Редактор: Peter M. Kasson, Университет Вирджинии, США

    Получено: 23 октября 2021 г.; Принято: 24 февраля 2022 г .; Опубликовано: 21 марта 2022 г.

    Эта статья находится в открытом доступе, свободна от каких-либо авторских прав и может свободно воспроизводиться, распространяться, передаваться, изменяться, дополняться или иным образом использоваться любым лицом в любых законных целях.Работа доступна в качестве общественного достояния Creative Commons CC0.

    Доступность данных: Все соответствующие данные содержатся в рукописи и файлах вспомогательной информации. Программное обеспечение и исполняемые входные файлы для используемых здесь моделей предоставляются с открытым исходным кодом по адресу github.com/mjohn218/NERDSS.

    Финансирование: M.E.J. с благодарностью отмечает финансирование от Национального института здравоохранения MIRA Award R35GM133644. А.Дж.С. поддерживается Программой внутренних исследований NIH.Спонсоры не участвовали в разработке дизайна исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

    Введение

    Опосредованный клатрином эндоцитоз (CME) является важным путем, используемым всеми эукариотами для транспорта через плазматическую мембрану [1]. Вирусная инфекция и рак могут быть результатом сбоев в транспорте грузов и рецепторов [2]. Для надлежащей интернализации рецептора тримерные клатриновые белки должны собирать гексагональную решетку на мембранах (называемые клатрин-покрытыми структурами), которые в конечном счете изгибают мембрану в отпочковавшиеся клатрин-покрытые везикулы [3].Однако зарождающиеся структуры, покрытые клатрином, превращаются в продуктивные везикулы примерно в половине случаев [4], в противном случае они разбираются. Эти переходные и абортивные структуры содержат по меньшей мере ~20 клатриновых тримеров [3], обеспечивая достаточное количество тримеров для сборки множественных субъединиц с гексагональной петлей. Такая относительно большая (~120 нм в диаметре), устойчивая (несколько секунд) [4] и сшитая структура может показаться слишком стабильной, чтобы ее можно было спонтанно разобрать (то есть без энергетического воздействия).Действительно, известно, что разборка полных покрытых клатрином везикул требует энергозатратной работы АТФазы [5,6]. Однако для созревающих структур , покрытых клатрином, в некоторых экспериментах наблюдали АТФазу в местах созревания [7], в то время как в других ее наблюдали редко [8,9]. Кроме того, хотя было показано, что несколько ассоциированных с клатрином белков (таких как адапторные белки) регулируют частоту разборки в переходных структурах [3, 4, 10, 11], сложность, связанная с десятками белков, которые функционируют в клатрин-опосредованном эндоцитозе делает неясным, по какому механизму каждый белок настраивает разборку.Таким образом, остаются фундаментальные вопросы: являются ли некоторые покрытые клатрином структуры достаточно динамичными и нестабильными, чтобы самопроизвольно разрушаться, и если да, то какие факторы могут контролировать эту стабильность? Решение этих нерешенных вопросов поможет установить, при каких условиях покрытые клатрином структуры развиваются в продуктивные везикулы. Здесь наши симуляции рекрутирования и сборки клатрина на мембранах воспроизводят кинетические данные in vitro , подтверждая модель, которая затем устанавливает, как ключевые параметры плотности адаптера, отношения объема к площади ( V / A ) и концентрации клатрина влияют на кинетику и критические ядра структур, покрытых клатрином, на мембранах.

    Хотя эксперименты in vivo обеспечили детальное понимание динамики зародышеобразования и почкования клатриновой оболочки [12,13], многокомпонентная и неравновесная природа сборки означает, что многие возможные механизмы могут регулировать разборку. Например, известно, что липидные ферменты присутствуют во время созревания оболочки и могут динамически изменять состав мембраны [14,15], а вышеупомянутые АТФазы могут влиять на структурную стабильность и динамику [5,6].К счастью, покрытые клатрином структуры могут быть восстановлены in vitro , где было показано, что они прочно собираются на мембранах с клатрином и минимальным набором компонентов [16-18]. В частности, для образования оболочки необходим клатрин, цитозольный адапторный белок, который локализует клатрин на мембране, и сайты связывания мембраны, которые локализуют адапторы на мембране [16–18], который физиологически является незаменимым липидом PI(4,5)P 2 . Однако, поскольку эти эксперименты сообщают об условиях, которые приводят прочные и стабилизированные решетки в равновесие, они не сообщают, какая стехиометрия клатрина, адаптеров и площади мембраны определяет переход от нестабильных клатриновых оболочек к стабильным.Кроме того, хотя концентрации белковых компонентов in vitro часто сопоставимы с зарегистрированными значениями in vivo, соотношение V / A обычно на несколько порядков выше, чем в клетках. Соотношение V / A важно, потому что, когда белки в растворе (3D) могут локализоваться на двумерной поверхности, они могут использовать уменьшение размеров для резкого повышения стабильности комплексов, связанных с мембраной, что находится под сильным влиянием V . / A значений [19].Таким образом, неизвестно, могут ли структуры, покрытые клатрином, самопроизвольно разбираться или требуется энергетическое воздействие.

    Кинетические измерения предоставили мощную переменную для оценки как моделей, так и механизмов сборки растворов в различных системах формирования филаментов [20,21], агрегации [22,23] и капсидообразовании [24]. В недавних кинетических экспериментах Sarkar и Pucaydil [25] отследили клатрин с флуоресцентной меткой по мере его накопления на мембранах с прикрепленными адаптерами. Таким образом, эти эксперименты количественно определяли временные масштабы локализации клатрина на мембранах при четко определенных начальных условиях, которые приводили к надежной сборке, в то время как предыдущие биохимические эксперименты ограничивали свободную энергию связывания взаимодействий клатрин-клатрин [26] и клатрин-адаптор [27].Чтобы оценить размер и время жизни стабильных ядер, поскольку они могут встречаться в клетке, модели должны имитировать более низкое соотношение V / A клетки, воссоздавая эти эксперименты in silico в новых условиях, которые являются сложными экспериментально. Преимущество используемого здесь типа микроскопического пространственного моделирования состоит в том, что вместо того, чтобы требовать проведения экспериментов при многих различных концентрациях для подгонки уравнений скорости к данным [23], наши явные физические модели жестко ограничивают подмножество констант скорости, которые могут дать количественную оценку данных. .

    Моделирование сыграло важную роль в понимании принципов сборки с клатриновым покрытием, хотя каждая модель, включая нашу, должна идти на компромиссы. Чтобы позиционировать нашу модель и исследование по сравнению с другими, мы определяем элементы модели или вопросы, которые как включены, так и исключены из опубликованных исследований. Моделирование, основанное на пространственных моделях сборки клатрина в растворе [28-32], определило, как энергетика и стехиометрия клатрина-адаптера могут контролировать образование клетки [29], хотя и без мембранной локализации или кинетики.Моделирование образования клеток на мембранах характеризовало ремоделирование или структурные изменения клеток, но без учета зависимости от стехиометрии адаптера, концентрации клатрина или отношения объема к площади [33-37]. Термодинамические модели предсказывают размеры клеток в растворе без включенных адаптеров [38, 39], в то время как стохастические 1D модели предсказывают срок службы клеток, но не имеют структуры, стехиометрии или локализации в мембране [40, 41]. Мезомасштабные модели, которые предсказывают, как плотность клатрина управляет почкованием мембраны, изучали продуктивную сборку клатрина без явных белковых компонентов или зависимости от времени [42-44].Непространственные кинетические модели могут предсказывать временную зависимость сборки множественных клатрин-ассоциированных белков, но не учитывают, как стехиометрия или кооперативность клатрина и структура контролируют нестабильную сборку решетки по сравнению со стабильной сборкой на мембранах [45,46]. Таким образом, предыдущие модели не определили ни количественно, ни качественно минимальные критерии стабильного зарождения и роста клатриновых решеток на мембранах, где это биологически значимо. Наша модель здесь способна количественно определить минимальные критерии стабильного роста по сравнению с переходными и нестабильными структурами с помощью недавно разработанного программного обеспечения для реакции-диффузии с разрешением структуры [47], которое фиксирует грубую молекулярную структуру [31] для многокомпонентных систем в 3D [48]. ], 2D [49] и переход между ними [50].

    В этой статье мы впервые вводим модель реакции-диффузии (РД), детализируя присутствующие компоненты, фиксированные кинетические и геометрические параметры, а также «свободные» параметры, которые оптимизированы для получения согласия с экспериментальной кинетикой. Мы описываем, как уменьшение размерности (изменение в пространстве поиска и динамике, которое сопровождает переход от 3D к 2D [51]) строго учитывается в нашей модели, показывая, как это количественно влияет на стабильность [19] и кинетику [52] этапов сборки. .Используя нашу модель, оптимизированную для экспериментов in vitro , мы можем затем изучить зародышеобразование и рост клатриновой оболочки при физиологическом соотношении V / A . Мы варьируем плотность адаптера, чтобы определить количество и стехиометрию адаптеров, необходимых для эффективного и стабильного формирования решетки. Наши симуляции предоставляют подробную информацию о каждом мономере клатрина и структуре более высокого порядка по мере их эволюции во времени и пространстве. Таким образом, используя концепции классической теории нуклеации, мы можем впервые количественно определить количество критических ядер в зависимости от плотности адаптера, показав, что даже при обильной концентрации клатрина минимальная плотность адаптера необходима для запуска нуклеации и продолжения роста в соответствующих физиологических временных масштабах. ~ 60 с).Компромисс в нашем модельном подходе заключается в том, что мы не связали динамически сборку клатриновой решетки с почкованием мембраны. Таким образом, хотя мы можем уловить кинетику локализации и сборки на мембране, отслеживая сборку плоской решетки, что согласуется с наблюдаемым ранним ростом [53], мы независимо изучаем механическую энергию изгиба мембраны. Мы отмечаем, что in vitro клатрин собирает как плоские, так и пузыревидные решетки [16-18], точно так же, как это наблюдается in vivo [53,54].В частности, мы рассчитываем энергию сплошной мембраны, форма которой была изменена для оптимизации ее энергии изгиба в условиях ограничений от предварительно собранных изогнутых каркасов решения. Мы сравниваем эти энергетические затраты с энергией, которую можно было бы ожидать от формирования изогнутой над плоской решеткой по сравнению с экспериментом. Мы обсуждаем связи нашей модели с другими системами самосборки и направления дальнейшего развития модели.

    Модели и методы

    Моделирование реакции-диффузии (RD)

    Моделирование всех моделей, кроме модели сплошной мембраны, выполняется с использованием программного обеспечения реакции-диффузии NERDSS [47].Программное обеспечение распространяет стохастические RD на основе частиц и структурного разрешения. NERDSS использует алгоритм взвешивания свободного пропагатора (FPR) [48], полученный для модели Смолуховского [55] диффузии с реактивными столкновениями между частицами, восстанавливая точную кинетику ассоциации и равновесия. Алгоритмы в NERDSS были тщательно проверены для динамики реакции в 3D [48], 2D [49], от 3D к 2D [50], а также со структурным разрешением и вращательной диффузией [31]. Мы используем временной шаг Δt = 3 мкс.Точность и воспроизводимость результатов моделирования проверяются с использованием меньшего временного шага (рис. A (B) в тексте S1).

    Если кратко резюмировать решатель [47], каждый белок/молекула в системе имеет жесткую структуру, состоящую из точечных координат частиц для каждого интерфейса связывания (рис. 1). Система первоначально заселена молекулами, размещенными случайным образом в объеме или на поверхности. На каждом временном шаге моделирования RD каждый белок либо диффундирует (трансляция и вращение), либо подвергается реакции.Реакции оцениваются в первую очередь, в том числе 0 th создание заказа и 1 st уничтожение заказа, все моделируются как процессы Пуассона. Каждый связанный комплекс оценивают на диссоциацию (1-й порядок ). Наконец, каждая пара реагирующих интерфейсов, находящихся на расстоянии столкновения, оценивается на наличие событий привязки. Вероятности реакции для событий связывания рассчитываются из решения функции Грина (GF) уравнения диффузии, описывающего разделение r между двумя частицами с реактивным граничным столкновением, происходящим при радиусе связывания r = σ , параметризованном выражением собственная скорость k a [48].ПФ и размерность скорости k a зависят от размерности реакции. Если для членов одного комплекса не происходит никакой реакции (наиболее распространенный результат при малых временных шагах), весь комплекс рассеется как твердое тело. Для поступательной диффузии смещения в каждом измерении определяются с помощью простых броуновских обновлений, где R x — стандартное нормальное распределение, то же самое в y и z и D

    3 x — коэффициент диффузии в направлении x .Для вращательной диффузии комплекс вращается вокруг каждой из глобальных осей x, y и z на угол , где D Ri является коэффициентом вращательной диффузии вокруг определенной оси. Новые позиции отбрасываются и передискретизируются, если они нарушают исключенный объем границ раздела реагентов.

    Рис. 1. Реакционно-диффузионная модель с разрешением структуры для рекрутирования и сборки клатрина на мембранах фиксирует структуру, валентность и исключенный объем.

    Тримеры Clathrin инициализируются в растворе, но связываются с адапторными белками, локализованными на поверхности.Clathrin связывается с адаптерами только после локализации адаптеров на поверхности, что согласуется с поведением адаптера AP-2 [16]. Белки-адаптеры могут связывать специфические липиды на поверхности мембраны при инициализации в растворе. Сайты клатрин-клатрин и сайты клатрин-адаптер исключают друг друга с радиусом σ = 5 нм (синие кружки) и σ = 1 нм соответственно, но только когда они не связаны; связанные сайты не исключают объем. Таким образом, всегда в моделировании центры масс (ЦМ) на тримерах исключают другие ЦМ тримера на σ = 10 нм (фиолетовые кружки), чтобы решетки не перекрывались друг с другом.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009969.g001

    Ориентация осуществляется только после того, как события связывания приняты между двумя комплексами (или молекулами). Как подробно описано в предыдущей работе [31], это позволяет нам напрямую связать микроскопические параметры, включая скорость k a , с макроскопическими скоростями, измеренными экспериментально, k на . В 3D, например, k на = (1/ k a +1/4 πσD ) −6 905 0 , где −6 4 , где обеих молекул с эффективной поправкой на вращающиеся молекулы [31] (формулы для каждого измерения см. в [47]).Когда происходит связывание, два комплекса перемещаются для контакта на радиусе связывания σ и «защелкиваются» в соответствии с заранее заданной ориентацией для реакции из входных данных моделирования. События связывания, вызывающие стерическое перекрытие в системе, отбрасываются. Мы также отвергаем события связывания, которые вызывают нефизически большое вращательное движение комплексов, где мы подтвердили, что это ограничение не оказывает существенного влияния на кинетику ассоциации, ожидаемую от скорости k a (рис. B в тексте S1 и тексте A). в тексте S1).Сайты связывания, ограниченные мембраной, моделируются с использованием неявного липидного алгоритма, который воспроизводит ту же кинетику и равновесие, что и более дорогой явный липидный метод [50]. Программное обеспечение и исполняемые входные файлы для используемых здесь моделей предоставляются с открытым исходным кодом по адресу github.com/mjohn218/NERDSS.

    Компоненты модели и структурные детали

    Чтобы воспроизвести количественную кинетику недавно измеренной сборки клатрина на мембранах [25], наша модель фиксирует грубую структуру тримера клатрина и его адаптерного белка, константы диффузии белка (и мультибелка), скорости, описывающие все парные белок-белковые взаимодействия. , а концентрации и соотношение V / A эксперимента.Каждый тример жесткого клатрина содержит 3 сайта для связывания другого клатрина, образующих плоскую или изогнутую гексагональную решетку в зависимости от угла «морщинистости» α ножек относительно оси z (рис. 1). Каждый тример также содержит 3 сайта для связывания адаптеров. Каждый адаптер содержит один сайт для клатрина и один сайт для связывания мембранного липида. Парные реакции между интерфейсами компонентов модели представлены на рис. 2. Масштабы длины белков выбраны в соответствии с известным размером решетки клатрина [56] с межцентровым расстоянием 17 нм.Адаптеры моделируются в виде стержней с сайтом связывания, который связывается с клатрином на 4 нм выше поверхности мембраны. Мы моделируем адаптеры как неявно (для модели in vitro), так и явно (для модели , подобной физиологической ). Неявные адаптеры не отсоединяются от поверхности, в отличие от явных адаптеров. Исключенный объем (рис. 1) необходим для предотвращения перекрытия клатриновых решеток при их диффузии в 3D или 2D. Хотя алгоритм FPR естественным образом фиксирует исключенный объем между сайтами реактивного связывания, эти сайты больше не исключают объем после связывания.Поэтому мы добавили исключенный объем между клатрином COM, который, как мы убедились, не изменил кинетику (рис. A (A) в тексте S1). Когда две молекулы связываются через свои специфические сайты взаимодействия, они принимают заранее заданную ориентацию относительно друг друга. На мембранах клатрин образует плоскую гексагональную решетку без дефектов (α = 90 o ). В растворе мы собираем сферические клетки (α>90 o ), состоящие из шестиугольников, пятиугольников и несовершенных контактов из-за жесткости тримеров [47].Несовершенные контакты по-прежнему способны образовывать связи при заданном пороге 5,5 нм (текст A в тексте S1), что способствует стабилизации решетки. В предыдущей работе мы проверили предельные расстояния, которые поддерживают физически разумную структуру решетки с незначительным влиянием на кинетику сборки [47].

    Рис. 2. Реакционная сеть для модели фиксирует энергетику и кинетику связывания в 3D, 2D и между 3D и 2D.

    Для компонентов клатрина (обозначенного C), адаптера (A) и липида (P) между соединенными интерфейсами происходят только специфические реакции, показанные черными стрелками.В легенде указано, какие параметры для каждой реакции указаны, где 2D-реакция связана с соответствующей 3D-реакцией через шкалу длины ч из-за изменения размерности поиска. Когда образуется комплекс клатрин-адаптер (C.A), он сильнее связывает другой клатрин через Δ G coop . Нижняя панель показывает, как добавление мономера может замкнуть гексагональную петлю. Свободная энергия образования обеих связей моделируется с отрицательной кооперативностью через штраф за энергию Δ G напряжение .

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009969.g002

    Транспорт

    Мы оцениваем транспортные свойства от уравнения Стокс-Эйнштейна, с D CLA = 13 мкм 2 / с, D R, CLA = 0,03 RAD 2 / μs, D AP = 25 мкм 2 / с, d R, AP = 0,5 рад 2 / мкс, D Липид, X, Y = 0,5 мкм 2 / с, D Липид, z = 0 и D R, lid, z = 0.01rad 2 /мкс, чтобы позволить связанным комплексам вращаться на поверхности. Диффузия замедляется по мере роста комплексов, что согласуется с предположением, что гидродинамический радиус комплекса представляет собой сумму составляющих [31]. В частности, для комплекса с N молекул коэффициенты переноса равны: и . Например, адаптерные белки на мембране имеют константу поступательной диффузии в x , y , равную 0,49 мкм 2 /с.

    Энергетические и кинетические параметры

    Мы зафиксировали несколько энергетических параметров на основе экспериментальных данных, тогда как свободные параметры приведены в таблице 1.Мы используем фиксированные константы диссоциации K D = 120 мкМ для клатрин-клатрин (без адаптера) [26] и 25 мкМ для связывания клатрин-адаптер [27]. Из экспериментов давно известно, что клатрин-клатрин К D упрочняется, когда клатрин связывается с адаптером [57], но в какой степени количественно не установлено. Поэтому мы вводим переменную ∆ G coop , чтобы зафиксировать это. В частности, используя , где c 0 — концентрация в стандартном состоянии (1M), свободная энергия связи без связанных адаптеров равна А с адаптером связанным это δ G + AP2 = Δ G 54 = δ G 5 —AP2 G 54 + δ G Coop , где K B — постоянная Больцмана и T — это температура.Мы проверили значения Δ G coop в диапазоне от -1,1 до -3 k B T после того, как установили, что при Δ G coop = 0 не удалось воспроизвести наблюдаемую кинетику. Мы сохраняем скорость диссоциации клатрин-клатрин неизменной и увеличиваем скорость включения на f coop = exp (−Δ G coop / k B T ).

    Таблица 1. Каждый параметр варьировался в модели RD, чтобы воспроизвести экспериментальную кинетику in vitro вместе с найденными нами оптимальными значениями.

    Другие энергии, геометрии и концентрации были зафиксированы экспериментальными данными.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009969.t001

    Наша модель учитывает изменения скоростей и констант равновесия, которые сопровождают локализацию на двумерной мембране [58,59], где модель решает ограниченные реакции к поверхности на основе двумерной диффузии с двумерными константами скорости, которые имеют различные единицы мкм 2 /с [49]. Скорость преобразования из 3D в 2D наиболее компактно определяется шкалой длины молекулы ч , что приблизительно соответствует диапазону высот, в котором находится связанная с мембраной молекула, что дает .Поскольку ч фундаментально зависит от энтропийного и энтальпийского вклада в связывание, которое изменяется после ограничения эффективной двумерной поверхностью мембраны, оно зависит от пары специфического связывания и, таким образом, не может быть точно предсказано без экспериментального анализа или анализа, основанного на молекулярном моделировании. 58,59]. Тем не менее ожидается, что он будет иметь нанометровый масштаб [58]. Поэтому для 2D-взаимодействий с участием клатрина мы рассматриваем его как свободный параметр и тестируем значения h = 1-100 нм, порядок величины шкалы длины молекулярного клатрина.Мы предполагаем, что микроскопические константы диссоциации одинаковы в 3D и 2D, т.е. Соединение между K D значения и скорость константы для каждой реакции фиксированы через k k = K от / K на = K B / к и .

    Вводим энергию деформации Δ G деформацию для образования замкнутых многоугольников (шестиугольников или пятиугольников) (рис. 2).Когда решетка клатрина образует замкнутый шестиугольник (или пятиугольник), диссоциация одиночной связи клатрин-клатрин не приводит к высвобождению мономера или фрагмента. Отношение скорости повторного связывания к скорости несвязывания выражается как , где Δ G CC — разность свободной энергии несвязанной и связанной пары клатрина [47]. Этот термин используется просто для парной реакции, дающей коэффициент повторного связывания 8,3×10 3 или 9,2×10 4 для клатрин-клатриновых связей без и с адаптером, соответственно, когда Δ G штамма = 0.Гораздо более высокие скорости повторного связывания делают шестиугольники очень устойчивыми к диссоциации. Таким образом, термин снижает стабильность шестиугольника по сравнению с 6 идеальными связями (для Δ G штамм >0). Есть несколько причин, по которым мы могли бы ожидать этого, поскольку клатрин представляет собой гибкую молекулу, которая образует различные решетки и клетки. Формирование двух связей для замыкания шестиугольника/пятиугольника может привести к упругой деформации клатрина, снижая его стабильность. Некоторые решетки in vivo , особенно плоские решетки, также образуют крайне несовершенные «шестиугольники», которые явно имеют плохо выровненные контакты [60], что способствует менее стабильной и более динамичной решетке.При значении Δ G штамма +6,9 k B T (это значение снижает сродство связывания в 10 3 раз для образования замкнутых многоугольников) свободная энергия гексагонального 6- мера соответствует прочности 5,4 идеальных связей, а не 6 (например, [6Δ G CC + Δ G штамм ]/Δ G CC ), тогда как 6-мер в расширенной конформации содержит 5 связей.

    Симуляции для моделирования экспериментов in vitro

    Экспериментальный V был 200 мкл [25], а экспериментальный A 2.017×10 8 мкм 2 рассчитывают на основе 1 нмоль общего липида, со средней липидной SA 0,7 нм 2 и двухслойным бислоем, образующим множество длинных цилиндрических трубочек. Экспериментальное соотношение V / A составляет 991 мкм. Хотя наши симуляции не могут отразить топологию мембран отдельных канальцев, сохраняя ту же площадь поверхности по отношению к объему и местам связывания, что и в экспериментах, наша упрощенная плоская поверхность повторяет основную роль мембраны как места рекрутирования и платформы для сборки.Наш объем моделирования имеет плоскую SA 1 мкм 2 , что потребовало бы высоты 991 мкм. Чтобы сохранить то же соотношение V / A без распространения огромного избытка раствора клатрина, вместо этого мы используем высоту 1 мкм и поддерживаем постоянную (стохастически колеблющуюся) концентрацию [Cla] tot = 80 нМ (48 копий). в растворе (рис. 3A и см. текст A в тексте S1). Это предполагает, что общая концентрация клатрина в растворе (экспериментально установлена ​​на уровне 80 нМ [25]) не изменяется по мере того, как клатрин накапливается на мембране, что соответствует очень хорошему приближению, когда <5% всего клатрина оказывается на мембране при 100 секунд.

    Рис. 3. Реакция-диффузионное моделирование кинетики сборки клатрина на мембранах с разрешенной структурой воспроизводит эксперимент in vitro .

    (A) Моделирование было настроено так, чтобы имитировать экспериментальные условия из опубликованной работы Pucadyil et al [25], где флуоресценция клатрина, накапливающегося на мембранных канальцах, измерялась во времени. Постоянную (колеблющуюся) концентрацию клатрина в растворе (80 нМ) поддерживали за счет обмена с резервуаром большого объема.(B) Флуоресценция клатрина на мембранах усреднена по нескольким канальцам (черная линия). Экспериментальные данные флуоресценции приведены в условных единицах [25]. Это означает, что существует свободный коэффициент масштабирования, который мы используем для согласования с нашими симуляциями, которые измеряют накопление клатрина в единицах числа копий на мкм 2 . Результат модели показан синим цветом (усреднено по 4 траекториям моделирования). Как данные моделирования (серая пунктирная линия), так и экспериментальные данные могут быть согласованы с уравнением 1A, создавая шкалы времени (скорость роста k и время запаздывания τ), которые можно непосредственно сравнивать друг с другом.Начальный рост является приблизительно линейным, с крутизной, заданной kE , с E максимальной протяженностью клатрина на мембране (уравнение 1B). (C) Снимки одной траектории симуляции в разные моменты времени, см. также S1 Movie. (D) Макроскопические временные масштабы времени запаздывания τ (черные точки) и начальной крутизны роста 90 604 kE 90 605 (красные точки) изменяются при изменении шести параметров модели, как показано на каждом подграфике D 1 -D 6 и приведены в Таблице 1. Мы наносим начальную крутизну роста 90 604 kE 90 605, а не скорость роста 90 604 k 90 605 , так как она более поддается теоретическим предсказаниям.Пунктирные черные и красные линии представляют собой теоретические подгонки наших феноменологических моделей к τ (уравнение 2) и kE (уравнение 3). Для каждого подучастка неизменяемые параметры в остальном фиксируются на оптимальных значениях из таблицы 1.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009969.g003

    В экспериментах in vitro адаптерные белки сначала вводили в систему для покрытия мембраны, а несвязанные адаптеры вымывали до добавление клатрина [25].Поэтому мы моделируем адаптеры как прикрепленные к мембране, и в нулевой момент времени в растворе нет клатрина. Клатрин вводят посредством реакции 0-го порядка и в конечном итоге поддерживают в растворе при 80 нМ (текст A в тексте S1). В то время как ожидается уравновешивание некоторых связанных адаптеров обратно в раствор, мы рассматриваем плотность адаптера как переменный параметр, как мы опишем ниже. Преимущество их фиксации заключается в том, что мы можем на несколько порядков быстрее моделировать их, рассматривая их как «неявные» сайты связывания [50] для этих симуляций in vitro .Эти сайты имеют высоту 4 нм, что обеспечивает точную кинетику связывания с мембраной, что подтверждается изменением временного шага моделирования (рис. A (B) в тексте S1) и простой системой без реакции клатрин-клатрин (рис. A (C). ) в тексте S1). Плотность адаптеров на мембране до добавления клатрина не была точно зафиксирована в экспериментах in vitro , поэтому плотность адаптеров ( ρ AP ) в моделировании in vitro рассматривается как переменный параметр. .В частности, хотя плотность сайтов связывания с мембраной была известна (0,0746/нм 2 ), мы не ожидали, что все эти сайты рекрутируют адапторы. Для K D в диапазоне 1–10 мкМ [61] между хелатором и His-меченым адаптером (присутствует при 200 нМ) [25] мы ожидаем ~0,0014–0,012/нм 2 адаптеров на поверхности до втекает клатрин, который мы используем в качестве пределов при оптимизации ρ AP .

    Оптимизация

    Шесть параметров, которые мы варьировали для оптимального воспроизведения эксперимента, приведены в таблице 1.Чтобы найти оптимальные параметры, мы провели моделирование, вручную изменяя каждый из этих параметров в два этапа. Первоначально мы выполнили широкое сканирование с одновременным изменением скоростей, взвешенных по Больцману энергий и плотностей адаптеров, где каждый из них варьировался на порядки величины. Хотя мы обнаружили, что кинетика весьма чувствительна к значениям ρ AP и k AP-CLA , в широком поиске мы также установили важность указания Δ G coop значение меньше нуля, а масштаб длины ч был >1нм.В частности, на обоих этапах оптимизации многие смоделированные наборы параметров могли быть прекращены на раннем этапе, поскольку они показывали очень короткое время задержки (<<11 с) или показывали чрезмерно быстрый или медленный рост. Затем мы выполнили более точный поиск, основанный на этом понимании, снова одновременно изменяя параметры в диапазонах, показанных на рис. 3D, где, например, скорость связывания клатрина с AP2 была выбрана от 800M -1 с -1 до 2400M -1 с -1 . Мы решили не использовать основанные на обучении или неуправляемые подходы к глобальной оптимизации, поскольку было просто запустить множество симуляций одновременно по многомерной сетке параметров.Все симуляции с кинетикой, которые можно разумно подогнать к модели с лаг-периодом, за которым следует экспоненциальный рост, приведены в таблице S1. Чувствительность макроскопической кинетики к каждому параметру можно относительно надежно оценить по данным и функциям, показанным на рис. 3D (и рис. 4B), количественно выраженным в уравнениях 2 и 3.

    Рис. 4. Решетки клатрина с физиологической геометрией не собираются, пока концентрация адаптера не достигнет 0,6 мкМ.

    (A) Кинетика самой большой сборки клатриновой решетки быстрее и достигает больших размеров с увеличением концентрации адаптера.Все симуляции содержат 0,65 мкМ клатрина. (B) Время запаздывания и крутизна начального роста, определенные при моделировании (черные и красные точки соответственно), относительно хорошо следуют теоретическим выражениям уравнений 2 и 3. Мы исключили низкие концентрации, где кинетика плохо описывается моделью запаздывания и экспоненциального роста уравнения 1. (C) Время запаздывания обычно медленнее в этих геометрически физиологических моделях и ограничено скоростью локализации клатрина на мембране. (термин 1 в уравнении 2) с гораздо меньшим количеством сайтов связывания адаптера, чем in vitro .(D) Размер самых больших решеток увеличивается с увеличением концентрации адаптера, переходя от малых к большим решеткам при ~ 0,8 мкм (черные квадраты). В этот момент стехиометрия клатрин:адаптер достигла 1:1 (оранжевые кружки).

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009969.g004

    Экспериментальные данные имеют произвольные единицы по оси Y, что означает, что эти значения должны быть пересчитаны в соответствии с нашими данными. Следовательно, это также означает, что для оптимального воспроизведения экспериментальных данных нам важны только временные масштабы (которые не выражены в произвольных единицах).Оптимальная модель, о которой мы сообщаем, имела наилучшее соответствие как времени запаздывания (τ), так и скорости роста (90 604 k 90 605), наблюдаемым экспериментально. Чтобы отобразить экспериментальные данные по той же оси Y, что и наше моделирование, мы обнуляем смещение по оси Y (вычитаем из 300) и масштабируем высоту на 1,7. Это преобразование не влияет на измеренное время задержки или скорость роста.

    Моделирование для моделирования физиологических экспериментов

    В «физиологических» условиях мы позволяем белку AP-2 обратимо связываться с мембраной и предотвращаем связывание этого полноразмерного AP-2 с клатрином в растворе, поскольку экспериментально наблюдается, что связывание ингибируется до локализации мембраны. [16].Значения числа копий клатрина и AP-2 в клетках HeLa, наряду с размерами клеток, взяты из работы [62], составленной из экспериментальных исследований [63]. Для АР-2 мы изначально использовали концентрацию лимитирующей субъединицы (0,2 мкМ), а для тримеров клатрина использовали копии тяжелой цепи клатрина, разделенные на 3 (0,65 мкМ). Отношение V / A для объема цитоплазмы к площади поверхности плазматической мембраны составляет ~ 0,5–2 мкм [19], и здесь мы установили его равным 1 мкм, аналогично значению для клетки HeLa [62].Наш смоделированный A имеет размеры 0,7×0,7 мкм и высоту 1 мкм. Примечательно, что это означает, что мы явно фиксируем соотношение V / A , и больше нет резервуара растворенных белков, поэтому общее количество копий фиксировано; каждый белок, который связывается с мембраной, истощает запас, остающийся в растворе, в отличие от моделирования in vitro . При этих концентрациях, если все молекулы АР-2 локализуются на мембране при концентрации 0,6 мкМ, их максимальная поверхностная плотность составляет 361 копий/мкм 2 , что намного ниже плотности in vitro (9000/мкм 2 ).

    Моделирование Клатрина в растворе

    Для моделирования растворов используется та же конфигурация системы, что и для физиологической системы, за исключением того, что на мембране отсутствуют сайты связывания, что препятствует любой локализации. Клатрин присутствует в количестве 0,65 мкМ с различной концентрацией АР-2. Единственная модификация модельных реакций заключается в том, что AP-2 теперь может связываться с клатрином в растворе, как если бы присутствовал только домен придатка (а не полный аутоингибируемый белок). Клатрин «сморщен» для образования сферических клеток с использованием углов α = 98° (см. рис. 1) и более мягкой кривизны 96°, что приводит к образованию клеток большего размера.

    Мембрано-механические расчеты

    Для механических расчетов мембран сплошная мембрана представлена ​​сплайном, непрерывным по кривизне, с помощью алгоритма поверхности предела подразделения, как в [64]. Первоначально плоская поверхность, образованная приблизительно шестиугольными треугольниками, использует периодические граничные условия с длиной стороны 700 нм для площади 4

    нм

    2 . Энергия мембраны определяется гамильтонианом Хелфриха, как описано в [64], и параметризуется модулем изгиба κ = 20 k B T и спонтанной кривизной, равной нулю, что означает, что поверхность предпочитает быть плоским.Затем мембрана соединяется с жесткой клатриновой клеткой (предварительно собранной на основе моделирования NERDSS) с помощью набора гармонических потенциалов связи, по одному для каждого клатрина. Для каждой гармонической связи виртуальный сайт располагался примерно в 9 нм от COM клатрина (примерно 7,5 нм от сайтов-адаптеров). Также была предпринята попытка приблизить расстояние на 2,5 нм с сопоставимой энергетикой (в пределах 2%). Расстояние между виртуальным участком и пластырем мембраны определяли, как в [50]. Затем энергию мембраны минимизировали с помощью градиентного спуска.Эта ближайшая точка на мембране, помеченная локальными координатами поверхности (координаты лица и внутренние треугольные координаты), была сохранена в течение 50 «подитераций» алгоритма класса сопряженных градиентов Бройдена-Флетчера-Гольдфарба-Шанно (BFGS). Был найден график минимизации, дающий робастные подгонки. Гармонические силовые константы постепенно увеличивались в три раза, начиная с 0,0003 и заканчивая 100 ккал/моль/ангстрем 2 . Клатриновой клетке позволяли смещаться и вращаться во время минимизации.

    Результаты

    Наша модель дает количественное согласие с

    in vitro кинетикой накопления клатрина на мембранах

    Мы выполнили моделирование, имитирующее экспериментальные условия in vitro (рис. 3А), используя модель, предназначенную для регистрации структурных (рис. 1), энергетических и кинетических свойств (рис. 2 и модели и методы) компонентов клатрина и адаптерного белка. . Изменяя 6 параметров, перечисленных в таблице 1, мы определили модель, которая воспроизводит зависящую от времени кинетику, наблюдаемую экспериментально (рис. 3B и 3C и фильм S1).Чтобы упростить сравнение кинетики мембраносвязанного клатрина, [CLA] mem ( t ), мы подгоняем все кривые к экспоненциальному росту после плоского лаг-периода, объясняемого ступенчатой ​​функцией Хевисайда H, которая равна нулю. до τ и один после: (1А) (1Б)

    Имеется четыре подходящих параметра. Основными двумя временными масштабами являются время запаздывания τ и скорость роста k , в то время как максимальная степень накопления клатрина, наблюдаемая в ходе численного моделирования, определяется как E , а b позволяет компенсировать накопление клатрина во время время задержки, поскольку рост не является полностью ровным ни в моделировании, ни в эксперименте.Наша оптимальная модель фокусирует сравнение только на воспроизведении двух временных шкал из-за произвольных единиц флуоресценции для b и E , полученных из эксперимента. Наша оптимальная модель (см. параметры таблицы 1) дает временные масштабы [ τ , 1/ k ] = [13 с, 121 с], которые отлично согласуются с экспериментом [11 с, 107 с]. Несколько других протестированных моделей дали худшее согласие в кинетике (рис. 3D, рис. C в тексте S1 и таблице S1), где на рис. линейный, как отмечено в уравнении 1B.Размер решетки клатрина ограничивает [CLA] мкм ~ 5000 клатрин/мкм 2 (~ 201 нм 2 на тример). Из-за большого избытка клатрина в растворе как в эксперименте, так и в моделировании может произойти насыщение клатрина на поверхности, и мы обнаружили, что насыщение происходит в первую очередь из-за потери доступной площади поверхности, а не из-за потери сайтов связывания адаптера.

    Для воспроизведения экспериментальной кинетики требуется взаимодействие как уменьшения размеров, так и связывания адаптера

    Быстрый рост кинетики после начального отставания от очень медленного роста является отличительной чертой кооперативности.Наша модель охватывает два источника сотрудничества. Во-первых, эксперименты установили, что как только клатрин связывается с адапторными белками, его сродство к другим клатринам увеличивается [57]. Основываясь на наших симуляциях, где K D без адаптера фиксировано [26], наша оптимальная модель предсказывает, что сродство с адаптером увеличивается примерно на 2,4 k B T , что приводит к более быстрому и более стабильное связывание. Для более слабой кооперативности как время задержки, так и крутизна роста слишком медленные (рис. 3D, первый график).Во-вторых, как только клатрин локализован на поверхности, он будет использовать уменьшенное геометрическое пространство поиска поверхности (уменьшение размеров) для повышения стабильности своих взаимодействий как с клатрином, так и с адаптерами [19]. Эта повышенная стабильность гарантируется, поскольку коэффициент размерности DF = В /( А·ч ) больше 1 [19], где ч — это шкала длины, контролирующая переход к К . D и k на после 2D локализации (рис. 2 и модели и методы).Наша оптимальная модель предсказывает 90 604 ч = 90 605 30 нм, что является масштабом молекулярной длины, сравнимым с радиусом клатрина, как и ожидается для локализованных в мембране реакций [58]. Меньший h в 1 нм дает слишком быстрый рост, тогда как больший h в 100 нм демонстрирует слишком медленный рост (рис. 3D, третий график и рис. C в тексте S1).

    Время запаздывания в основном контролируется скоростью адсорбции отдельного клатрина на поверхности

    Чтобы лучше понять, как макроскопическая кинетика накопления клатрина на мембране зависит от множества параметров модели, мы разработали приближенные теоретические выражения для времени запаздывания τ и крутизны начального роста кЭ .Наше выражение для времени запаздывания представляет собой сумму трех временных шкал, первая из которых представляет локализацию клатрина на мембране, вторая — зарождение клатрин-клатриновых контактов, а третья — локализацию AP-2 на мембране, которая не равна нулю. только для физиологических симуляций (рис. 4). Первые два термина описывают все симуляции и задаются следующим образом: (2) Где F Coop = Exp (-Δ G Coop / K B T ), размер размерности DF = V / ( AH ), [ CLA ] bulk представляет собой концентрацию клатрина в растворе, а другие переменные приведены в таблице 1.Все три временные шкалы были разработаны эмпирически на основе периода полураспада[65] или среднего времени первого прохождения [52], меняющегося обратно пропорционально скорости x концентрации в каждом члене. На срок локализации также влияют копии сайтов связывания адаптера на мембране ( ρ AP A ), как видно из данных нашего моделирования (рис. 3D, второй график, черные точки). Член зародышеобразования включает контакты клатрин-клатрин, и мы обнаруживаем нелинейную зависимость от фактора размерности ( DF ) и упругой деформации решетки клатрина (Δ G деформации ).Вероятно, это связано с тем, что некоторые клатрины связываются непосредственно с клатрином из раствора, минуя кооперативные механизмы, обеспечиваемые редукцией размеров. Зародышеобразование на поверхности также меньше зависит от общего объема, так как откачивает лишь небольшое количество клатрина.

    Наше выражение для времени задержки имеет 1 параметр соответствия в термине локализации, два в термине зарождения и один в термине локализации AP-2 (см. уравнение A в тексте S1). Эти параметры подгонки были найдены путем глобальной подгонки времени запаздывания всех смоделированных моделей (включая рис. 3D и 4) одновременно по уравнению 2 со всеми включенными переменными модели с использованием нелинейной подгонки в MATLAB.Таким образом, эти же параметры подгонки описывают кинетику всех in vitro и всех физиологических моделей ниже (рис. D в тексте S1, текст A в тексте S1 и таблица S1). В этих симуляциях in vitro время локализации клатрина на мембране составляет около 40 % задержки (первый член в уравнении 2) и, как и ожидалось, наиболее чувствительно как к скорости связывания клатрина с адаптером (рис. 3D пятый график , и рис. C в тексте S1) и плотности адаптера на мембране (рис. 3D, второй график).Зарождение клатриновой структуры (второй термин) требует, чтобы множественные клатрин локализовались в одном положении, что ограничивается, прежде всего, низкой концентрацией клатрина (0,08 мкМ).

    Крутизна начальной кинетики экспоненциального роста контролируется главным образом набором адаптеров

    Как и в случае с τ , мы разработали приблизительное теоретическое выражение для крутизны начального роста kE , которое имело тенденцию следовать гораздо более очевидным тенденциям, чем только скорость роста k .Это выражение мотивировано кинетикой действия масс, учитывая, что оно описывает изменение концентрации клатрина на мембране со временем после начального запаздывания. Мы снова используем сумму трех терминов, первый отражает рекрутирование клатрина адапторами, второй рекрутинг клатрина клатрином, а третий фиксирует рекрутирование адаптеров на мембрану, которое отлично от нуля только для физиологических моделей (рис. 4). ). Первые два термина описывают все симуляции и определяются как: (3)

    Это выражение показывает разумное согласие с нашими данными (рис. 3D, красные пунктирные кривые и рис. 4B).Для моделирования in vitro крутизна роста наиболее чувствительна к первому члену (пропорциональному k AP-CLA ), учитывающему привлечение клатрина к адаптерам. Рост дополнительно усиливается благодаря двумерным взаимодействиям между контактами клатрин-тример-тример и клатрин-адаптор. Варьируя h = k on, 3D / k on, 2D при фиксированном V / A показывает чувствительность к V / A показывает чувствительность к DF на третьем графике, а C рис. Text), что указывает на то, что 2D-привязка необходима для ускорения экспериментального роста.

    Вопреки здравому смыслу, более высокая свободная энергия деформации Δ G штамм замедляет время запаздывания, но увеличивает скорость роста (рис. 3D, шестой график), тогда как все другие параметры вызывают коррелированное замедление запаздывания и роста. Увеличение штрафа за деформацию дестабилизирует замкнутые гексагональные структуры, способствуя разборке, которая замедляет зарождение ( τ отставание ), как и следовало ожидать. Однако последующий рост ускоряется за счет увеличения выборки динамических и неупорядоченных структур с большим количеством «липких концов» или свободных ветвей (1 свободная ветвь/тример в шестиугольнике, 1.33 свободной ноги/тримера в удлиненном 6-члене), который быстрее рекрутирует дополнительный клатрин. Подгонка уравнения 3 к нашим данным была снова выполнена в глобальном масштабе для всех моделей, как и для времени задержки, где это выражение имеет 1 параметр подгонки в первом члене, 3 во втором и 1 в третьем члене (рис. D). в тексте S1, тексте A в тексте S1 и таблице S1).

    Одного AP-2 недостаточно для зарождения решеток в клеточных условиях

    Чтобы охарактеризовать зародышеобразование в более физиологических условиях, мы уменьшили отношение V / A с 991 мкм до 1 мкм, что характерно для клетки HeLa, и увеличили концентрацию тримера клатрина до 0.65 мкМ [63] (Модели и методы). Мы обнаружили, что стабильные решетки не зарождаются, когда мы используем физиологические концентрации AP-2 0,2 ​​мкМ [63] (рис. 4А). По сравнению с системой in vitro значительно уменьшенный V / A приводит к гораздо более низкой плотности AP-2 на мембране (~120 мкм -2 по сравнению с 9000 мкм -2 ), и пространство для всех молекул клатрина на поверхности. Большинство композиций клатрина представляют собой димеры и мономеры со стехиометрией 2 клатрин:1 АР-2, что слишком мало, чтобы индуцировать кооперативность, необходимую для образования ядра (S2 Movie).Увеличивая концентрацию адаптера при фиксированной концентрации клатрина, мы обнаруживаем, что только после того, как мы достигаем 0,7–0,8 мкМ адаптера, мы видим стабилизацию сборок > ~ 50 клатрина с кинетикой, которая демонстрирует как заметное отставание, так и фазу роста (рис. 4A). ). В этот момент соотношение клатрина и адаптера достигло ~ 1: 1 (рис. 4D), и равновесные колебания также являются наибольшими в этой точке, что указывает на переход в росте решетки (рис. E в тексте S1). С повышенным AP-2 клатрин образует более крупные решетки с более коротким временем задержки и более быстрым ростом (Fig 4B).

    Время задержки значительно увеличилось при более низких концентрациях AP-2 (рис. 4B и 4C). Основываясь на нашем теоретическом выражении уравнения 2, основной причиной более длительного времени задержки является первый термин, контролирующий локализацию клатрина на мембране, который становится лимитирующим с меньшим количеством сайтов связывания AP-2 (рис. 4C). Крутизна начального роста также значительно ниже, чем у 90 604 in vitro 90 605, где теперь только несколько клатринов рекрутируются до площади поверхности 2 мкм в секунду (рис. 4B).Здесь снова несколько доступных AP-2 ограничивают набор клатрина на поверхность. Рекрутирование клатрина клатрином также замедлилось из-за чувствительности крутизны к DF при стабилизации контактов клатрин-клатрин на поверхности. Мы отмечаем, что привлечение AP-2 к липидам не ограничивает скорость в этих моделях (третьи члены в обоих выражениях, см. текст A в тексте S1), поскольку покрытие PI(4,5)P 2 составляет ~20000 мкм. -2 (1%), а скорость связывания АР-2 с липидами моделируется относительно быстро, при 0.3 с -1 мкМ -1 (таблица S1).

    Сборка решеток преодолевает начальный барьер с последующим небольшим повышением стабильности во время роста

    Отслеживая размеры решеток, полученные в ходе моделирования, мы можем количественно определить их относительную вероятность на протяжении траекторий в Рис 5А). Эта наблюдаемая в равновесии эквивалентна свободной энергии как функции размеров решетки (рис. 5А).Для более высоких концентраций адаптера в равновесии мы наблюдаем бимодальное распределение в P ( n ) как с очень большими решетками, так и с наличием популяции мономеров и малых решеток. Это приводит к возникновению барьера в −ln P ( n ) при n <~ 25 (рис. 5A и 5C). Это примечательно, так как показывает, что даже при более высокой концентрации адаптера система не переходит полностью в единую структуру с покрытием (что можно было бы ожидать, если бы свободная энергия монотонно уменьшалась с увеличением n ).После того как большая часть раствора клатрина и адаптера сконцентрирована в единую структуру с покрытием, оставшийся и разбавленный клатрин образует небольшие кластеры, которые не устойчивы к разборке. Следовательно, образование стабильных клатриновых решеток локально истощает ресурсы, необходимые для зарождения дополнительных стабильных сайтов. Фаза роста сборки (рис. 5А — желтые точки) дополнительно показывает, как даже после преодоления начального барьера для зародышеобразования при малых n решетки демонстрируют одинаковую стабильность в широком диапазоне размеров, что указывает на динамическое ремоделирование (рис. 5А и 5В).За этой плоской областью следует стабильная яма, которая увеличивается и углубляется по мере того, как система уравновешивается до максимальных размеров решетки, с конечной «стенкой», которая предотвращает дальнейший рост. Эта стенка возникает из-за недостаточности адаптеров для стабилизации роста на периферии решетки, оставляя после себя разбавленную фазу клатрина.

    Рис. 5. Решетки клатрина начинаются как мономеры, которые сталкиваются с начальным барьером для роста, при этом стабильный размер достигается только после значительного роста.

    (A) Вероятность наблюдения клатриновых решеток размером 90 604 n 90 605 может быть преобразована в энергоподобную метрику −ln ( 90 604 P 90 605 ( 90 604 n 90 605 )), которая в равновесии представляет собой истинную свободную энергию в единицах 90 604 к Б Т .Начальный барьер (в n ) для плато зарождения, за которым следует относительно плоская область, где структуры имеют сопоставимую вероятность. На всей зависящей от времени траектории, показанной на верхней вставке, мы анализируем выборки решеток по всей траектории (зеленые точки), фазе роста (желтые точки) и равновесию (оранжевые точки). Во время роста клатрин образует решетки промежуточного размера, в то время как в равновесии видны только малая и крупная решетки. [AP2] = 1,6 мкМ. (B) Чтобы количественно определить конец начального барьера роста ( n 1 ) и начало стабилизированного роста (n 2 ), мы определяем плато при постоянном -ln ( P ( n )) который определяет эти точки пересечения для каждой траектории (текст A в тексте S1).(C) С увеличением концентрации адаптера более крупные решетки стабилизируются. Форма кривых соответствует данным на рис. 4А; свободная энергия образует впадину при более высоких концентрациях, что соответствует среднему размеру решеток в состоянии равновесия. (D) Критический размер, при котором плато барьера составляет ~ 90 604 n 90 605 90 253 1 90 254 = 25, не зависит от концентрации адаптера. За областью шумного плато следует скважина, которая начинается на n 2 и увеличивается с увеличением концентрации адаптера.(Вставка) При более высокой концентрации адаптеров время пересечения первого барьера в точке n 1 меньше, в соответствии с обратной зависимостью адаптеров τ obs ∝1/[AP2], с константой пропорциональности 1/[ 0,026 мкм -1 с -1 ].

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009969.g005

    Концентрация адаптера определяет время достижения наблюдаемого ядра, но не его размер

    Когда мы увеличиваем концентрацию адаптера выше 0.7 мкм, мы наблюдаем, что по всей траектории начальный барьер для зародышеобразования переходит в уплощенную область с аналогичным размером решетки 90 604 n 90 605 90 253 1 90 254 ~ 25 клатрин для всех концентраций адаптера (рис. 5C и 5D). Этот начальный барьер является значительным, поскольку более мелкие решетки склонны к разборке (рис. E (C) в тексте S1). Существует более поздний переход, когда начинает формироваться стабильная яма, при n 2 , которая явно смещается в сторону более крупных решеток по мере увеличения концентрации адаптера (рис. 5C).Эти два размера решетки, которые ограничивают шумовую область плато, которая замеряется во время роста, вполне согласуются с размерами решетки, которые определяют равновесные области (рис. 5D). Мы наблюдаем некоторые особенности в шумной области плато по всей траектории, где небольшой барьер может существовать при более высоком размере решетки ( n ~40–70). Это указывает на то, что во время роста реже всего наблюдаются решетки, которые находятся примерно на полпути к стабильному размеру и действительно имеют короткое время жизни (рис. E в тексте S1).Дополнительные адаптеры также значительно ускоряют временную шкалу, необходимую для достижения «критического» ядра n 1 , со временем, которое приблизительно пропорционально обратной концентрации адаптера (рис. 5D-вставка). Заметим, что несколько удивительно то, что барьер нуклеации n 1 практически не зависит от концентрации адаптера. Однако концентрация клатрина во всех симуляциях одинакова, что позволяет предположить, что барьер в значительной степени кодируется концентрацией клатрина и сформированными решетчатыми структурами, при этом для формирования критического ядра требуется достаточное количество поперечных связей клатрина, а адаптеры способны только смещаться в сторону сборки этих структур. .Действительно, с изменениями концентрации клатрина размер первоначально стабильных ядер n 1 действительно изменяется, указывая на то, что общий доступный клатрин контролирует начальный барьер для нуклеации (рис. F в тексте S1).

    Размер наблюдаемых нами «критических» зародышей показывает, что даже после образования нескольких (8–10) шестиугольников (вставка на рис. 5A) решетка все еще может спонтанно разбираться (см. S2 Movie). В частности, в масштабах времени, меньших времени, необходимого для достижения этого критического размера, который даже при 1.Адаптер 6 мкм составляет ~ 30 с, решетки демонстрируют значительное динамическое ремоделирование. Большая часть роста и сжатия происходит за счет мономеров (рис. E (B) в тексте S1), и когда решетка действительно меняет размер, вероятности диссоциации тримера или добавления одного сравнимы до достижения максимального предела размера (рис. E (C). ) в тексте S1).

    Сборка в растворе менее кооперативна, чем на мембране, несмотря на повышенную стабильность изогнутых структур

    Вышеупомянутое моделирование отслеживало плоские клатриновые решетки на плоской поверхности.Однако в растворе клетки изогнуты [57], что указывает на то, что изогнутые клетки более стабильны при отсутствии внешних ограничений мембраны. Недавние эксперименты также количественно определили, что сборка клатрина более стабильна на сильно искривленных поверхностях, что иллюстрирует прирост энергии, сопровождающий искривленные контакты клатрина [66]. Следовательно, криволинейная решетка должна иметь более сильную энергетику и устойчивость, чем плоская решетка, которую мы смоделировали на поверхности. Однако сначала мы смоделировали идентичную модель из моделирования мембраны (рис. 4А) в растворе с адаптерами и «сморщенными» мономерами клатрина (модели и методы), практически не наблюдая сборки даже при высоких концентрациях адаптеров (рис. 6А).Столь резкий спад в сборке связан с отсутствием уменьшения размеров в сборке решения, что стабилизирует сборку в 2D.

    Рис. 6. Сборка изогнутой клетки в растворе требует дополнительной стабилизации, которая сравнима с энергией изгиба мембраны.

    (A) Клатриновые клетки с имеющимися адаптерами не образуются в растворе (черные точки) при использовании той же модели, что и на мембране (незаштрихованные кружки), несмотря на ту же концентрацию клатрина. При дополнительной стабилизации всех связей клатрин-клатрин (Δ G ) и сниженной деформации (Δ G штамм ) начинают формироваться растворные клетки (красный и синий), хотя рост менее кооперативный без уменьшения размеров после локализации в мембране. .(B) Энергия изгиба мембраны на тример клатрина при увеличении размеров n изогнутых решеток. Более сильно изогнутые клетки ( α = 98 o ) требуют больше энергии на тример для изгиба мембраны. Энергия мембраны пропорциональна модулю изгиба κ , где мы используем κ = 20 k B T , что согласуется с измерениями на плазматической мембране [67].

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009969.g006

    Однако известно, что клатриновые клетки могут образовываться в растворе, когда присутствуют адапторные пептиды, такие как из АР-2, в концентрациях, сравнимых с изучаемыми здесь [57]. Следовательно, и в соответствии с экспериментами, показывающими, что изогнутые клетки более стабильны [66], мы затем увеличили свободную энергию связи клатрин-клатриновых контактов. Мы также уменьшили нагрузку на шестиугольники и пятиугольники, и с этими двумя энергостабилизирующими изменениями мы видим увеличение сборки (рис. 6А).Выход этой сборки зависит от концентрации адаптера, что согласуется с экспериментами in vitro по формированию клетки, управляемой адаптерным пептидом, в растворе [57]; за счет стабилизации связей на ~2 k 90 605 90 253 B 90 254 90 604 T 90 605 и снижения гексагональной деформации на 2,3 90 604 k 90 605 90 253 B 90 254 90 604 T 90 605 наша сборка клеток относительно хорошо согласуется с экспериментами 90 604 in vitro (рис. G in vitro 9060). Текст S1) [57]. По нашим оценкам, в результате как связи, так и гексагональной деформации искривленная решетка имеет дополнительную 3–4 90 604 k 90 605 90 253 B 90 254 90 604 T 90 605 свободной энергии на тример (таблица A в тексте S1), доступных для выполнения работы на плоской мембране. , то есть согнуть его.В дальнейшем мы будем называть эту величину «свободной энергией кривизны клатрина».

    Стоимость изгиба мембраны может быть хотя бы частично компенсирована стабильностью изогнутой решетки

    Теперь мы задаемся вопросом, может ли энергия, полученная при перемещении решетки от плоской к изогнутой на мембране, которая, как мы оценили выше, составляла ~ 3–4 k B T на тример, компенсировать затраты на изгибание мембраны. Мы измеряем стоимость изгиба мембраны путем гармоничного соединения наших предварительно собранных клатриновых клеток с моделью деформируемой мембраны [64], которая следует гамильтониану Хелфриха [68] (вставки на рис. 6B) (см. Модели и методы).Мы обнаружили, что по мере роста клатриновых решеток затраты энергии на изгиб в расчете на тример увеличиваются, при этом для решеток с более низкой кривизной требуется меньше энергии (рис. 6В). Мы видим, что, в частности, для решеток с более низкой кривизной стоимость энергии изгиба на тример клатрина составляет ~2–4 k B T , что действительно сравнимо с выигрышем «свободной энергии кривизны клатрина» в 3–4 раза. к Б Т . Этот результат предполагает, что стоимость изгиба мембраны клатриновой решеткой может быть, по крайней мере, частично обусловлена ​​энергией, полученной при формировании изогнутой сборки клатрина.Как мы уже показали на рис. 4 и 5, в модели плоской решетки клатрина достаточно энергии для сборки, пока присутствует достаточное количество адаптеров.

    Подводя итог этому пункту, когда клатрин образует плоскую решетку на мембране, решетка клатрина напряжена и окупается (по сравнению с изогнутой решеткой), в то время как мембрана находится в состоянии покоя. При формировании изогнутой клатриновой клетки нагрузка на решетку снижается, что улучшает ее энергетику, но стоимость изгиба мембраны возрастает.Мы отмечаем, что мы не ожидаем, что энергия изогнутой, связанной с мембраной решетки клатрина восстановит стабильность изогнутых клеток раствора из-за сил, действующих на нее со стороны деформированной мембраны. Таким образом, моделирование плоской решетки на мембране может быть, по крайней мере, энергетически сравнимо с моделированием изогнутой решетки с большей устойчивостью, компенсируемой изогнутой мембраной. Измененная энергетика клатриновых сборок на мембранах по сравнению с раствором была также измерена в крупнозернистой модели клатрина [33].Поэтому мы предполагаем, что модель, которая динамически сочетает сборку с ремоделированием мембраны, может восстанавливать такие же энергии для искривленной решетки при деформации изгиба, что и плоская решетка на плоских мембранах.

    Обсуждение

    Наша модель предсказывает, что формирующиеся клатриновые решетки на мембранах нестабильны до тех пор, пока не будет присутствовать ~25 клатрина, учитывая физиологические параметры 0,65 мкм клатрина и V / A = 1 мкм. Наша оценка порога стабильности удивительно похожа на размеры абортивных структур в клетках [3].Минимальным требованием для преодоления этого барьера для ядерных структур на мембране является достаточная концентрация адапторных белков, которые могут связывать клатрин с мембраной, позволяя сборке совместно получать выгоду как от повышенной (управляемой адаптером) стабильности, так и от уменьшения размеров. Одних только физиологических концентраций AP-2 недостаточно для рекрутирования достаточного количества клатрина для спонтанного образования связанных с мембраной клеток. Следовательно, участие других адаптеров необходимо для запуска зародышеобразования.Наша модель показывает, как условия in vitro с концентрациями белка in vivo не отражают переход между нестабильным и стабильным ростом решетки, в значительной степени из-за нефизиологического соотношения V / A . Наше кинетическое моделирование и теоретический анализ позволяют нам преодолеть геометрический разрыв между in vitro и in vivo ; наша модель предсказывает, что для того, чтобы один тип адаптера приводил к продуктивному зародышеобразованию и росту примерно за 60 с (среднее время для образования везикул), требуется как минимум 1.Адаптеры 6 мкм. Это также требует достаточных популяций липидов, которые могут запускать эффективное связывание с мембраной, с более медленными скоростями связывания липидов или уменьшенными популяциями, что в конечном итоге замедляет как отставание, так и скорость роста. Наши результаты ясно демонстрируют, что спонтанная разборка покрытых клатрином структур на мембранах может происходить естественным образом даже через относительно длительные периоды времени (многие секунды). Как свидетельствуют наши результаты равновесия, накопление большей части клатрина в одиночные структуры также истощает локальные популяции клатрина и адаптера, оставляя оставшийся клатрин способным образовывать только небольшие и временные структуры (Fig. 5).

    Путем моделирования только одного типа адаптера для рекрутирования клатрина к мембране мы смогли построить приблизительные теоретические формулы, чтобы предсказать, как микроскопические переменные изменяют макроскопическое время задержки и крутизну роста, даже когда мы варьировали концентрацию клатрина, липидов концентрация, геометрия системы, изменения кооперативности (рис. H в тексте S1) или скорости связывания липидов (рис. I в тексте S1). Однако in vivo существует несколько типов адаптеров или вспомогательных белков, которые могут связывать клатрин с мембраной [69].Хотя наша модель предсказывает, как адаптеры с более быстрой или более медленной кинетикой связывания будут изменять макроскопический рост, способность многих из этих белков связываться друг с другом [62] создает перекрестные связи, которые стабилизируют эти белки на поверхности мембраны [19]. Увеличивая локальную плотность мест рекрутирования клатрина, мы предсказываем, что это поперечное сшивание затем поможет зародышеобразовать стабильные решетки при более низких концентрациях, чем это происходит для одного типа адаптера. Кинетика связывания дополнительных взаимодействий также может быть значительно более динамичной, чем у АР-2; белки FCHo1 и eps15 образуют кластеры с AP-2, что помогает инициировать сайты формирования покрытых клатрином структур в клетках, и тем не менее, как FCHo1, так и eps15 практически отсутствуют в завершенных везикулах, что указывает на кратковременность их клатриновых контактов [70-72].Поведение этих дополнительных типов адаптерных белков согласуется с предсказанием нашей модели о том, что AP-2 нуждается в помощи для зарождения стабильных решеток, и в будущей работе мы рассмотрим, как явное перекрестное связывание может повысить локальные концентрации, чтобы стимулировать зародышеобразование и рост во времени и пространстве. . Важно отметить, что модель и программное обеспечение имеют открытый исходный код на github.com/mjohn218/NERDSS, поэтому их можно сразу же применить и/или изменить с помощью дополнительных экспериментальных данных (Модели и методы).

    Ограничением нашей модели является то, что сборка клатриновой оболочки не связана динамически с ремоделированием мембраны с образованием сферических везикул.Однако наши энергетические расчеты с использованием наших собранных структур клатрина и модели деформируемой мембраны показывают, что энергия, приходящаяся на клатрин, необходимая для изгиба мембраны, часто сравнима со свободной энергией кривизны клатрина. Таким образом, наша модель предсказывает, что энергия плоских решеток на мембранах и изогнутых клеток на изогнутых мембранах имеет аналогичный масштаб, хотя и чувствительна к жесткости мембраны и дополнительным механизмам генерации кривизны. Дополнительная индукция искривления, управляемая адапторными белками (например,грамм. вставка амфипатической спирали и домены BAR [73]) могли бы помочь реконструировать мембрану, тем самым уменьшая работу, требуемую только от клатриновой решетки. Кинетика изгиба мембран вряд ли будет ограничивать скорость, учитывая медленные временные масштабы рекрутирования клатрина и относительно быструю динамику ремоделирования, наблюдаемую при почковании мембран [74]. Однако кинетика поздней сборки клетки может быть изменена из-за почкования из-за уменьшения периметра решетки клатрина в изогнутой клетке по мере того, как размер выходит за пределы диаметра пузырька (~ 150 нм).Хотя это не повлияет на ранний рост для преодоления барьера зародышеобразования, закрытие везикулы связано с сокращением периметра, который уменьшает сайты для рекрутирования клатрина, но увеличивает количество контактов, формируемых в среднем на клатрин. Моделирование кинетики сопряженной сборки и ремоделирования в конечном счете будет важно для выделения событий формирования продуктивных пузырьков и возможно для используемых здесь типов моделей.

    Сборка клатриновой оболочки, изучаемая здесь, имеет много общих фундаментальных свойств с различными биологическими путями, включая этапы сборки вируса [74–76] и агрегации белков [77], где можно было бы ожидать схожую чувствительность к локализации и геометрии мембраны или поверхности (воздух/вода). .Наша работа здесь предсказывает, как сборка и агрегация могут происходить на поверхностях с более слабыми энергиями взаимодействия или значительно меньшим числом копий, чем это необходимо для зарождения структур в растворе. Локализация на поверхности обеспечивает дополнительную временную шкалу, которая может замедлить зародышеобразование, что может помочь избежать кинетических ловушек [78] для повышения выхода в разработанных системах [79,80]. Добавление мембраны обеспечивает контрольную переменную для экспериментальной количественной оценки кинетики взаимодействия, где мы показали здесь, как визуализация рекрутирования на поверхности [25] может быть эффективным наблюдаемым для различения механизмов сборки.Затем можно использовать ферментативный контроль состава мембраны для запуска разборки, чтобы изучить скорость несвязывания [47]. В целом, подход, основанный на скорости, используемый здесь [47], предлагает ценную платформу для механистического и прогностического моделирования самосборки в состоянии равновесия и вне его.

    Вспомогательная информация

    S1 Текст.

    Текст A: Дополнительные методы. Таблица A: Расчеты средней энергии на тримеры, собранные в решетки. Рис. A: Численное подтверждение ожидаемой кинетики.Рис. B: оценка того, как события ассоциации, которые отвергаются из-за значительных ориентационных смещений, влияют на кинетику реакции. Рис. C: Кинетика накопления клатрина на мембранах при изменении параметров модели. Рис. D: Корреляция между наблюдаемым временем запаздывания и крутизной начального роста по результатам моделирования по сравнению с прогнозируемыми значениями из упрощенных моделей уравнений 2 и 3 основного текста. Рис. E: Механизмы роста клатриновых решеток в более «физиологичных» геометриях. Рис. F: Рост решеток при изменении концентрации клатрина при фиксированной концентрации 1 мкМ адаптеров.Рис. G: Доля собранного клатрина в растворе в зависимости от концентрации адаптера. Рис. H: Максимальные решетки, образующиеся при изменении концентрации AP2, при сравнении двух значений кооперативности в контактах клатрин-клатрин, ΔG coop . Рис. I. Снижение популяции липидов или более низкая скорость связывания липидов замедляют отставание.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009969.s001

    (PDF)

    S1 Таблица. Лист Excel, содержащий параметры для всех симуляций с различимым временем задержки и темпами роста.

    Включает соответствующие наблюдаемые времена запаздывания и крутизну начального роста из моделирования, а также предсказанные времена запаздывания и крутизну из наших теоретических выражений.

    https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1009969.s004

    (XLSX)

    Благодарности

    Мы подтверждаем использование суперкомпьютеров ARCH bluecrab (MARCC) и морской окунь в Университете Джона Хопкинса при поддержке NSF MRI 1

  1. 3 и суперкомпьютера XSEDE Stampede2 через XRAC MCB150059.Мы благодарны профессору Томасу Пукадьилу за то, что он поделился своими данными и за полезные обсуждения экспериментов.

    Каталожные номера

    1. 1. Scita G, Di Fiore PP. Эндоцитарный матрикс. Природа. 2010; 463:464–73. пмид:20110990
    2. 2. Соркин А., фон Застров М. Эндоцитоз и передача сигналов: переплетение молекулярных сетей. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009;10(9):609–22. пмид: 19696798; Центральный PMCID в PubMed: PMC2895425.
    3. 3. Эрлих М., Болл В., Ван Ойен А., Харихаран Р., Чандран К., Ниберт М.Л. и др.Эндоцитоз случайным инициированием и стабилизацией ямок, покрытых клатрином. Клетка. 2004;118(5):591–605. пмид: 15339664.
    4. 4. Loerke D, Mettlen M, Yarar D, Jaqaman K, Jaqaman H, Danuser G, et al. Карго и динамин регулируют созревание ямок, покрытых клатрином. PLoS биол. 2009;7(3):e57. пмид: 19296720; Центральный PMCID в PubMed: PMC2656549.
    5. 5. Айзенберг Э., Грин Л.Э. Множественные роли ауксилина и hsc70 в клатрин-опосредованном эндоцитозе. Трафик. 2007;8(6):640–6.пмид: 17488288.
    6. 6. McMahon HT, Boucrot E. Молекулярный механизм и физиологические функции клатрин-опосредованного эндоцитоза. Nat Rev Mol Cell Biol. 2011;12(8):517–33. пмид: 21779028.
    7. 7. У С., Чжао С., Бэйлор Л., Каушал С., Айзенберг Э., Грин Л.Е. Обмен клатрина во время клатрин-опосредованного эндоцитоза. Джей Селл Биол. 2001;155(2):291–300. пмид:11604424; Центральный PMCID в PubMed: PMC2198830.
    8. 8. Тейлор М.Дж., Перре Д., Меррифилд С.Дж.Высокоточный обзор молекулярной динамики клатрин-опосредованного эндоцитоза млекопитающих. Плос биология. 2011;9(3). АРТН e1000604. WOS:000288942200008. пмид:21445324
    9. 9. Сочацкий К.А., Дики А.М., Струб М.П., ​​Тараска Ю.В. Эндоцитарные белки разделены на краю клатриновой решетки в клетках млекопитающих. Nat Cell Biol. 2017;19(4):352–61. пмид: 28346440.
    10. 10. Меттлен М., Лёрке Д., Ярар Д., Данусер Г., Шмид С.Л. Механизмы, специфичные для грузов и адаптеров, регулируют клатрин-опосредованный эндоцитоз.Джей Селл Биол. 2010;188(6):919–33. пмид: 20231386; Центральный PMCID в PubMed: PMC2845073.
    11. 11. Лю А.П., Аге Ф., Данусер Г., Шмид С.Л. Локальное скопление трансферриновых рецепторов способствует инициации покрытых клатрином ямок. Джей Селл Биол. 2010;191(7):1381–93. пмид: 21187331; Центральный PMCID в PubMed: PMC3010081.
    12. 12. Кокуччи Э., Аге Ф., Булан С., Кирххаузен Т. Первые пять секунд жизни покрытой клатрином ямы. Клетка. 2012;150(3):495–507. пмид: 22863004; Центральный PMCID в PubMed: PMC3413093.
    13. 13. Авиноам О., Шорб М., Биз С.Дж., Бриггс Дж.А., Каксонен М. ЭНДОЦИТОЗ. Эндоциты созревают за счет непрерывного изгиба и ремоделирования клатриновой оболочки. Наука. 2015;348(6241):1369–72. пмид: 26089517.
    14. 14. He K, Marsland R, III, Upadhyayula S, Song E, Dang S, Capraro BR и др. Динамика конверсии фосфоинозитидов в клатрин-опосредованном эндоцитарном трафике. Природа. 2017;552(7685):410–4. пмид: 2

      94.
    15. 15. Шонеберг Дж., Леманн М., Ульрих А., Посор Ю., Ло В.Т., Лихтнер Г. и др.Опосредованное липидами рекрутирование домена PX-BAR связывает локальное сужение мембраны с делением эндоцитарных пузырьков. Нац коммун. 2017;8:15873. пмид: 28627515; Центральный PMCID в PubMed: PMC5481832.
    16. 16. Kelly BT, Graham SC, Liska N, Dannhauser PN, Honing S, Ungewickell EJ, et al. Клатриновые адаптеры. AP2 контролирует полимеризацию клатрина с помощью переключателя, активируемого мембраной. Наука. 2014;345(6195):459–63. пмид: 25061211; Центральный PMCID в PubMed: PMC4333214.
    17. 17. Мишра С.К., Кейел П.А., Гаврилюк М.Дж., Агостинелли Н.Р., Уоткинс С.К., Трауб Л.М.Disabled-2 проявляет свойства селективного по отношению к грузам эндоцитарного клатринового адаптера. EMBO J. 2002; 21 (18): 4915–26. пмид:12234931; Центральный PMCID в PubMed: PMC126284.
    18. 18. Dannhauser PN, Ungewickell EJ. Восстановление покрытых клатрином зачатков и образований пузырьков с использованием минимального количества компонентов. Nat Cell Biol. 2012;14(6):634–9. пмид: 22522172.
    19. 19. Yogurtcu ON, Джонсон ME. Цитозольные белки могут использовать мембранную локализацию для запуска функциональной сборки. PLoS Comput Biol.2018;14(3):e1006031. Эпб 2018/03/06. пмид: 29505559; Центральный PMCID в PubMed: PMC5854442.
    20. 20. Осава Ф., Касаи М. Теория линейных и спиральных агрегаций макромолекул. Дж Мол Биол. 1962; 4: 10–21. Эпб 1962/01/01. пмид: 14482095.
    21. 21. Колетта М., Хофрихтер Дж., Ферроне Ф.А., Итон В.А. Кинетика серповидной полимеризации гемоглобина в одиночных эритроцитах. Природа. 1982; 300 (5888): 194–7. Электронная книга 11 ноября 1982 г. пмид:7133139
    22. 22. Galvagnion C, Buell AK, Meisl G, Michaels TC, Vendruscolo M, Knowles TP, et al.Липидные везикулы запускают агрегацию альфа-синуклеина, стимулируя первичную нуклеацию. Nat Chem Biol. 2015;11(3):229–34. Эпб 2015/02/03. пмид: 25643172; Центральный PMCID в PubMed: PMC5019199.
    23. 23. Мейл Г., Киркегор Дж. Б., Арозио П., Майклс Т. С., Вендрусколо М., Добсон К. М. и др. Молекулярные механизмы агрегации белков на основе глобальной подгонки кинетических моделей. Нат Проток. 2016;11(2):252–72. Эпб 2016/01/08. пмид: 26741409.
    24. 24. Хаган МФ, Эльрад ОМ. Понимание зависимости кинетики сборки вирусного капсида от концентрации — происхождение времени задержки и определение критического размера ядра.Биофиз Дж. 2010; 98 (6): 1065–74. Эпб 2010/03/23. пмид: 20303864; Центральный PMCID в PubMed: PMC2849049.
    25. 25. Пукадил Т.Дж., Холкар С.С. Сравнительный анализ сборки клатрина, опосредованной адаптером, выявляет общие принципы кластеризации адаптеров. Мол Биол Селл. 2016;27(20):3156–63. пмид: 27559129; Центральный PMCID в PubMed: PMC5063622.
    26. 26. Wakeham DE, Chen CY, Greene B, Hwang PK, Brodsky FM. Самосборка клатрина включает скоординированные слабые взаимодействия, благоприятные для клеточной регуляции.EMBO J. 2003; 22 (19): 4980–90. пмид:14517237; Центральный PMCID в PubMed: PMC204494.
    27. 27. Miele AE, Watson PJ, Evans PR, Traub LM, Owen DJ. Два различных мотива взаимодействия в амфифизине связывают два независимых сайта на бета-пропеллере концевого домена клатрина. Nat Struct Mol Biol. 2004;11(3):242–8. пмид: 14981508.
    28. 28. ден Оттер В.К., Ренес М.Р., Брильс В.Дж. Асимметрия как ключ к сборке клатриновой клетки. Биофизический журнал. 2010;99(4):1231–8. WOS:pmid:207130073200027.
    29. 29. Джани М., Ден Оттер В.К., Брильс В.Дж. Сборка клатрина регулируется адапторными белками в крупнозернистых моделях. Biophys J. 2016;111(1):222–35. пмид: 27410749; Центральный PMCID в PubMed: PMC4944722.
    30. 30. Илие И.М., Ден Оттер В.К., Брильс В.Дж. Моделирование вращательной броуновской динамики формирования клатриновой клетки. J Chem Phys. 2014;141(6):065101. пмид: 25134598.
    31. 31. Джонсон МЭ. Моделирование самосборки белковых комплексов с помощью алгоритма вращательной реакции-диффузии твердого тела.J Phys Chem B. 2018;122(49):11771–83. пмид:30256109
    32. 32. Шон А.П., Корделла Н., Мераин С., Арунагириринатан М.А., Спаковиц А.Дж., Хейлсхорн С.К. Динамическое ремоделирование неупорядоченных белковых агрегатов является альтернативным путем для достижения надежной самосборки наноструктур. Мягкая материя. 2013;9(38):9137–45. WOS:000324423700012.
    33. 33. Джани М., Ден Оттер В.К., Брильс В.Дж. Ранние стадии агрегации клатрина на мембране в крупнозернистом моделировании. J Chem Phys.2017;146(15):155102. пмид: 28433029.
    34. 34. Мэтьюз Р., Ликос К.Н. Структуры и пути самосборки клатрина в объеме и на мембранах. Мягкая материя. 2013;9(24):5794–806. WOS:pmid:000319872000016.
    35. 35. Корделла Н., Лампо Т.Дж., Мераин С., Спаковиц А.Дж. Мембранные флуктуации дестабилизируют порядок решетки белка клатрина. Биофиз Дж. 2014;106(7):1476–88. пмид: 24703309; Центральный PMCID в PubMed: PMC3976529.
    36. 36. Корделла Н., Лампо Т.Дж., Мелош Н., Спаковиц А.Дж.Вдавливание мембраны вызывает реорганизацию решетки клатрина и псевдоожижение. Мягкая материя. 2015;11(3):439–48. пмид: 25412023.
    37. 37. Фрей Ф., Бухер Д., Сочацкий К.А., Тараска Дж.В., Боулант С., Шварц США. Модели роста Идена для плоских клатриновых решеток с вакансиями. Новый J физ. 2020;22:073043.
    38. 38. Носсал Р. Энергетика сборки клатриновой корзины. Трафик. 2001;2(2):138–47. пмид:11247304.
    39. 39. Мутукумар М., Носсал Р. Модель мицеллообразования для полимеризации клатриновых корзин.J Chem Phys. 2013;139(12):121928. пмид: 24089740; Центральный PMCID в PubMed: PMC3785534.
    40. 40. Банерджи А., Бережковский А., Носсал Р. Стохастическая модель сборки ям, покрытых клатрином. Биофиз Дж. 2012;102(12):2725–30. пмид: 22735522; Центральный PMCID в PubMed: PMC3379625.
    41. 41. Банерджи А., Бережковский А., Носсал Р. Кинетика клеточного поглощения вирусов и наночастиц посредством клатрин-опосредованного эндоцитоза. физ.-биол. 2016;13(1):016005. Эпб 2016/02/13. пмид: 26871680; Центральный PMCID в PubMed: PMC6748044.
    42. 42. Агравал Н.Дж., Нукпеза Дж., Радхакришнан Р. Минимальная мезомасштабная модель белково-опосредованной везикуляции при клатрин-зависимом эндоцитозе. PLoS Comput Biol. 2010;6(9). пмид: 20838575; Центральный PMCID в PubMed: PMC2936510.
    43. 43. Раманан В., Агравал Н.Дж., Лю Дж., Энглес С., Той Р., Радхакришнан Р. Системная биология и физическая биология клатрин-опосредованного эндоцитоза. Интегр Биол (Кэмб). 2011;3(8):803–15. пмид: 217

      ; Центральный PMCID в PubMed: PMC3153420.

    44. 44.Хассингер Дж. Э., Остер Г., Друбин Д. Г., Рангамани П. Принципы проектирования надежной везикуляции при клатрин-опосредованном эндоцитозе. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(7):E1118–E27. Эпб 2017/01/28. пмид: 28126722; Центральный PMCID в PubMed: PMC5320970.
    45. 45. Лю Дж., Сунь Ю., Друбин Д.Г., Остер Г.Ф. Механохимия эндоцитоза. PLoS биол. 2009;7(9):e1000204. пмид: 19787029; Центральный PMCID в PubMed: PMC2742711.
    46. 46. Холланд Д.О., Джонсон М.Э. Стехиометрический баланс количества копий белка поддается измерению и функционально важен в сети белок-белковых взаимодействий для эндоцитоза дрожжей.PLoS Comput Biol. 2018;14(3):e1006022. пмид:29518071
    47. 47. Варга М., Фу Ю., Лоджия С., Йогурцу О.Н., Джонсон М.Э. NERDSS: неравновесный симулятор самосборки множества тел на клеточном уровне. Биофизический журнал. 2020;118(12):P3026–40. пмид:32470324
    48. 48. Джонсон М.Е., Хаммер Дж. Интегратор с повторным взвешиванием свободного распространителя для динамики одиночных частиц в моделях реакции-диффузии гетерогенных систем белок-белкового взаимодействия. Физический обзор X.2014;4(3). WOS:000341266

      1. пмид:26005592

    49. 49. Yogurtcu ON, Джонсон ME. Теория динамики бимолекулярной ассоциации в 2D для точной модели и экспериментальной параметризации скоростей связывания. Журнал химической физики. 2015;143(8):084117. WOS:000360653

      0. пмид:26328828

    50. 50. Фу Ю., Йогурцу О.Н., Котари Р., Торкельсдоттир Г., Содт А.Дж., Джонсон М.Е. Неявная липидная модель для эффективного моделирования реакции-диффузии связывания белка с поверхностями произвольной топологии.J Chem Phys. 2019;151(12):124115. пмид:31575182.
    51. 51. Адам Г., Дельбрюк М. Уменьшение размерности в биологических диффузионных процессах. Структурная химия и молекулярная биология. Сан-Франциско: Фримен; 1968. с. 198–215.
    52. 52. Мишра Б., Джонсон М.Э. Пределы скорости сборки белков с обратимой мембранной локализацией. J Chem Phys. 2021;154:194101. пмид:34240891
    53. 53. Bucher D, Frey F, Sochacki KA, Kummer S, Bergeest JP, Godinez WJ, et al.Соотношение клатрин-адаптер и натяжение мембраны регулируют переход клатриновой оболочки от плоской к изогнутой во время эндоцитоза. Нац коммун. 2018;9(1):1109. пмид: 29549258; Центральный PMCID в PubMed: PMC5856840.
    54. 54. Саффариан С., Кокуччи Э., Кирххаузен Т. Отчетливая динамика эндоцитарных ямок, покрытых клатрином, и бляшек с покрытием. PLoS биол. 2009;7(9):e1000191. пмид: 19809571; Центральный PMCID в PubMed: PMC2731173.
    55. 55. фон Смолуховски М. Попытка вывести математическую теорию кинетики коагуляции в коллоидных растворах.Z Phys Chem. 1917; 92:129.
    56. 56. Фотин А., Ченг Ю., Слиз П., Григорьев Н., Харрисон С.К., Кирххаузен Т. и соавт. Молекулярная модель полной решетки клатрина по данным электронной криомикроскопии. Природа. 2004;432(7017):573–9. Эпублик 27 октября 2004 г. пмид: 15502812.
    57. 57. Заремба С., Кин Дж. Х. Сборочные полипептиды из покрытых везикул опосредуют повторную сборку уникальных клатриновых оболочек. Джей Селл Биол. 1983; 97 (5 часть 1): 1339–47. пмид:6138359; Центральный PMCID в PubMed: PMC2112702.
    58. 58.Wu Y, Vendome J, Shapiro L, Ben-Shaul A, Honig B. Преобразование сродства связывания из трех измерений в два с применением к кластеризации кадгерина. Природа. 2011;475(7357):510–3. пмид: 21796210; Центральный PMCID в PubMed: PMC3167384.
    59. 59. Вейкл Т.Р., Ху Дж., Сюй Г.К., Липовски Р. Равновесие связывания и кинетика закрепленных на мембране рецепторов и лигандов в клеточной адгезии: выводы из систем вычислительных моделей и теории. Сотовый Адх Мигр. 2016;10(5):576–89. пмид: 27294442; Центральный PMCID в PubMed: PMC5079412.
    60. 60. Сочацкий К.А., Хайне Б.Л., Хабер Г.Дж., Джимах Дж.Р., Прасаи Б., Альфонсо-Мендез М.А. и соавт. Строение и спонтанное искривление клатриновых решеток на плазматической мембране. Ячейка Дев. 2021;56(8):1131–46 e3. Эпб 2021/04/07. пмид:33823128.
    61. 61. Най Дж. А., Гроувс Дж. Т. Кинетический контроль поверхностной плотности меченого гистидином белка на поддерживаемых липидных бислоях. Ленгмюр. 2008;24(8):4145–9. пмид: 18303929.
    62. 62. Дуан Д., Хэнсон М., Холланд Д., Джонсон М.Э.Интеграция количества копий белка с сетями взаимодействия для количественной оценки стехиометрии эндоцитоза млекопитающих. bioRxiv. 2020;
    63. 63. Хайн М.Ю., Хабнер Н.К., Позер И., Кокс Дж., Нагарадж Н., Тойода Ю. и др. Человеческий интерактом в трех количественных измерениях, организованный по стехиометрии и изобилию. Клетка. 2015;163(3):712–23. пмид: 26496610.
    64. 64. Фэн Ф., Клуг В.С. Конечно-элементное моделирование липидных бислойных мембран. Журнал вычислительной физики. 2006; 220(1):394–408.WOS:pmid:000243079600020.
    65. 65. Бэмфорд Ч. Теория кинетики. Самосвал CHBaCFH, редактор. Нью-Йорк: Elsevier 1969.
    66. 66. Зено В. Ф., Хохфельдер Дж. Б., Татте А. С., Ван Л., Гадок А. К., Хейден К. С. и другие. Clathrin чувствует кривизну мембраны. Biophys J. 2021;120(5):818–28. Эпублик 2021/02/02. пмид:33524373; Центральный PMCID в PubMed: PMC8008260.
    67. 67. Steinkuhler J, Sezgin E, Urbancic I, Eggeling C, Dimova R. Механические свойства везикул плазматической мембраны коррелируют с порядком липидов, вязкостью и плотностью клеток.коммун биол. 2019;2:337. Эпб 2019/09/19. пмид:31531398; Центральный PMCID в PubMed: PMC6744421.
    68. 68. Хелфрих В. Упругие свойства липидных бислоев — теория и возможные эксперименты. Zeitschrift Fur Naturforschung C-Журнал биологических наук. 1973; С 28 (11–1): 693–703. WOS: A1973R836200009.
    69. 69. Wang X, Chen Z, Mettlen M, Noh J, Schmid SL, Danuser G. DASC, чувствительный классификатор для измерения дискретных ранних стадий клатрин-опосредованного эндоцитоза. Элиф.2020;9. Эпублик 2020/05/01. пмид:32352376; Центральный PMCID в PubMed: PMC71
    70. .
    71. 70. Ма Л., Умасанкар П.К., Врубель А.Г., Лаймар А., Маккой А.Дж., Холкар С.С. и др. Нанокластеры Transient Fcho1/2Eps15/RAP-2 заполняют клатриновый адаптер AP-2 для связывания груза. Ячейка Дев. 2016;37(5):428–43. пмид: 27237791; Центральный PMCID в PubMed: PMC4

      5.

    72. 71. Хенне В.М., Букро Э., Мейнеке М., Эвергрен Э., Валлис Ю., Миттал Р. и др. Белки FCHo являются зародышами клатрин-опосредованного эндоцитоза.Наука. 2010;328(5983):1281–4. пмид: 20448150; Центральный PMCID в PubMed: PMC2883440.
    73. 72. Day KJ, Kago G, Wang L, Richter JB, Hayden CC, Lafer EM, et al. Взаимодействия с жидкостными белками катализируют сборку эндоцитарных везикул. Nat Cell Biol. 2021;23(4):366–76. Эпб 2021/04/07. пмид:33820972; Центральный PMCID в PubMed: PMC8035231.
    74. 73. Bassereau P, Jin R, Baumgart T, Deserno M, Dimova R, Frolov VA, et al. Дорожная карта по искривлению и ремоделированию биомембран на 2018 год.Журнал физики D-Прикладная физика. 2018;51(34). АРТН 343001. WOS:000439335400001. пмид:30655651
    75. 74. Дхармаварам С., Ше С.Б., Лазаро Г., Хаган М.Ф., Бруинсма Р. Гауссова кривизна и кинетика почкования оболочечных вирусов. PLoS Comput Biol. 2019;15(8):e1006602. Эпаб 2019/08/23. пмид:31433804; Центральный PMCID в PubMed: PMC6736314.
    76. 75. Пак А.Дж., Грайм Дж.МА., Сенгупта П., Чен А.К., Дурумерик АЭП, Шривастава А. и др. Динамика сборки решетки незрелого ВИЧ-1 регулируется каркасом из нуклеиновой кислоты и плазматической мембраны.Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(47):E10056–E65. Эпублик 2017/11/09. пмид: 255; Центральный PMCID в PubMed: PMC5703280.
    77. 76. Ю А, Скорупка К.А., Пак А.Я., Гансер-Порниллос Б.К., Порниллос О., Вот Г.А. Самосборка TRIM5alpha и компартментализация вирусного капсида ВИЧ-1. Нац коммун. 2020;11(1):1307. Эпаб 13.03.2020. пмид:32161265; Центральный PMCID в PubMed: PMC7066149.
    78. 77. Krausser J, Knowles TPJ, Saric A. Физические механизмы зарождения амилоида на жидких мембранах.Proc Natl Acad Sci U S A. 2020;117(52):33090–8. Эпублик 2020/12/18. пмид:33328273; Центральный PMCID в PubMed: PMC7777200.
    79. 78. Хаган М.Ф., Эльрад О.М., Джек Р.Л. Механизмы кинетического захвата при самосборке и фазовом превращении. J Chem Phys. 2011;135(10):104115. пмид: 21932884; Центральный PMCID в PubMed: PMC32

      .

    80. 79. Муруган А., Цзоу Дж., Бреннер М.П. Нежелательное использование и надежная самосборка разнородных структур. Нац коммун. 2015;6:6203. Эпб 2015/02/12.пмид: 25669898.
    81. 80. Гудрич К.П., Кинг Э.М., Шенхольц С.С., Кубук Э.Д., Бреннер М.П. Разработка кинетики самосборки с помощью дифференцируемых моделей статистической физики. Proc Natl Acad Sci USA. 2021; 118(10). Эпб 2021/03/04. пмид:33653960; Центральный PMCID в PubMed: PMC7958177.

    Инвазия Antigonon leptopus связана с разрушением растительного сообщества в экосистеме Карибского острова

  2. Axelrod FS (2017) Систематический путеводитель к сосудистым растениям Синт-Эстатиуса.BRIT Press, Форт-Уэрт, Техас, США

    Google ученый

  3. Banda K et al (2016) Модели разнообразия растений в неотропических сухих лесах и их последствия для сохранения. Наука 353:1383–1387

    Google ученый

  4. Барфкнехт Д.Ф., Гибсон Д.Дж., Нойбиг К.М. (2020) Сообщество растений и филогенетические сдвиги в источниках кислотных просачиваний за 49 лет после инвазии Microstegium vimineum .Завод Ecol 221:167–175

    Google ученый

  5. Bauer JT (2012) Инвазивные виды: «второстепенные» факторы изменения экосистемы? Биол Вторжения 14:1295–1304

    Google ученый

  6. Беллард С., Кэсси Дж., Блэкберн Т.М. (2016) Чужеродные виды как движущая сила недавних вымираний. Биол Летт 12:20150623

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  7. Блуа Дж.Л., Зарнецке П.Л., Фитцпатрик М.С. и др. (2013) Изменение климата и прошлое, настоящее и будущее биотических взаимодействий.Наука 341:499–504

    CAS пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  8. Болдинг I (1909 г.) Флора голландских островов Вест-Индии Сент-Эстатиус, Саба и Сент-Мартин. Э.Дж. Брилл, Лейден, Нидерланды.

  9. Брэдли Б.А., Лагинас Б.Б., Уитлок Р., Аллен Дж.М., Бейтс А.Е., Бернатчес Г., Диез Дж.М., Ранний Р., Ленуар Дж., Вила М., Сорте CJB (2019) Распутывание взаимосвязи изобилия и воздействия для инвазивных видов.Proc Nat Acad Sci USA 116:9919–9924

    CAS пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  10. Брей С.Р., Хойт А.М., Ян З., Артур М.А. (2017) Неместная лиана Euonymus Fortune связана с повышенным содержанием питательных веществ в почве, уникальными бактериальными сообществами и более высокой скоростью разложения. Завод Экол 218:329–343

    Google ученый

  11. Браун Дж.Х., Сакс Д.Ф. (2004) Эссе на некоторые темы, касающиеся инвазивных видов.Austral Ecol 29:530–536

    Google ученый

  12. Burke JM, DiTomasso A (2011) Corallita ( Antigonon leptopus ): преднамеренная интродукция растения с подтвержденной инвазивной способностью. Inv Plant Sci Manag 4:265–273

    Google ученый

  13. Касадо М.А., Акоста-Галло Б., Санчес-Хардон Л., Мартин-Форес И., Кастро И., Овалье С., дель Посо А., де Мигель Х.М. (2015) Интерактивное воздействие среды обитания источника и реципиента на инвазии растений: распространение экзотических видов в Чили.Дайверс Дистриб 21:609–619

    Google ученый

  14. Cassini MH (2020) Обзор критиков биологии вторжения. Biol Rev 95:1467–1478

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  15. Castro-Díez P, Pauchard A, Traveset A, Vilà M (2016) Связь воздействия инвазии растений на функциональную структуру сообщества и свойства экосистемы. J Veg Sci 27: 1233–1242

    Google ученый

  16. Chen J, Shiyomi M (2019) Степенной закон для анализа пространственных моделей обилия растительности с точки зрения покрова, биомассы, плотности и распространенности: вывод общего правила.J Plant Res 132:481–497

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  17. Chen L, Zhou J, Zeng T, Miao YF, Mei L, Yao GB, Fang K, Dong XF, Sha T, Yang MZ, Li T, Zhao ZW, Zhang HB (2020) Количественная оценка совместного использования листьев грибковых патогенов инвазивным растением Ageratina adenophora и его соседями. Новый фитол 227:1493–1504

    CAS пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  18. Chiarucci A, Wilson JB, Anderson BJ, De Dominicis V (1999) Покровный покров в сравнении с биомассой как оценка численности видов: имеет ли это значение для выводов? J Veg Sci 10:35–42

    Google ученый

  19. Clarke KR (1993) Непараметрический многомерный анализ изменений в структуре сообщества.Ауст Дж. Экол 18: 117–143

    Google ученый

  20. Крукс Дж. А. (2002) Характеристика последствий биологических вторжений на уровне экосистемы: роль инженеров экосистем. Ойкос 97:153–166

    Google ученый

  21. Cuddington K, Hastings A (2004) Инвазивные инженеры. Экол Модель 335–247.

  22. Дар П.А., Реши З.А. (2015) Вызывают ли вторжения чужеродных растений биотическую гомогенизацию наземных экосистем в Кашмирской долине, Индия? Троп Экол 56:111–123

    Google ученый

  23. Debrot AO, Henkens RJHG, Verweij PJFM (2018) Staat van de natuur van Caribisch Nederland 2017 (на голландском языке).Wageningen Marine Research, Вагенинген, Нидерланды.

  24. Досталь П. (2011) Конкурентные взаимодействия и инвазивность растений: поиск влияния филогенетического родства и происхождения на интенсивность конкуренции. Am Nat 177: 655–667

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  25. де Фрейтас Дж.А., Ройер А.С., Нийхоф Б.С.Дж., Дебро А.О. (2012) Ландшафтная экологическая карта растительности Синт-Эстатиуса (Малые Антильские острова).Королевская академия наук Нидерландов, Амстердам, Нидерланды.

  26. де ла Рива Э.Г., Годой О., Кастро-Диес П., Гутьеррес-Кановас С., Вила М. (2019) Функциональные и филогенетические последствия инвазии растений для местных прибрежных сообществ. J Veg Sci 30: 510–520

    Google ученый

  27. де Мигель Х.М., Мартин-Форес I, Акоста-Галло Б., дель Посо А., Овалье С., Санчес-Хардон Л., Кастро I, Касадо М.А. (2016) Неслучайное совместное появление местных и экзотических видов растений на средиземноморских лугах.Acta Oecol 77:18–26

    Google ученый

  28. Дикманн М., Эффертц Х., Барановский М., Дюпре К. (2016) Слабое воздействие на разнообразие растений двух инвазивных видов недотроги. Завод Экол 12:1503–1514

    Google ученый

  29. Дилленбург Л.Р., Уигхэм Д.Ф., Терамура А.Х., Форсет И.Н. (1993) Влияние конкуренции винограда на доступность света, воды и азота для дерева-хозяина (Liquidambar styraciflua).Am J Bot 80: 244–252

  30. Дреновский Р.Е., Грюэлл Б.Дж., Д’Антонио К.М., Фанк Д.Л., Джеймс Д.Дж., Молинари Н., Паркер И.М., Ричардс К.Л. (2012) Взгляд на функциональные признаки инвазий растений. Энн Бот 110:141–153

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  31. Эппинга М.Б., Баудена М., Хабер Э.А., Риткерк М., Вассен М.Дж., Сантос М.Дж. (2021) Пространственно явные стратегии удаления повышают эффективность контроля инвазивных видов растений.Ecol Appl 31:e02257

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  32. Eppinga MB, Pucko CA (2018) Воздействие ураганов Ирма и Мария на лесные экосистемы Сабы и Сент-Эстатиуса, северная часть Карибского бассейна. Биотропика 50:723–728

    Google ученый

  33. Ernst JJ, Ketner P (2007) Изучение экологии и возможных методов борьбы с инвазивными видами растений Antigonon leptopus (Corallita или Mexican Creeper).ABC Research, Вагенинген, Нидерланды.

  34. Эссл Ф., Доусон В., Крефт Х., Пергл Дж., Пишек П., Ван Клейнен М., Вайгельт П., Манг Т., Даллингер С., Ленцнер Б., Мозер Д., Морел Н., Зеебенс Х., Штейн А., Вебер Э., Шателен С., Индерджит Г.П., Картес Дж., Морозова О., Нишино М., Новак П.М., Пагад С., Шу В.С., Винтер М. (2019) Факторы относительного богатства натурализованных и инвазивных видов растений на Земле. AoB Растения 11: plz051

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  35. Фанк Дж.Л., Ларсон Дж.Э., Эймс Г.М., Баттерфилд Б.Дж., Кавендер-Барес Дж., Фирн Дж., Лафлин Д.К., Саттон-Гриер А.Е., Уильямс Л., Райт Дж. (2017) Возвращение к Святому Граалю: использование функциональных признаков растений для понимать экологические процессы.Биол. Ред. 92:1156–1173

    Google ученый

  36. Гертнер М., Ден Брейен А., Хуэй С., Ричардсон Д.М. (2009) Воздействие инопланетных вторжений на богатство видов в экосистемах средиземноморского типа: метаанализ. Прогр Физ Геогр 33:319–338

    Google ученый

  37. Галан Диас Дж., де ла Рива Э.Г., Паркер И.М., Лейва М.Дж., Бернардо-Мадрид Р., Вила М. (2020) Собрание растительного сообщества на захваченных калифорнийских лугах-реципиентах и ​​предполагаемых донорских пастбищах в Испании.Разнообразие 12:193

    Google ученый

  38. Гальего-Фернандес Х.Б., Мартинес М.Л., Гарсия-Франко Х.Г., Зунзунегуи М. (2019) Воздействие на растительные сообщества инвазивной чужеродной травы, Oenothera drummondii , варьируется в зависимости от уклона пляж-прибрежные дюны. Флора 260:151466

    Google ученый

  39. Гонсалес-Морено П., Пино Дж., Козар А., Гарсия-де-Ломас Дж., Вила М. (2017) Влияние истории ландшафта и временных задержек на вторжение растений в средиземноморские прибрежные среды обитания.Биол Инв 19:549–561

    Google ученый

  40. Гордон Д.Р. (1998) Воздействие инвазивных неместных видов растений на экосистемные процессы: уроки Флориды. Приложение Ecol 8:975–989

    Google ученый

  41. Gordon DR, Lieurance D, Flory SL (2017) Прогнозируемая и фактическая инвазивность вьющихся лоз во Флориде. Биол Инв 19:2375–2384

    Google ученый

  42. Gotelli NJ (2000) Анализ нулевой модели закономерностей совместного появления видов.Экология 81:2606–2621

    Google ученый

  43. Gotelli NJ, Entsminger GL (2001) Алгоритмы замены и заполнения в анализе нулевой модели: переосмысление пути коня. Экология 129:281–291

    Google ученый

  44. Gotelli NJ, Rhode K (2002)Совместное появление эктопаразитов морских рыб: анализ нулевой модели. Ecol Lett 5:86–94

    Google ученый

  45. Gotelli NJ, Ulrich W (2010) Эмпирический байесовский подход как инструмент для выявления неслучайных ассоциаций видов.Экология 162:463–477

    Google ученый

  46. Гутьеррес-Кановас С., Санчес-Фернандес Д., Гонсалес-Морено П., Матеос-Наранхо Э., Кастро-Диес П., Вила М. (2020) Комбинированное воздействие интенсификации землепользования и инвазии растений на местные сообщества. Экология 192:823–836

    Google ученый

  47. Haber EA, Santos MJ, Leitão PJ, Schwieder M, Ketner P, Ernst J, Rietkerk M, Wassen MJ, Eppinga MB (2021) Использование картирования с высоким разрешением для определения характеристик среды обитания инвазивной виноградной лозы Antigonon leptopus .Биотропика 53:941–953

    Google ученый

  48. Harris CJ, Murray BR, Hose GC, Hamilton MA (2007) История введения и успех вторжения экзотических лоз, завезенных в Австралию. Дайверс Дистриб 13:467–475

    Google ученый

  49. Херд М.Дж., Сакс Д.Ф., Бруно Дж.Ф. (2012) Доминирование неместных видов со временем увеличивается в исторически захваченном береговом сообществе.Дайверс Дистриб 18:1232–1242

    Google ученый

  50. Hedman CW, Grace SL, King SE (2000) Состав растительности и структура равнинных сосновых лесов южного побережья: экологическое сравнение. Forest Ecol Manag 134:233–247

    Google ученый

  51. Heger WT, Van Andel T (2019) Социально-экологический взгляд на уязвимость экосистемы для инвазивной лианы coralita ( Antigonon leptopus ) в Карибском бассейне: обзор.Глоб Экол Консерв 18:e00605

    Google ученый

  52. Хейда М., Пишек П., Ярошик В. (2009) Влияние инвазивных растений на видовое богатство, разнообразие и состав инвазированных сообществ. J Ecol 97:393–403

    Google ученый

  53. Horvitz CC, Pascarella JB, McMann S, Freedman A, Hofstetter RH (1998) Функциональная роль инвазивных неместных растений в пострадавших от урагана субтропических лиственных лесах.Приложение Ecol 8:947–974

    Google ученый

  54. Huebner CD, Nowak DJ, Pouyat RV, Bodine AR (2012) Неместные инвазивные растения: поддержание биотической и социально-экономической целостности вдоль градиента городской-сельской-природной зоны. В: Лабанд Д.Н., Локаби Б.Г., Зипперер В.К. (ред.) Интерфейсы между городом и деревней: связь людей и природы. Американское общество агрономии, Мэдисон, стр. 71–98

    Google ученый

  55. Яуни М., Грипенберг С., Рамула С. (2015) Неместные виды извлекают выгоду из беспокойства: метаанализ.Ойкос 124:122–129

    Google ученый

  56. Jucker T, Carboni M, Acosta AT (2013) Выходя за рамки таксономического разнообразия: деконструкция моделей биоразнообразия раскрывает истинную цену вторжения ледяных растений. Дайверс Дистриб 19:1566–1577

    Google ученый

  57. Капрот М.А., Эппинга М.Б., Молофски Дж. (2013) Изменчивость опавших листьев влияет на динамику инвазии водно-болотных трав Phalaris arundinacea .Биол Инв 15:1819–1832

    Google ученый

  58. Ханна С., Сантос М.Дж., Хестир Э.Л., Устин С.Л. (2012) Динамика растительного сообщества относительно изменения распределения высокоинвазивных видов, Eichhornia crassipes : перспектива дистанционного зондирования. Биол Инв 14:717–733

    Google ученый

  59. Кнутсон Т.Р., Сирутис Дж.Дж., Чжао М., Тулея Р.Е., Бендер М., Векки Г.А., Вилларини Г., Чавас Д. (2015) Глобальные прогнозы интенсивной активности тропических циклонов на конец двадцать первого века на основе динамического уменьшения масштаба CMIP5/ РКП4.5 сценариев. J Климат 28:7203–7224

    Google ученый

  60. Корц А.Р., Магурран А.Е. (2019) Увеличение местного богатства (α-разнообразия) после вторжения компенсируется биотической гомогенизацией в очаге биоразнообразия. Биол Летт 15:201

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  61. Кюффер К., Далер К.С., Торрес-Сантана К.В., Лавернь К., Мейер Дж.Ю., Отто Р., Силва Л. (2010) Глобальное сравнение инвазий растений на океанических островах.Persp Plant Ecol Evol Syst 12:145–161

    Google ученый

  62. Лай Х.Р., Мэйфилд М.М., Гей-де-Комб Дж.М., Шпигельбергер Т., Дуайер Дж.М. (2015) Отдельные стратегии вторжения, действующие в естественной системе однолетних растений. Ecol Lett 18:336–346

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  63. Лалиберте Э., Лежандр П. (2010) Основанная на расстоянии структура для измерения функционального разнообразия по множеству признаков.Экология 91:299–305

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  64. Laliberte E, Tylianakis JM (2012) Каскадное воздействие долгосрочных изменений в землепользовании на свойства растений и функционирование экосистем. Экология 93:145–155

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  65. Lambdon PW, Lloret F, Hulme PE (2008) Приводят ли вторжения неместных видов к биотической гомогенизации в небольших масштабах? Сходство и функциональное разнообразие местообитаний по сравнению с чужеродными и аборигенными компонентами средиземноморской флоры.Дайверс Дистриб 14:774–785

    Google ученый

  66. Лехстен П., Харманд П. (2006)Нулевые модели для закономерностей совместного появления видов: оценка систематической ошибки и минимального количества итераций для последовательного обмена. Экография 29:786–792

    Google ученый

  67. Лехтомяки Дж., Кусумото Б., Шионо Т., Танака Т., Кубота Й., Мойланен А. (2019) Приоритеты пространственного сохранения островов Восточной Азии: сбалансированное представление многотаксонной биогеографии в сети охраняемых территорий.Дайверс Дистриб 25:414–429

    Google ученый

  68. Ли Д., Уоллер Д.М. (2016)Долгосрочные сдвиги в моделях и основных процессах растительных ассоциаций в лесах Висконсина. Global Ecol Biogeogr 25:516–526

    Google ученый

  69. Лоури Э., Роллинсон Э.Дж., Лейборн А.Дж., Скотт Т.Е., Айелло-Ламменс М.Е., Грей С.М., Микли Дж., Гуревич Дж. (2013) Биологические вторжения: полевой обзор, систематический обзор и база данных литературы.Экол Эвол 3:182–196

    Google ученый

  70. Macdonald R, Hawkesworth CJ, Heath E (2000) Вулканическая цепь Малых Антильских островов: исследование дугового магматизма. Earth Sci Rev 49:1–76

    CAS Google ученый

  71. MacDougall AS, Turkington R (2005) Являются ли инвазивные виды движущей силой или попутчиками изменений в деградировавших экосистемах? Экология 86:42–55

    Google ученый

  72. Мэдден Х., Ван Андел Т., Миллер Дж., Стеч М., Вердель К., Эггермонт Э. (2019) Ассоциации растительности и относительная численность грызунов на острове Сент-Эстатиус, Карибские Нидерланды.Глоб Экол Консерв 20:e00743

    Google ученый

  73. Maestre FT, Callaway RM, Valladares F, Lortie CJ (2009) Уточнение гипотезы градиента стресса для конкуренции и содействия в растительных сообществах. J Ecol 97:199–205

    Google ученый

  74. Мангла С., Шели Р.Л., Джеймс Дж.Дж., Радосевич С.Р. (2011) Внутри- и межвидовая конкуренция между инвазивными и местными видами на ранних стадиях роста растений.Завод Экол 212:531–542

    Google ученый

  75. Мартин-Форес И., Санчес-Хардон Л., Акоста-Галло Б., Дель Посо А., Кастро И., де Мигель Х.М., Овалье С., Касадо М.А. (2015) Из Испании в Чили: экологические фильтры и успех травянистых видов в регионах со средиземноморским климатом. Биол Инв 17:1425–1438

    Google ученый

  76. Мартин-Форес И., Кастро И., Акоста-Галло Б., Дель Посо А., Санчес-Хардон Л., де Мигель Х.М., Овалье С., Касадо М.А. (2016) Чужеродные виды растений сосуществуют во времени с местными в чилийском Средиземноморье луга.J Plant Ecol 9:682–691

    Google ученый

  77. Мартин-Форес И., Герин Г.Р., Лоу А.Дж. (2017) Обилие сорняков положительно коррелирует с разнообразием местных растений на пастбищах южной Австралии. PLoS ONE 12:e0178681

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  78. Маундер М., Лейва А., Сантьяго-Валентин Э., Стивенсон Д.В., Асеведо-Родригес П., Мироу А.В., Мехия М., Клуббе С., Франсиско-Ортега Дж. (2008) Сохранение растений в очаге биоразнообразия Карибского острова.Бот Ред. 74:197–207

    Google ученый

  79. Mayfield MM, Boni ME, Daily GC, Ackerly D (2005) Виды и функциональное разнообразие местных и антропогенных растительных сообществ. Экология 86:2365–2372

    Google ученый

  80. МакКьюн Б., Грейс Дж. Б. (2002) Анализ экологических сообществ. MjM Software Design, Гленден-Бич, Орегон, США.

  81. McKinney ML, Lockwood JL (1999) Биотическая гомогенизация: несколько победителей заменяют многих проигравших в следующем массовом вымирании.Trends Ecol Evol 14:450–453

    CAS пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  82. Менье Ф., Вербек Х., Каудери Б., Шнитцер С.А., Смит-Мартин К.М., Пауэрс Дж.С., Сюй Х., Слот М., Де Деурваердер Х.П., Детто М., Бонал Д. (2021) Разгадка относительной роли света и воды конкуренция между лианами и деревьями в тропических лесах: анализ модели растительности. J Ecol 109: 519–540

  83. Майклс Т.К., Эппинга М.Б., Бевер Д.Д. (2020) Структура зародышеобразования для перехода между альтернативными состояниями: короткое замыкание барьеров на пути восстановления экосистемы.Экология 101:e03099

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  84. Миланович М., Кнапп С., Пишек П., Кюн И. (2020) Ecosyst Serv. т. 42. стр. 101072

    Google ученый

  85. Митчелл С.А., Китсон-Уолтерс К.А., Митчелл А.А. (2019) Оценка знаний о биоразнообразии Карибского бассейна. В: Хуфнагель Л. (ред.) Изменение экосистем и их услуг. IntechOpen, Лондон, стр. 15–48

    Google ученый

  86. Кроты А.Т., Грубер М.А.М., Бонсер С.П. (2008) Новая структура для прогнозирования инвазивных видов растений.J Ecol 96:13–17

    Google ученый

  87. Молинари Н.А., Д’Антонио К.М. (2014) Структурные, составные и характерные различия между пастбищными участками с преобладанием местных и неместных видов. Функция Ecol 28:745–754

    Google ученый

  88. Моллот Г., Пантел Дж. Х., Романюк Т. Н. (2017) Влияние инвазивных видов на снижение видового богатства: глобальный метаанализ. Adv Ecol Res 56:61–83

    Google ученый

  89. Майерс Н., Миттермайер Р.А., Миттермайер К.Г., Да Фонсека Г.А.Б., Кент Дж. (2000) Горячие точки биоразнообразия для приоритетов сохранения.Природа 403:853–858

    CAS пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  90. Центр биоразнообразия Naturalis (2017 г.), Голландский регистр карибских видов, www.dutchcaribbeanspecies.org. Последнее обращение: 09 марта 2020 г.

  91. Олден Д.Д., Пофф Н.Л.Р., Дуглас М.Р., Дуглас М.Е., Фауш К.Д. (2004) Экологические и эволюционные последствия биотической гомогенизации. Trends Ecol Evol 19:18–24

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  92. Олсон Л. (2006) Экономика наземных инвазивных видов: обзор литературы.Agric Resour Econ Rev 35:178–194

    Google ученый

  93. Пол Г.С., Явитт Дж.Б. (2011) Рост тропической лозы и влияние на сукцессию леса: обзор экологии и управления тропическими вьющимися растениями. Bot Rev 77:11–30

  94. Pejchar L, Mooney HA (2009) Инвазивные виды, экосистемные услуги и благополучие человека. Trends Ecol Evol 24:497–504

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  95. Пэн С., Кинлок Н.Л., Гуревич Дж., Пэн С. (2019) Корреляция богатства местных и экзотических видов: глобальный метаанализ не обнаруживает парадокса вторжения в разных масштабах.Экология 100:1–10

    Google ученый

  96. Pucko CA, Beckage B, Perkins TJ, Keeton WJ (2011) Изменения видов в ответ на изменение климата: индивидуальные или общие реакции? J Torrey Bot Soc 138: 156–176

    Google ученый

  97. Пишек П., Ричардсон Д.М., Пергл Дж., Ярошик В., Сикстова З., Вебер В. (2008) Географические и таксономические предубеждения в экологии вторжения. Trends Ecol Evol 23:237–244

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  98. Пышек П., Блэкберн Т.М., Гарсия-Берту Э., Перглова И., Рабич В. (2017) Вытеснение и местное исчезновение местных и эндемичных видов.In: Vilà M, Hulme PE (eds) Воздействие биологических вторжений на экосистемные услуги. Springer International Publishing, Чам, Швейцария, стр. 157–175

    . Google ученый

  99. Rauschert ESJ, Shea K (2017) Конкуренция между похожими инвазивными видами: моделирование инвазивного вмешательства в ландшафт. Поп-Экол 59:79–88

    Google ученый

  100. Reed HE, Seastedt TR, Blair JM (2005) Экологические последствия вторжения травы C4 на пастбища C4: дилемма управления.Приложение Ecol 15:1560–1569

    Google ученый

  101. Рохас-Сандовал Дж., Акерман Дж.Д. (2020) Биогеография местных и чужеродных видов растений на островах: контрастирующие факторы разнообразия на Малых Антильских островах. Диверс Дистриб 26:1539–1550

    Google ученый

  102. Rojer AC (1997) Биологическая инвентаризация Синт-Эстатиуса. Фонд Кармаби, Кюрасао, Нидерландские Антильские острова.

  103. Рубол М.Дж., Смит А.Л. (2004) Вулканология Сабы и Св.Эстатиус, Северные Малые Антильские острова. Королевская академия наук Нидерландов, Амстердам, Нидерланды.

  104. Сандерс Н.Дж., Готелли Н.Дж., Хеллер Н.Е., Гордон Д.М. (2003) Разрушение сообщества инвазивными видами. Proc Nat Acad Sci USA 100:2474–2477

    CAS пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  105. Санторо Р., Джакер Т., Карбони М., Акоста А.Т. (2012) Модели сборки растительных сообществ в захваченных и не захваченных сообществах вдоль естественного градиента окружающей среды.J Veg Sci 23: 483–494

    Google ученый

  106. Сантос М.Дж., Андерсон Л.В., Устин С.Л. (2011) Воздействие инвазивных видов на растительные сообщества: пример использования подводных водных растений в региональном масштабе. Биол Инв 13:443–457

    Google ученый

  107. Сакс Д.Ф., Гейнс С.Д. (2008) Вторжение и вымирание видов: будущее местного биоразнообразия на островах. Proc Nat Acad Sci USA 105:11490–11497

    CAS пабмед ПабМед Центральный Google ученый

  108. Schnitzer SA (2005) Механистическое объяснение глобальных закономерностей численности и распространения лиан.Am Nat 166: 262–276

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  109. Schnitzer SA, Bongers F (2011) Увеличение численности и биомассы лиан в тропических лесах: новые закономерности и предполагаемые механизмы. Ecol Lett 14:397–406

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  110. Seabloom EW et al (2013) Предсказание вторжения в пастбищные экосистемы: является ли доминирование экзотических растений настоящим препятствием для богатства? Glob Change Biol 19:3677–3687

    Google ученый

  111. Shackleton RT, Shackleton CM, Kull CA (2019) Роль инвазивных чужеродных видов в формировании местных средств к существованию и благосостояния человека: обзор.J Environ Manage 229:145–157

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  112. Simberloff D (2006) Инвазивный кризис 6 лет спустя: важное явление, неудачная метафора или и то, и другое? Ecol Lett 9:912–919

    Google ученый

  113. Simberloff D, Von Holle B (1999) Положительные взаимодействия неместных видов: инвазионное таяние? Биол Инв 1:21–32

    Google ученый

  114. Слоан С., Дженкинс К.Н., Джоппа Л.Н., Гаво Д.Л.А., Лоранс В.Ф. (2014) Оставшаяся естественная растительность в горячих точках глобального биоразнообразия.Биол Консерв 177:12–24

    Google ученый

  115. Stoffers AL (1956) Растительность Нидерландских Антильских островов. Uitgaven Natuurwetenschappenlijke Studiekring voor Suriname en de Nederlandse Antillen 15.

  116. Stone L, Roberts A (1990) Шахматная оценка и распределение видов. Экология 85:74–79

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  117. Стоц Г.К., Кэхилл Дж.Ф. мл., Беннетт Д.А., Карлайл К.Н., Борк Э.В., Аскаризаде Д., Барта С., Бейеркунляйн К., Болджив Б., Браун Л., Кабидо М., Кампетелла Г., Челли С., Коэн О., Диас С., Энрико Л., Энсинг Д., Эрдэнэцэцэг Б., Фиделис А., Гаррис Х.В., Генри ХЭЛ, Дженч А., Джури М.Х., Курем К., Мэннинг П., Митчелл Р., Мура М., Овербек Г.Е., Питер Дж., Рейнхарт К.О., Штернберг М., Тунгалаг Р. , Undrakhbold S, van Rooyen M, Wellstein C, Zobel M, Fraser LH (2020) Не плавильный котел: виды растений объединяются в неместном ареале.Global Ecol Biogeogr 29:482–490

    Google ученый

  118. Сурендра Б., Мухаммед А.А., Раджу С.Дж. (2013) Оценка инвазивных чужеродных видов растений в городской экосистеме: тематическое исследование из Университета Андхра, Вишакхапатнам, Индия. Int Res J Env Sci 2:79–86

    Google ученый

  119. Sweeney L (2018) Оценка воздействия A. leptopus на Сабу и Сент-Эстатиус. магистерская диссертация.Утрехтский университет, Утрехт, Нидерланды.

  120. Тиле Дж., Коллманн Дж., Маркуссен Б., Отте А. (2010) Новый взгляд на оценку воздействия: совершенствование теоретической основы управления инвазивными чужеродными видами. Биол Инв 12:2025–2035

    Google ученый

  121. Tordoni E, Petruzzellis F, Nardini A, Savi T, Bacaro G (2019) Проще говоря: чужеродные виды уменьшают функциональное разнообразие прибрежных растительных сообществ. J Veg Sci 30: 498–509

    Google ученый

  122. Травесет А., Ричардсон Д.М. (2006)Биологические инвазии как нарушители репродуктивного мутуализма растений.Trends Ecol Evol 21:208–216

    PubMed Google ученый

  123. Ульрих В. (2004) Совместное появление видов и нейтральные модели: переоценка. Правила сборки JM Diamond Oikos 107:603–609

    Google ученый

  124. Ульрих В., Готелли Н.Дж. (2010) Анализ нулевой модели ассоциаций видов с использованием данных о численности. Экология 91:3384–3397

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  125. Ульрих В., Готелли Н.Дж. (2013) Обнаружение закономерностей в анализе нулевой модели.Ойкос 122:2–18

    Google ученый

  126. Ульрих В., Жабо Ф., Готелли Н.Дж. (2017) Конкурентные взаимодействия изменяют характер совместного существования видов при нейтральном расселении. Ойкос 126:91–100

    Google ученый

  127. Ван Андел Т., Ван дер Хорн Б., Стеч М., Бантьес Аростеги С., Миллер Дж. (2016) Количественная оценка типов растительности на острове Сент-Эстатиус.Голландский Карибский бассейн Global Ecol Conserv 7:59–69

    Google ученый

  128. Вандебрук И., Пикинг Д., Льюис П.А., Оберли А., Айкен С., Митчелл С., Бум Б. (2018) Обзор Coralilla ( Antigonon leptopus ): инвазивное и популярное лекарство городского кустарника на Ямайке. Econ Bot 72: 229–245

    CAS Google ученый

  129. Van der Burg WJ, Freitas JA de, Debrot AO, Lotz LAP (2012) Натурализованные и инвазивные чужеродные виды растений в Карибском бассейне, Нидерланды: статус, распространение, угрозы, приоритеты и рекомендации.Альтерра, Вагенинген, Нидерланды.

  130. Ван Клейнен М., Вебер Э., Фишер М. (2010) Метаанализ различий в признаках между инвазивными и неинвазивными видами растений. Ecol Lett 13:235–245

    Google ученый

  131. Вич Дж. А. (2014) Парный подход к анализу совместного существования видов. Ж Биогеогр 41:1029–1035

    Google ученый

  132. Верон С., Дэвис Т.Дж., Кадотт М.В., Сьержо П., Павуан С. (2017) Предсказание утраты эволюционной истории: где мы? Biol Rev 92:271–291

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  133. Verwijmeren M, Rietkerk M, Bautista S, Mayor AG, Wassen MJ, Smit C (2014) Сочетание засухи и выпаса скота: контрастирующие сдвиги во взаимодействии растений на уровне пар видов и сообществ.J Засушливая среда 111:53–60

    Google ученый

  134. Вила М., Бартомеус И., Дитч А.С., Петаниду Т., Штефан-Девентер И., Стаут Дж.К., Чеулин Т. (2009) Интеграция инвазивных растений в местные сети растений-опылителей по всей Европе. Proc Roy Soc B 276:3887–3893

    Google ученый

  135. Вила М., Эспинар Дж.Л., Хейда М., Хулме П.Е., Ярошик В., Марон Дж.Л., Пергль Дж., Шаффнер У., Сунь Й., Пишек П. (2011) Экологическое воздействие инвазивных чужеродных растений: метаанализ их воздействия на виды, сообщества и экосистемы.Ecol Lett 14:702–708

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  136. Вила М., Тессье М., Суэхс К.М., Брунду Г., Карта Л., Галанидис А., Ламбдон П., Манка М., Медайл Ф., Морагес Э., Травесет А., Трумбис А.Ю., Хьюм П.Е. (2006) Местные и региональные оценки влияние растений-вселенцев на структуру растительности и свойства почв средиземноморских островов. Дж Биогеогр 33:853–861

    Google ученый

  137. Виллегер С., Мейсон Н.В., Муйо Д. (2008) Новые индексы многомерного функционального разнообразия для многогранной структуры функциональной экологии.Экология 89:2290–2301

    Google ученый

  138. Уоллер Д.М., Мудрак Э.Л., Аматанджело К.Л., Клионский С.М., Роджерс Д.А. (2016) Дают ли ассоциации между местными и инвазивными растениями сигналы об инвазивных воздействиях? Биол Вторжения 18:3465–3480

    Google ученый

  139. Ward EB, Pregitzer CC, Kuebbbing SE, Bradford MA (2020) Инвазивные лианы являются движущей силой и пассажирами изменения доступности питательных веществ в почве в городских лесах.Биол Инв 22:935–955

    Google ученый

  140. Уайт Э.М., Уилсон Дж.К., Кларк А.Р. (2006) Биотические косвенные эффекты: забытая концепция в биологии инвазии. Дайверс Дистриб 12:443–455

    Google ученый

  141. Zavaleta E, Pasari J, Moore J, Hernandez D, Suttle KB, Wilmers CC (2009) Реакция экосистемы на разрушение сообщества. Ann NY Acad Sci 1162:311–333

    PubMed ПабМед Центральный Google ученый

  142. Zhang G, Li J, Zhang Y, Zhou S (2017) Технология быстрого размножения Antigonon leptopus в тропических районах.Сельскохозяйственные биотехнологии 6:20–22

    Google ученый

  143. Сборка и разборка ядрышка в течение клеточного цикла

    Введение

    Эукариоты эволюционировали до «открытой» формы митоза, при которой сегрегация хромосом связана с разрушением и последующей повторной сборкой ядерной организации. Ядрышко уже более века служит моделью для описания процессов ядерной дезорганизации в начале митоза, передачи строительных блоков во время митоза и повторной сборки функциональных доменов в начале интерфазы.1 В настоящее время контроль над различными этапами сборки/разборки ядрышка у многоклеточных животных и сложность этих процессов постепенно расшифровываются. 47S рибосомные РНК (рРНК) транскрибируются, процессируются в 18S, 5,8S и 28S рРНК и собираются с 5S рРНК и соответствующими белками с образованием малых (18S РНК) и больших (5,8S, 28S и 5S РНК) субъединиц рибосом. .3 Ядрышко является фабрикой рибосом клетки и предлагается как «органелла, образованная в результате акта построения рибосомы». 4 В каждом ядре эукариот есть по крайней мере одно ядрышко, размер и организация которого напрямую связаны с производством рибосом. 5-7 В дополнение к продукции рибосом, ядрышко также является полифункциональным доменом, участвующим в реакции на стресс, в биогенезе рибонуклеопротеиновых частиц независимо от субъединиц рибосомы, а также в некоторых заболеваниях, включая рак, рибосомопатии или вирусные инфекции.8–11 В частности, ядрышко участвует в сборке сигнальной частицы (SRP)12,13, в модификации сплайсосомных малых РНК U2 и U614,15 и в сборке специфических мРНП.16

    Во время интерфазы различные этапы биогенеза рибосом ответственны за основную структуру и общую организацию ядрышка. Можно выделить три основных строительных блока: фибриллярные центры (FC), плотный фибриллярный компонент (DFC) и зернистый компонент (GC).Эти структуры отражают разделение механизмов, связанных с транскрипцией рДНК, процессингом рРНК и сборкой двух (40S и 60S) рибосомных субъединиц. DFC и поздняя обработка в GC. Следовательно, конкретные этапы образования рибосом могут быть идентифицированы по специфическим маркерам конкретного этапа и локализованы с помощью световой микроскопии во всем объеме клетки с преимуществом легкого доступа к трехмерной информации и возможности анализа динамики этих молекул в живых организмах. клетки.

    Во время клеточного цикла у высших эукариот продукция рибосом начинается в конце митоза, увеличивается во время G 1 , достигает максимума в G 2 18 и прекращается во время профазы.19 В конце митоза механизмы, необходимые для сборки ядрышки наследуются двумя дочерними клетками. В этом обзоре будет проанализирован недавний прогресс в отношении сроков и процессов, контролирующих сборку/разборку ядрышка во время митоза в клетках млекопитающих, и будут предложены некоторые прогнозы и перспективы.

    Разборка ядрышка в начале митоза

    Разборка ядрышка представляет собой последовательный процесс, начинающийся в начале митоза с упорядоченного высвобождения процессирующих ядрышковых комплексов с последующей репрессией транскрипции РНК-полимеразой I (pol I) ( рис. 1 ). Было подсчитано, что транскрипция pol I снижается примерно на 30% в течение ранней профазы и прекращается в поздней профазе. блоки будущих ядрышек хранятся и поддерживаются в разных местах во время митоза.

    Высвобождение ядрышковых процессинговых комплексов.

    В живых клетках диссоциация белков NPM/B23 из ядрышка происходит в конце профазы перед разрушением ядерной оболочки.23 В клетках PtK1 в ранней профазе форма ядрышка модифицируется высвобождением локализованных в GC и DFC. Эти белки распределяются в 3-D сети, в то время как хроматин конденсируется в хромосомы, формируя перихромосомный компартмент. 24 Этот перихромосомный компартмент наблюдается у многих позвоночных и растительных клеток, подтверждая гипотезу, что это общее поведение открытого митоза.25 Наиболее репрезентативные комплексы, идентифицированные в перихромосомном компартменте, соответствуют DFC, таким как фибрилларин в ассоциации с мякРНК U3, нуклеолином и Nopp140, а также белками GC, такими как NPM/B23, Bop1, Nop52, PM-Scl 100 и Ki67.1 ,26–29 Рибосомальные белки (r-белки), несколько мякРНК и различные части пре-рРНК, включая 45S рРНК, обнаруживаются в перихромосомном компартменте.1,30,31 Колокализация этих различных факторов в перихромосомном компартменте позволяет предположить, и поздние комплексы процессинга рРНК по крайней мере частично сохраняются во время митоза.Однако взаимодействие между белками одних и тех же комплексов не было обнаружено с помощью FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) во время анафазы, даже если вокруг хромосом наблюдалась трехмерная колокализация белков (фибрилларин, Bop1, Nop52 и NPM/B23).26 взаимодействия между этими белками были обнаружены во время сборки ядрышка, предполагая, что клеточный цикл регулирует взаимодействия комплекса процессинга рРНК (подробности см. в Сборке ядрышка ниже). В клетках с задержкой метафазы хромосомы могут быть выделены с все еще прикрепленными комплексами процессинга ядрышек.24 В живых клетках ядрышковые белки, помеченные GFP (белок зеленой флуоресценции), мигрируют вместе с хромосомами во время анафазы. 32 Эти скоординированные движения указывают на определенную степень ассоциации во время этого процесса. Как поддерживается связь между перихромосомным компартментом и хромосомами, в настоящее время неизвестно.

    Задержка транскрипции рДНК.

    Продукция 47S рРНК останавливается в конце профазы, в то время как аппарат транскрипции pol I остается связанным с рДНК в ЯОР (регионах ядрышкового организатора).Присутствие субъединиц pol I, а также комплекса SL1, TTF1 и UBF было продемонстрировано в митотических ЯОР, соответствующих рДНК, активно транскрибируемым в предыдущую интерфазу. конденсированные) волокна rDNA в NORs,19 и ДНК-связывающая способность UBF необходима для этой ассоциации.35 Перемещение факторов транскрипции между кластерами rDNA и цитоплазмой поддерживается на протяжении всего митоза и варьирует в разные периоды митоза.35 Кроме того, во время метафазы субъединицы pol I могут временно диссоциировать от ЯОР. 23,35 Таким образом, как дезорганизация ядрышек, так и остановка транскрипции рДНК происходят в профазе, но высвобождение комплексов процессинга ядрышек предшествует инактивации транскрипции ( Fig. 1 ). Благодаря недавнему прогрессу в измерении взаимодействий и активности in vivo, регуляция этих событий теперь может быть лучше понята (см. ниже).

    Контроль клеточного цикла разборки ядрышек.

    В начале и во время митоза некоторые pol I-специфические факторы транскрипции фосфорилируются киназой Cdk1-cyclin B; эти фосфорилирования необходимы для установления и поддержания подавления транскрипции рДНК.34,36,37 Точно так же фосфорилирование белков процессинга ядрышек модифицируется во время митоза.38 Белок NPM/B23, компонент прерибосомного рибонуклеопротеина ( RNP) комплексы 31,39 являются мишенью Cdk1-cyclin B kinase во время митоза. 40 Фосфорилирование NPM/B23 начинается в ранней профазе и реверсируется фосфатазами PP1 во время анафазы.40 Это фосфорилирование уменьшает РНК-связывающую аффинность NPM/B23 41 и может участвовать в высвобождении этого белка из ядрышка во время профазы. 40 Т.о., комплексы транскрипции рДНК и процессинга рРНК, по-видимому, репрессируются одним и тем же путем во время митоза. Однако в профазе следует рассматривать разные сроки, поскольку наиболее недавно синтезированные пре-рРНК накапливаются в виде частично процессированных 45S пре-рРНК, что указывает на то, что полная репрессия процессинга пре-рРНК происходит до полной репрессии транскрипции рДНК.30 Недавно Gavet и Pines 22 разработали биосенсор на основе FRET для измерения активации пути Cdk1-циклин B киназы в живых клетках HeLa, и они продемонстрировали, что разные уровни активности Cdk1-циклин B киназы запускают разные митотические события во время профазы. .22 В частности, эти авторы обнаружили, что разборка ядрышка требует высоких уровней активности Cdk1 перед разрушением ядерной оболочки. Заманчиво предположить, что разное время выключения ядрышкового процессинга и транскрипции рДНК связано с разными локальными концентрациями активности Cdk1-cyclin B.

    Динамика сборки ядрышка регулируется во времени и пространстве

    Сборка ядрышка — это раннее событие, начинающееся в телофазе, и сложный процесс, происходящий в течение относительно длительного периода клеточного цикла. В клетках HeLa в общей сложности 22 часа на один цикл полная сборка ядрышка занимает около 2 часов52, тогда как видимая разборка ядрышка требует 30 минут22. Сборка ядрышка зависит от координации между активацией транскрипции рДНК и рекрутированием и активацией процессинга РНК. комплексы.43 Кроме того, транслокация комплексов процессинга рРНК в места транскрипции рДНК связана с образованием очагов, называемых пренуклеолярными тельцами (PNB).44,45 Таким образом, строительство новых ядрышек в начале интерфазы включает активацию механизм транскрипции уже в ассоциации с генами рДНК, образование временных телец, PNB, в объеме ядра и транслокацию комплексов RNP из PNB в сайты транскрипции (рис.2 ).

    Активация транскрипции.

    Транскрипция Pol I впервые выявляется во время телофазы в клетках человека и поздней анафазы в клетках PtK1. Клетки HeLa33 или в 2 хромосомах, несущих NOR, в клетках PtK1.19 Уровень транскрипции напрямую связан с количеством факторов pol I, связанных с каждым NOR.33 На ранних стадиях G 1 в клетках HeLa слияние двух одно одиночное ядрышко наблюдается в живых клетках менее чем через 3 мин после их контакта.32 Такое поведение объясняет среднее количество 2-3 ядрышек в интерфазе по сравнению с 6 компетентными NORs, организующими зарождающееся ядрышко в ранних G 1 . Механизм этого слияния в настоящее время неизвестен. Недавно слияние ядрышек было приписано жидкоподобному поведению ядрышек в Xenopus laevis ооцитов. ооциты) в настоящее время остается открытым вопросом?

    Во время митоза транскрипция pol I подавляется активностью CDK1-циклин B киназы, а в конце митоза активация транскрипции pol I зависит от ингибирования этой активности.34,36,37 Ингибирование активности CDK1-циклин B киназы контролируется фосфатазами PP1 и PP2A.48 Прерывание ингибирования транскрипции рДНК является результатом равновесия между фосфорилированием/дефосфорилированием и локальным распределением этих прогрессии и приводит к положительной обратной связи Cdk1-индуцирующего митоза.49

    Рекрутирование процессинговых комплексов посредством образования PNB.

    Сигнатура сборки ядрышка основана на обнаруживаемом возобновлении транскрипции рДНК.Однако было показано, что активная транскрипция рДНК не обладает способностью к организации полноценного ядрышка. Сборка ядрышек также зависит от белков и мякРНК процессинговых комплексов, r-белков, а также 45S рРНК, продуцируемых во время профазы и присутствующих в перихромосомном компартменте. Во время сборки ядрышек эти комплексы процессинга ядрышек собираются в очаги, обозначенные как PNB (, рис. 2, ). При трехмерной покадровой визуализации, начиная с метафазы, первая обнаруживаемая концентрация процессирующих белков в PNB наблюдалась во время телофазы на поверхности хромосомы.32 PNB присутствуют в течение ранних периодов G 1 a и G 1 b, длящихся около 2 часов в клетках HeLa. 42 Их фиброзно-зернистая гетерогенная структура и их ассоциация с конденсированным хроматином были охарактеризованы с помощью электронной микроскопии. 27,32 В PNB, сформированных во время телофазы, белки раннего и позднего процессинга ядрышков, мякРНК, r-белки и непроцессированные 45S рРНК локализованы, и присутствует фосфатаза PP1γ. Во время анафазы и телофазы в цитоплазме также наблюдается образование очагов, обозначенных как очаги, происходящие из ядрышек (NDFs).53,54

    Колокализация белков в одной и той же структуре не указывает на то, взаимодействуют ли эти белки или нет. Поэтому, чтобы определить, когда и где происходят взаимодействия между процессинговыми белками одних и тех же комплексов, FRET был настроен для анализа динамики этих взаимодействий в живых клетках.55 Мы продемонстрировали, что взаимодействия между NPM/B23 и Nop52 обнаруживаются в ядрышках и также и в ПНБ.26 Интересно, что во время анафазы взаимодействия на периферии хромосом не обнаруживаются, тогда как они регистрируются примерно в 20% ПНБ в начале телофазы, в 40% в конце телофазы и в 55% в ранней G. 1 ядра.26 Пока еще не установлено, приводят ли эти взаимодействия к процессингу ITS2 (внутренний транскрибируемый спейсер 2) пре-рРНК, присутствующих в PNB. Однако присутствие фосфатазы PP1γ в PNB совместимо с обратимым митотическим фосфорилированием, вызывающим расщепление пре-рРНК.56

    Поток процессинговых белков между сайтами транскрипции рДНК и PNB измеряли в живых клетках в разные периоды сборки ядрышка с использованием фотоактивации (PA). ) ( Рис. 3 ).Принцип заключается в том, чтобы сделать ядрышковые меченные PAGFP белки флуоресцентными путем фотоактивации, чтобы пометить пул белков, а затем проследить кинетику и распределение этих молекул. в одном PNB, но в каждом случае это количество было слишком мало для анализа их трехмерного распределения. Интересно, что пул PAGFP-fibrillarin, активированный в одном зарождающемся ядрышке, мигрировал в другие активные NOR и не обнаруживался в PNB.42 Это иллюстрирует ассоциацию fibrillarin с ранними стадиями процессинга пре-рРНК, присутствующих в 6 зарождающихся ядрышках, и предполагает, что эти пре-рРНК отсутствуют или находятся в очень ограниченном количестве в PNBs. Прогрессирующее исключение фибрилларина из PNB в течение 20–30 мин указывает на то, что раннее расщепление процессинга может происходить в PNB. Напротив, белки позднего процессинга рРНК (Nop52 или NPM/B23) мигрируют из одного зарождающегося ядрышка в другие, а также в каждую PNB ( рис. 3 ).Обратная связь белков между ядрышками и PNB достигается через 2 ч после телофазы в нормальных условиях, и PNB больше не видны. Это является следствием увеличения количества сайтов связывания в зарождающихся ядрышках, когда завершается первая стадия сборки ядрышек. Напротив, персистенция PNB и трафик между PNB и зарождающимися ядрышками является признаком нарушения сборки ядрышек. после митоза зависит от трафика между PNB и зарождающимися ядрышками (рис.3 ). Следовательно, образование PNB является способом контроля и регуляции сборки ядрышек после митоза и может объяснить повсеместное образование PNB при открытом митозе.

    Перспективы и перспективы

    Ядрышко представляет собой модель координации между несколькими сетями, которые должны взаимодействовать для производства 40S и 60S рибосомных субъединиц. Эти сети отвечают за активацию транскрипции pol I в компетентных NOR для синтеза 47S рРНК, за рекрутирование комплексов процессинга на 47S рРНК и за сборку процессированных рРНК примерно с 80 r-белками.В настоящее время большинство исследований, анализирующих сборку/разборку ядрышка, были сосредоточены на активации/репрессии транскрипции и комплексов процессинга рРНК, в то время как роль r-белков не исследовалась. Однако заметно, что мутация одного из r-белков при анемии Diamond-Blackfan влияет на функцию белков в процессинге рРНК. 58 Вопрос о том, как r-белки участвуют в сборке ядрышек после митоза, остается открытым.

    Другим способом, который выиграет от более тщательного исследования, является координация между сборкой ядрышек и другими ядерными доменами, в частности тельцами Кахаля, в которых собираются комплексы snoRNP.Нет сомнений в том, что биогенез рибосом зависит от комплексов мякРНП, в частности от мякРНП U3, ответственного за фолдинг пре-рРНК, необходимых для сборки малой рибосомной субъединицы. и поздние стадии биогенеза рибосом, которые делают возможным образование GC. 42 В какой степени кинетика сборки ядрышка зависит от функции тельца Кахаля, в настоящее время остается открытым вопросом.

    После митоза прогрессивное привлечение процессирующих белков в ядрышки регулируется динамикой обменов между PNB и зарождающимися ядрышками.42 Это наблюдение подтверждает гипотезу, что комплексы процессинга ядрышек локализуются в этих 2 сайтах путем связывания с pre-rRNAs. Какова судьба пре-рРНК, присутствующих в PNB, в настоящее время неясно. Эти пре-рРНК могут процессироваться в PNB, экспортироваться в цитоплазму в виде субъединиц рибосом, рекрутироваться в новые ядрышки или деградировать. Во время эмбриогенеза Xenopus PNB формировались после митоза в отсутствие транскрипции pol I. 60 В этих ядрах пре-рРНК и ядрышковые белки из PNB локализовались вокруг рДНК до обнаружения комплекса pol I.52 Т.о., перегруппировка PNBs вокруг рДНК может происходить в отсутствие транскрипции pol I во время эмбриогенеза Xenopus. В клетках HeLa, в которых транскрипция pol I ингибируется лекарственными препаратами во время перехода митоза/интерфазы, вокруг рДНК наблюдаются процессирующие белки и пре-рРНК. ядрышковые комплексы во время сборки ядрышек и может объяснить, что эти транзиторные тельца повсеместно присутствуют в открытом митозе.Почему этот шаг сохранился на протяжении всей эволюции, еще предстоит установить.

    До сих пор рациональным было исследовать сборку ядрышка только с точки зрения биогенеза рибосом, даже несмотря на то, что ядрышко является полифункциональным доменом;11 скорее всего, другими игроками, участвующими в сборке ядрышка, пренебрегали. Согласно анализу нуклеолярного протеома, рибосомные механизмы должны соответствовать ≈40% всех ядрышковых белков,61 а геномика предсказывает, что 4% генов связаны с ядрышками.62,63 Во время инициации транскрипции во время построения DFC вокруг FC наблюдения ЭМ показали, что зарождающиеся ядрышки находятся в контакте с ядерной оболочкой в ​​клетках человека64, и контакт ядрышка с ядерной оболочкой сохраняется на всем протяжении interphase во многих типах клеток.

    admin

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован.